专利名称：基于纳米颗粒和滚环扩增的核酸定性检测方法
技术领域：
本发明属于核酸分子检测领域，具体涉及利用在二氧化硅纳米颗粒表面进行滚环扩增前后颗粒的聚集形态变化，快速、简易地实现核酸分子定性检测的方法。
背景技术：
滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互补)，在特殊的DNA聚合酶(phi 29DNA聚合酶)催化下将dNTPs转变成单链DNA。其线性扩增倍数为105，指数化扩增能力大于109，实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分 子，在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。比如Juan Hu等人(Juan Hu, Chun-yangZhang ；Sensitive detection of nucleic acids with rolling circleamplification andsurface-enhanced raman scattering spectroscopy ;Anal.Chem. 2010，82，8991-8997)利用RCA实现了高灵敏度的核酸检测，但是其中利用到了荧光探针来检测，成本高，对仪器设备的要求较高。纳米颗粒是一种人工合成的微小颗粒，它的形态可能是乳胶体、聚合物、陶瓷颗粒、金属颗粒和碳颗粒。1996年，Mirkin等人(Mirkin, C. A. , et al ；)发现表面修饰有核酸探针的13nm金颗粒溶液中加入与修饰核酸互补配对的目标核酸分子时，由于金颗粒的聚集溶液的颜色会由红变蓝。自此利用纳米颗粒来进行生物分子检测的研究广泛开展开来。目前通用的方法主要分为两种，一种是利用在金或银纳米颗粒修饰核酸探针，根据溶液的颜色变化来检测目标核酸分子，优点检测方法简单，但是所用的纳米颗粒成本较高；另一种是利用在颗粒表面修饰核酸分子，通过不同的核酸扩增手段后加入荧光探针来进行目标分子检测，优点是检测的灵敏度相对更好，但是荧光探针的成本也较高。且这些检测方法都着眼于定量的检测，而临床上很多疾病的检测只需要判断有或无即可，不需要进行定量的检测。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种在二氧化硅纳米颗粒表面进行滚环扩增以实现核酸分子快速、高灵敏度的定性检测方法。本发明所述的基于滚环扩增检测目标核酸的方法，其特征在于利用滚环扩增之前二氧化硅纳米颗粒在溶液中呈自由分散状态，加入目标核酸分子滚环扩增之后溶液中的二氧化硅纳米颗粒聚集成肉眼可分辨的白色团块状物的现象，实现对核酸分子的快速、高灵敏度的定性检测。为实现上述目的，本发明的检测方法包括以下步骤I)将待测目标核酸分子的捕获探针修饰到二氧化硅纳米颗粒表面；2)加入引物探针、BSA、DNA连接酶及目标核酸分子与捕获探针杂交；3)加入环状DNA、BSA、聚合酶及扩增原料进行滚环扩增；
4)当ニ氧化硅纳米颗粒的聚集状态由自由分散状态变为白色团块状物时，则判定目标核酸分子存在。步骤I)中，所述目标核酸分子为单链DNA或RNA。步骤I)中，所述ニ氧化硅纳米颗粒，大小为540nm ;其表面带有链激酶亲和素修饰。步骤I)中，所述捕获探针为一段单链DNA片段，其5’端带有连接分子修饰，其中所述连接分子为生物素，通过与链激酶亲和素结合，将捕获探针修饰到颗粒的表面；所述捕获探针与目标核酸分子的5’末端一段序列互补配对。步骤2)中，所述引物探针为一段单链DNA，其5’端带有磷酸基团修饰。 进ー步地，所述的引物探针的5’末端序列与目标核酸分子的3’末端的一段碱基互补配对。进ー步地，所述的引物探针的3’末端序列与环状DNA的一段碱基互补配对，作为滚环扩增的引物。步骤2)中，所述的DNA连接酶包括T4DNA连接酶。步骤3)中，所述的环状DNA为单链环状DNA，为滚环扩增的模板。步骤3)中，所述的DNA聚合酶为等温聚合酶，包括Phi 29DNA聚合酶，RNA聚合酶。步骤3)中，所述的核酸扩增原料，当检测目标核酸分子为单链DNA时为四种脱氧核糖核苷酸，当检测目标核酸分子为RNA时为四种核糖核苷酸。本发明利用滚环扩增前后颗粒聚集状态的改变来判断目标核酸分子的有无，提供了ー种简易、快速、高灵敏的核酸分子定性检测方法，其有益效果如下a)滚环扩增前后颗粒聚集状态的改变通过肉眼即可明显观察到，无需专门的检测仪器，降低检测的成本，适合临床检测的推广；b)利用了滚环扩增的高效性，能实现快速、高灵敏度的定性检测；c)检测的步骤较少，所涉及的实验方法简单；d)检测体系所用的物质均是商品化的产品，可以很容易在市场上买到或合成，适于大规模生产。
图1为利用滚环扩增前后颗粒聚集状态不同实现定性检测的原理图(其中，I ニ氧化硅颗粒；2.链激酶亲和素；3.亲和素；4.捕获探针；5.引物探针；6.目标核酸分子；7.捕获探针和引物探针连接产物；8.环状DNA;9.滚环扩增后的长链DNA; 10.滚环扩增后形成的颗粒团聚物)。图2为目标DNA浓度分别为lfM，IOfM, IOOfM, IOOOfM滚环扩增前颗粒聚集状态的实物图。图3为目标DNA浓度分别为lfM，IOfM, IOOfM, IOOOfM滚环扩增后颗粒聚集状态的实物图。
具体实施例方式下面结合具体实施例进ー步阐述在纳米颗粒表面进行滚环扩增对核酸分子进行定性检测的方法。1.检测探针的设计与合成
权利要求
1.一种基于滚环扩增的核酸定性检测方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将待测目标核酸分子的捕获探针修饰到二氧化硅纳米颗粒表面； 2)加入引物探针、BSA、DNