细胞移植物的制备的制作方法

专利名称：细胞移植物的制备的制作方法
技术领域：
本发明关于一种供制备“异体细胞-制备-组织工程”移植物的方法及通过该方法所制备的产物。
背景技术：
间叶干细胞(MSCs)，亦称为多能性基质细胞，此类细胞已知可自我再生并分化成各种不同的间叶及非间叶组织，并且于临床应用上已成为前景可期的工具，例如成骨不全症的细胞疗法(Horwitz et al., Nat Med5，309-313，1999);软骨及骨骼的组织工程(Caplan, Tissue Engll，1198-1211，2005);以及预防有害的心脏重塑及改善恢复率的心脏疗法(Pittenger and Martin, Circ Res95,9-20, 2004)。使用源自单一健康的供给细胞的MSCs所制备的“现成”产品，在患有移植物对抗宿主疾病及克隆氏症的病患中，已在两个第III期研究中证实了其安全性(http://www.clinicaltrails.gov/)。再者,对于急性心肌梗塞病患施予异体MSCs也被报导可改善射出率(EFs) (Hare JM, et al.，JAm Coll Cardiol.54 (24):2277_2286，2009)。因此，在治疗患有心血管疾病的病患时，源自健康供给者的异体MSCs，可作为一“广用的供给细胞”。人类、狒狒、及鼠类的MSCs的免疫抑制特性也在活体外及活体内被报导，其中对于具免疫力的狒狒，将异体MSCs应用于延长皮肤异体移植物的存活率(Bartholomew et al., ExpHematol.30 (I):42_48，2002)，以及对于人类应用于减缓移植物对抗宿主疾病(Le Blancet al., Lancet.363 (9419):1439_1441，2004)。然而，许多研究证实 MSCs 本质上并非免疫豁免的，且于具免疫力的MHC不匹配的接受者会对于异体MSCs产生排斥反应(Nauta etal，Bloodl08 (6):2114-2120,2006 ；Spaggiari et al.,Blood.107 (4):1484-1490，2006 ;Eliopoulos et al.，Bloodl06 (13):4057_4065，2005)。因此，使用 MSCs 进行异体移植仍充满争议性。

将MSCs于低氧环境下培养，称作低氧MSCs。相较于培养于正常氧环境下(约为20-21%02)的MSCs(称作正常氧的MSCs)，低氧MSCs会分泌更多的血管新生细胞激素及生长因子(Hung et al.,Stem Cells25(9):2363_2370，2007)，并且该源自低氧 MSCs 的条件培养基可被用于刺激伤口的治愈(Yew et al., Cell Transplant.,011)及骨折的治愈(Wangetal., J Tissue Eng Regen Med.,2011)。此外,Savant-Bhonsale及Smita揭露一种以低氧环境(介于约2.5%至约5%的氧气(O2))促进神经干细胞(NSCs)生长的方法及组合物，该低氧环境较传统细胞培养技术培养环境的含氧量低(US20070264712A1)。据Hung等人报导，MSCs于含0.05%至15%02的低密度及低氧环境下培养(较佳介于约1%至约7%的氧气)，在此被称为低氧及低密度的MSCs(10至4000MSCs/cm2)。相较于正常氧的MSCs，低氧及低密度的MSCs可降低复制性衰老、增加增生率及分化潜能(US20110129918A1)。再者，当将该低氧MSCs移植入免疫缺陷小鼠的颅盖缺陷处，该等低氧MSCs可促进缺陷的修复。经移植后，低氧及低密度MSCs也可促进细胞的迁移及移植至远程(Hung et al.,PLoS One.25):e416, 2007)。然而，对于如何解决排斥的问题仍尚未被提及。

发明内容
本发明关于一种通过将细胞培养于低氧或缺氧环境下降低异体细胞的排斥反应的新颖方法。在一方面，本发明提供一种适合移植至个体的细胞移植物，其为包含具有NK配体表达量减少的非天然生成的细胞。另一方面，本发明提供一种制备当移植至个体时引发低排斥反应或不引发排斥反应的细胞移植物的方法，其包含将至少一种自捐赠者分离的细胞培养于介于0%至约7%氧气的低氧环境下。于本发明一优选具体实施例中，该低氧环境介于0%至约2.5%的氧气。在本发明的一实施例中，该低氧环境为约1%的氧气。另一方面，本发明也提供一种通过上述方法所制备的细胞移植物。根据本发明，所得细胞移植物仍保留早期干细胞特性、维持正常的核型、且经移植后不会形成肿瘤。


阅读本发明时参考所附附图以及具体实施方式
将可更加了解前述的内容。在附图中所呈现的具体实施例为优选的示例，仅供说明本发明的目的。应该理解的是，本发明不受所述的具体实施例所局限。附图:图1A-图1C提供正常氧(Nor)及低氧(Hyp)间叶干细胞(MSCs)的特性，其中源自B6(图1A)及Balb/c (图1B)的MSCs以表面标记物的表达现象特征化；及(图1C)显示源自两种老鼠品系的MSCs对于成骨性细胞系的诱导(21天)、脂肪形成细胞系的诱导(21天)及软骨细胞系的诱导(21天)的分化能力，该分析是分别以茜素红S、油红O、及爱尔新蓝染色法分析(比例尺=50 μ m)。茜素红S、油红O、及爱尔新蓝染色的定量分析分别于550nm、510nm波长以光学密度测量及阳性区域测量。图2A-图2B提供在异体的及自体的移植中，低氧MSCs对于改善肢干缺血的效用，其中将带有左侧股动脉阻断的Balb/c小鼠以1.m.注射方式，在股薄肌中无注入(无细胞)或注入1父106正常氧8610^ (Nor B6 ;异体的)、低氧B6MSCs (Hyp B6 ;异体的)、正常氧Balb/c MSCs (Nor Balb/c ;自体的)、低氧 Balb/c MSCs (Hyp Balb/c ;自体的)、或 Balb/c小鼠胚胎的纤维母细胞(MEF Balb/c)。图2A摘要在第28天所述动物的肢干状况；以及图2B显示不同时间周期的血液灌流指针(**p〈0.0lvs.No cell, ##p<0.0lvs.Nor B6)。图3A-图3C提供低氧MSCs对于减少肌肉退化及纤维化，以及增加缺血肢干的血液灌流量的功效，其中图3A显示，通过HE染色所测量的肌肉损失区域的定量分析；图3B显示，通过梅生三色染色的肌肉纤维化区域的定量测量；以及图3C显示，以抗⑶31抗体进行的免疫组织化学法，测量第28天缺血性肢干样本的⑶31+微管密度的定量分析(*p〈0.05及**p〈0.0lvs.No cell, #p<0.0 5 及 ##p<0.0lvs.Nor B6)。图4A-图4D显示经移植后的28天，低氧MSCs存活情形，其中将带有左侧股动脉阻断的Balb/c小鼠以1.m.注射方式,在股薄肌中无注入(Nocell)或注入IX IO6与BrdU结合的正常氧B6MSCs (Nor B6 ;异体的)、低氧B6MSCs (Hyp B6 ;异体的)、正常氧Balb/c MSCs(Nor Balb/c)、或低氧Balb/c MSCs (Hyp Balb/c ;自体的)；在28天后米收缺血性肢干的样本，其中图4A显示使用抗BrdU抗体的免疫荧光染色；以及图4B-4D分别显示使用抗BrdU及⑶31 (图4B)、α-平滑肌肌动蛋白(图4C)、及肌间线蛋白(desmin)(图4D)的双重免疫荧光染色。图5A-图5F显示低氧MSCs降低供NK活化及NK所媒介的裂解的配体表达，其中图5A显示以抗NKp46抗体分析第28天(左图)及以抗DX5抗体分析第7天缺血性肢干样本(右图)的免疫荧光染色的统计结果，其中该缺血性肢干样本是源自将小鼠注入106B6正常氧 MSCs (Nor B6)、B6 低氧(Hyp B6)、Balb/c 正常氧 MSCs (Nor Balb/c)、或 Balb/c 低氧MSCs (Hyp Balb/c) (**p<0.0lvs.Nor B6);图 5B 显示以抗 CD4、CD8、CD14、CD86、或 TCR α β抗体分析第7天缺血性肢干样本的免疫荧光染色的统计结果，其中该缺血性肢干样本是源自将小鼠注入106Β6正常氧MSCs (Nor Β6)、Β6低氧(Hyp Β6)、Balb/c正常氧MSCs (NorBalb/c)、或 Balb/c 低氧 MSCs (Hyp Balb/c) (**p<0.0lvs.Nor B6);图 5C 显示肢干状况(上图)及所指时间周期的血液灌流比率(下图)，其中带有阻断的左侧股动脉的Balb/c小鼠，在第28天经以106B6正常氧MSCs及左图所指的抗体一同注入小鼠中，以及带有阻断的左侧股动脉的B6小鼠，于第28天经以106Balb/c正常氧MSCs及右图所指的抗体一同注入小鼠中；图5D显示于所指细胞中H60c相对于GAPDH (1(T4)、nectin-2相对于GAPDH (1(Γ4)、Pvr相对于GAPDH (1(Γ3)、及Rael相对于GAPDH (1(Γ4)的mRNA量的定量RT-PCR分析结果(**p<0.0lvs.Nor B6, ##p<0.0lvs.Nor Balb/c);以及图 5E 显示于 B6 及 Balb/c MSCs 中H60c、nectin-2、Pvr、及Rael的mRNA量的定量RT-PCR分析结果，其中该等细胞是以IO4/cm2密度培养并接触低氧环境(1%02) 48小时(#ρ〈0.0lvs.0h);以及图5F显示经共同培养4小时后，NK细胞对于不同E:T比率的MSCs的细胞毒性活性，其中在将NK细胞与MSCs共同培养前，先将NK细胞扩增5天且未·与(左图)或与(右图)IL-2处理。图6A-图6F显示正常氧的B6MSCs及抗NK配体抗体的抗体中和反应，以抑制NK媒介的裂解及改善其增强血液灌流的效果，以及恢复缺血性肢干的肌肉结构，其中图6A显示NK细胞的细胞毒性活性，其中先将其与IL-2培养扩增5天，再与不同E:T比率的MSCs —同培养4小时；图6B及6C显示将带有左侧股动脉阻断的Balb/c小鼠，以1.m.注射方式，注入106B6正常氧的MSCs，该MSCs先与同型抗体或抗所指配体的抗体进行前处理30分钟；其中图6B提供于所指时间周期的血液灌流指针，以及图6C提供通过H.E.及梅生三色染色的肌肉损失区域及肌肉纤维化区域的定量测量结果；图6D-6F提供以抗NKp46 (D)、H2Kb
(E)抗体的免疫荧光的统计结果、及抗H2Kb及⑶31、H2Kb及a-SMA或H2Kb及肌间线蛋白
(F)的双重免疫荧光的统计结果(所示为经免疫染色的细胞密度，*p〈0.05广p〈0.0lvs.同型IgG)。图7A-图7C显示人类MSCs培养于低氧环境下时，会降低人类NK配体的表达现象。在本发明中，将人类MSCs以5X103MSCs/cm2密度种入，并将一半的细胞分别于正常氧环境或暴露在低氧环境下(1%02)连续培养48小时。以定量RT-PCR分析两个NK配体(PVR及 ULBP3)的 mRNA 量(**p〈0.0lvs.同型 Nor)。图8A-E显示相较于正常氧(Nor)MSCs，缺氧及低氧MSCs (0%、1%、2.5%、7%氧环境)于异体接受小鼠中会降低NK累积现象，其中图8A显示H60c相较于GAPDH(1(T4)的相对表达现象；图8B显示nectin-2相较于GAPDH (10_4)的相对表达现象；图8C显示Pvr相较于GAPDH (10_3)的相对表达现象；图8D显示PVR相较于GAPDH (10_2)的相对表达现象；及图8E 显示 ULBP3 相较于 GAPDH(1(Γ3)的相对表达现象(*ρ〈0.05，**p<0.0lvs.Nor B6)。
具体实施例方式除非另有定义，在说明书中所使用的所有技术性及科学性术语，对于本技术领域技术人员具有相同意义。除非文中有清楚指出，否则本文中所使用的“一”;“该”单数形式包含复数形式。因此，例如当提及“一样本”时，对于所属领域技术人员可推知包含复数个该等样本及其同等物。本发明所使用的“间叶干细胞”或“MSCs”乙词，也可称作“多能性基质细胞”或“多能性干细胞”，是指该等干细胞可分化成各种不同的细胞类型，包含间叶组织的细胞及非间叶组织的细胞，像是成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(软骨细胞)、及脂肪细胞(脂肪细胞)。该间叶干细胞或MSCs可衍生自骨髓、或其它非骨髓组织，像是脐带血、脂肪组织、成体的肌肉、脐带或羊膜、脱落的婴儿牙齿的牙髓等。在本发明中，该MSCs源自哺乳动物，优选为分离自人类。本文所使用的“低氧” 一词是指一种低氧环境，其氧气量低于周遭氧气环境或低于传统用于细胞培养技术的氧气环境(约20%-21%氧气)。在本发明的一具体实施例中，该“低氧环境”是低于7%氧气，优选介于0%至约7%氧气，更优选介于0%至约2.5%氧气，以及进一步优选约为1%氧气。此外，本文所使用的“缺氧”一词是指一种完全将氧气排除(0%02)的含氧环境系，其为一种低氧环境或少氧环境的极端环境。

本发明所使用的“正常氧”一词是指周遭氧气环境约为20%_21%氧气，其传统上常用于细胞培养技术中。本发明所使用的“个体” 一词是指人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包含但不限于灵长类、有蹄类、犬类及猫类。本发明意外地发现相较于培养于正常氧环境下(例如介于20%至20%)的MSCs，培养于低氧环境下的MSCs能表达相对较低的NK配体。更意外的是，此种细胞成功地在小鼠模式中修复了肢干缺血症且未引发移植的排斥反应，其对于使用异体细胞于细胞或移植的治疗方法所引起的长久以来的问题提供了一种具有潜力的解决方案。因此，本发明提供一种适合移植至个体的细胞移植物，其为包含具有NK配体表达量减少的非天然生成的细胞。此处所提供的细胞移植物移植至个体时可产生低排斥反应或不产生排斥反应。“自然杀手细胞”或“NK细胞”为一种对于先天免疫系统十分重要的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞的角色类似于脊椎动物中后天免疫反应的细胞毒性T细胞。NK细胞对于病毒感染的细胞提供快速反应，且对于肿瘤形成也有反应。免疫细胞典型地会侦测受感染细表面所呈现的MHC，并引起细胞激素的释放以造成细胞裂解或细胞凋亡。NK细胞则有别于典型的免疫细胞，因其具有在无抗体或MHC存在下辨识受压细胞的能力，而能提供较为快速的免疫反应。本文所使用的“NK配体” 一词是指任何可与NK激活受体交互作用的分子或物质，且其一旦交互作用，即可引发细胞毒性及淋巴激因子的释放。根据本发明，NK激活受体的例子为DNAMl及NKG2D。可与该受体交互作用并用于本发明的NK配体包括，但不限于，H60c、nectin-2PVR、ULBP3、其类似物及其组合。H60c是一种具有二个细胞外区域的MHC I类分子，且其为NKG2D受体的配体。Nectin-2或PVRL2 (脊髓灰质炎病毒受体相关分子_2)，又称为⑶112 (分化群112)，是一种具有两个Ig类C2型区域及一个Ig类V型区域的第I型单次跨膜醣蛋白。该蛋白为黏合连接(adherens junctions)的一种细胞膜成分。该蛋白也作为某些突变株的疱疹病毒和伪狂犬病毒的入口，且参与此类病毒在细胞间的传播。PVR (或小鼠的Pvr)，又称为⑶155 (分化群155)，是一种在免疫球蛋白超家族的人类第I型跨膜醣蛋白。由于其在灵长类中，参与细胞的脊髓灰质炎病毒的感染，故常称为脊髓灰质炎病毒受体(Poliovirus Rec印tor，PVR)。CD155正常的细胞功能是在上皮细胞间建立细胞间的黏合连接。ULBP3,又称为NKG2D配体3 (相对于NK细胞激活受体NKG2D)，是一种在人类中受压力而引发的配体。根据本发明，“表达量减少”用于NK配体的表达时将包含下列情况:非天然生成的细胞所表达的标记(NK配体)少于天然生成的细胞或于传统培养技术下培养的细胞所表达者。举例而言，“表达量减少”可能指人体内一细胞或培养于正常环境下的细胞的表达量的80%,较佳为60%，还要更佳为50%，甚至更佳为20%。应可理解的是，该标记的表达可由任何本发明所属技术领域中具有通常技艺者所知的任一技术而抑制。举例而言，该表达可通过基因干扰或删除而抑制或消除。在本发明的一具体实施例中，细胞被培养于低氧环境下(例如，介于0%至约7%氧气)并于细胞密度达到一半或全满时回复，使得其与正常氧量环境下(例如，含有20%至21%氧气)培养的细胞相较，NK配体的表达量减少。在本发明优选的具体实施例中，该低氧环境为1%02。本发明中不可预 期地发现MSCs在任何密度下，无论是高密度或低密度皆可用于本发明的方法，此点与公开于US20110129918A1发明中所述的具可专利的特征在于低密度10至4000MSCs/cm2不同。本发明的一实例中采用50细胞/cm2密度。于另一实例中采用5X IO3 至 104 细胞/cm2。本发明的实例中证实，相较于异体正常氧的MSCs，异体低氧MSCs可改善在弱化的肢干缺血的治疗效果，以及该效果与自体低氧MSCs效果相似。根据本发明的异体低氧MSCs于具免疫力的接受小鼠中，可透过抑制NK配体的表达，像是在NK细胞上与DNAMl及NKG2D有关的配体，以及降低NK补充的诱发及细胞毒性而增加移植能力。该细胞成长为CD31+的内皮细胞及a SMA+及desmin+肌肉细胞，因而促进血管新生及抑制肌肉纤维化，此意指本发明的低氧MSCs为本质上免疫豁免的,且可作为“广用的供给细胞”用于治疗心血管疾病。与造血干细胞(HSCs)或其它骨髓移植物相似，已知MSCs于异体接受者体内也会被NK所媒介的裂解反应所排斥；然而，本发明的低氧MSCs(其通过将MSCs培养于低氧环境中而得)可降低NK配体的表达，以及抑制NK细胞的补充及细胞毒性，因而可增强存活的能力以及增强移植入异体接受者的组织中的能力。在本发明中，用于细胞疗法的本发明的异体低氧MSCs已在具免疫力动物模式中测试过(可作为临床前研究)，结果显示该异体低氧MSCs的治疗潜力及免疫优点，像是用于治疗严重的缺血性疾病。结果显示本发明异体的缺氧MSCs仍保留早期干细胞特性，维持正常的核型，且经移植后将不会形成肿瘤。因此，根据本发明将MSCs培养于低氧环境中，可用于异体移植。因此，另一方面，本发明提供一种制备当移植至个体时引发低排斥反应或不引发排斥反应的细胞移植物的方法，其包含将至少一种自捐赠者分离的细胞培养于介于0%至15%氧气的低氧环境中，优选为介于0%至约7%氧气,进一步优选为介于0%至约2.5%氧气。在本发明的一实例中，该低氧环境约为1%氧气。可理解的是，根据本发明用于细胞移植物的至少一种细胞可依据目标移植位置而决定。适合用于本发明的细胞包含，例如，各种可自我更新及分化的干细胞。本发明的一优选具体实施例是使用间质干细胞(MSC)。根据本发明，至少基于下述的理由，低氧MSCs可作为其中一种用于治疗性血管新生的细胞来源，以治疗缺血性疾病:(I)相较于成体骨髓或周边血液的内皮前驱细胞的有限数量，本发明的细胞可提供无限量的具功能的内皮及肌肉细胞以用于临床应用中。再者，该内皮细胞或前驱细胞通常具有有限的增生能力，因此，要增殖至足以进行移植的细胞数量仍是一难题；相反的，本发明的低氧MSCs具有可延伸的自我再生活性，且可无限制地增殖。(2)相较于正常氧的MSCs，本发明的低氧MSCs于活体内显示低免疫原性，且对于免疫排斥反应的感受性较低。因此，本发明的低氧MSCs及其衍生物适于异体移植。目前试验证实于低氧环境增殖的MSCs可降低NK配体的表达现象，以及抑制NK细胞的补充及细胞毒性，因而促进存活能力及增强移植入异体接受者的组织中的能力。本发明还进一步提供通过上述方法所制备的细胞移植物。实例材料及方法 MSC单离、特征及培养MSCs是取自两近交品系的小鼠:C57BL/6J(B6)及Balb/c。以颈椎脱臼法牺牲4-6周龄的公鼠。将股骨及胫骨移除，将所有结缔组织清除干净，并将其置于5mL添加有I X青霉素/链霉素的a-MEM中，并置于冰上。将所有的胫骨及股骨末端处剪断以暴露出骨髓，将其插入准备好的离心管，并于400g离心I分钟以收集骨髓。将沉淀物于3mL完全培养基(CM:添加16.6%胎牛血清(FBS)的a-MEM、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素)中重新悬浮，并以21号注射针，透过70-μ m的尼龙筛网进行过滤。将源自每一长骨的细胞置于IOcm培养皿中内含40mL CM。经24小时后，以磷酸缓冲生理食盐水(PBS)移除无贴附的细胞，再加入IOmL的新鲜CM。经约2周培养后，附着细胞达到接近长满状况(第O代)，并以PBS清洗，接着以4mT,的0.25%膜蛋白酶/ImM乙二胺四乙酸(EDTA ；Invitrogen, Carlsbad, CA)于37° C作用2分钟来分离细胞。接着将细胞以50cellS/cm2密度种入CM中进行增殖，并每10天进行继代一次(第I至4代)。用于本研究的细胞为第2至4代。进行低氧培养时，将细胞培养于混合气体中，该混合气体是由94%凡、5%0)2及1%02所组成。为了维持低氧的混合气体，使用带有2个空气传感器的培养箱，一个测量CO2以及另一个测量O2 ;使用氮气(N2)输送系统以达到及维持氧气浓度，该氮气是由一液体的氮气桶或含有纯氮气的桶生成。若氧气百分比升至高于所需要的程度，则氮气会自动地注入系统中以替换掉过多的氧气。MSCs 的特征
为了分析细胞表面的典型的标记蛋白表达现象，以含有5mM EDTA的PBS收获MSCs。将细胞与FITC共轭结合的抗鼠Sca-1、CDllb、CD31、CD34及CD45、与PE共轭结合的抗鼠CD29、CD44、及CD105作用。匹配的同型抗体作为控制组(Becton Dickinson, SanJose, CA)。准备10，000个被标记的细胞，以及使用FACScan流式细胞仪，及使用CellQuest软件(Becton Dickinson)分析。为了进行活体外的成骨细胞分化及脂肪细胞分化,将细胞以104/cm2密度种入，并以成骨细胞诱导培养基(0頂由添加10%FBS (Gibco)的a-MEM(Gibco, Carlsbad, CA)、ICT8M 地塞米松(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)、IOmM β -憐酸甘油(Sigma-Aldrich)及50 μ M抗坏血酯_2_磷酸盐(Sigma-Aldrich)所组成),及脂肪细胞诱导培养基(AM由添加10%FBS的a -MEM、1(Γ7Μ地塞米松、50 μ M引朵美洒辛(Sigma-Aldrich)、0.45mM3-异丁基-1-甲基-黄嘿呤(Sigma-Aldrich)及 10 μ g/mL 膜岛素(Sigma-Aldrich)所组成)分别进行诱导3周。待分化的型态特征出现后，将以OIM及AIM处理的细胞，分别以茜素红S (ARS)及油红O染色。为了将分化进行量化，分别将ARS及油红O染剂萃取以进行于0D550nm及510nm的光学测量。为了进行活体外的软骨细胞分化，将2.5X IO5细胞沉淀收集，并于软骨细胞诱导培养基(CM由添加10_7M地塞米松的无血清a-MEM、l%(vol/vol)ITS、50 μ M抗坏血酯_2_磷酸盐、ImM丙酮酸钠、40 μ g/mL (wt/vol)脯氨酸及10ng/mL(wt/vol) TGF-β I (R&D systems, Minneapolis, MN)所组成)中连续培养 3 周。将以 CIM诱导的细胞进行爱尔新蓝染色。缺血性肢干模式

动物研究计划经阳明大学的动物中心委员会审阅及同意。在本试验中使用6周龄的Balb/c公鼠。使用麻醉剂(xylazine)及麻醉剂(ketamine)进行常规的麻醉,从膝盖朝向大腿内侧造成一皮肤切口，接着将皮下脂肪组织移除以显现其下位于靠近腹股沟近端的股动脉。接着将股动脉于股中段进行双重打结，并摘除长度5_的股动脉。经切除后立即将在100 μ LPBS中的IO6培养增殖后的MSCs注入(1.m.)后肢的股薄肌中。肢干灌流的评估遂进行如先前研究所述的激光多普勒成像分析(Choi et al.,J Biol Chem.2004 ；279 (47)，49430-49438)。使用激光多普勒灌流成像(MoorInstruments, Devon, UK)以进行一连串非侵入性的新血管形成的生理评估。小鼠于治疗后第0、3、7、14、21、及28天，通过一连串扫描以监测后肢的表面血流。分析该数字彩色编码的影像以量化从膝关节至脚指间区域的血流量，计算平均灌流值。免疫组织化学法及免疫荧光法为了进行免疫组织化学法，将石蜡包埋的切片进行脱蜡，复水及通过将切片置于Declere作用溶液(Cell Marque, Austin, TX)中，并置于微波炉中20分钟，以使抗原复性。以3%过氧化氢阻断内生性过氧化酶活性。以PBS清洗以移除残留的酵素活性，并以 UltraV Block (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA)作用 5 分钟将非专一性染色阻断。接着将切片以一级抗体(抗⑶31, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,CA)于4° C进行隔夜反应，以PBS大量冲洗，再以相对应的生物素化的二级抗体(VectorLaboratories,Burlingame,CA)在室温反应15分钟,接着以卵白素-过氧化酶(LSAB Kit ；Dako, Carpinteria, CA)处理,接着进行二氨基联苯胺染色。以Mayer’s苏木素进行对比染色。为了进行免疫荧光法，将切片以4%三聚甲醛固定，并以一级抗体进行反应，再以含有0.l%Triton X-1OO的PBS大量冲洗，再以相对应的DyLightTM488或DyLightTM594共轭结合的二级抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)作用，接着以DAPI进行对比染色。使用荧光显微镜观察免疫荧光。定量RT-PCR使用TRIzol作用剂(Invitrogen)单离细胞的总RNA，并将2μ g的总RNA在20 μ L溶液中进行反转录，其中使用了 3 μ g的随机引子及200U的Superscript IIIRT (Invitrogen)0于总体积为25 μ L溶液中进行增幅反应，该溶液中含有0.5 μ M的引子、12.5μ 的 LightCycler - FastStart DNAMaster SYBR green I (RocheIndianapolis, IN)及 10 μ L1:20 稀释的 cDNA。以 LightCycler480 实时 PCR 系统进行 PCR反应。使用LightCycIer480软件版本1.5.0 (Roche)进行每个mRNA表达现象的量化，并经常态性基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)正规化。引子对的序列列于表I中。表1.用于定量PCR的引子对
权利要求
1.一种适合移植至个体的细胞移植物，其特征在于，包含具有NK配体表达量减少的非天然生成的细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞移植物，其特征在于，当所述细胞移植物移植至个体时可引发低排斥反应或不引发排斥反应。
3.根据权利要求1所述的细胞移植物，其特征在于，所述NK配体是选自由H60c、nectin-2、PVR、ULBP3、其类似物及其组合所组成的群组中的一个。
4.根据权利要求1所述的细胞移植物，其特征在于，所述的细胞是培养于介于0%至7%氧气的低氧环境下。
5.根据权利要求4所述的细胞移植物，其特征在于，所述低氧环境介于0%至2.5%。
6.根据权利要求5所述的细胞移植物，其特征在于，所述低氧环境为1%。
7.根据权利要求1所述的细胞移植物，其特征在于，所述异体细胞移植物。
8.根据权利要求1所述的细胞移植物，其特征在于，所述的细胞为间质干细胞(MSC)。
9.根据权利要求8所述的细胞移植物，其特征在于，所述的细胞保留早期干细胞特性、维持正常的核型、且于移植后不会形成肿瘤。
10.一种制备当移植至个体时引发低排斥反应或不引发排斥反应的细胞移植物的方法，其特征在于，包含将至少一种自捐赠者分离的细胞培养于介于0%至约7%氧气的低氧环境下。
11.根据权利 要求10所述的方法，其特征在于，所述的细胞移植物为异体细胞移植物。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的至少一种细胞为MSC。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述低氧环境介于0%至约2.5%氧气。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述低氧环境为约1%氧气。
15.—种通过权利要求10-14中任一项所述的方法所制备的细胞移植物。
全文摘要
本发明关于一种适合供移植或细胞治疗的细胞移植物及其供治疗疾病的用途。具体而言，此处所提供的移植物能克服当移植至一病患时所伴随的排斥反应，其对于使用异体细胞的情况由于有益。本发明还进一步提供一种通过在低氧或无氧环境下培养至少一种细胞而制备所述移植物的方法。
文档编号C12N5/0775GK103194426SQ20121059180
公开日2013年7月10日 申请日期2012年12月29日 优先权日2012年1月5日
发明者洪士杰, 姚道礼, 黄纬华 申请人:台北荣民总医院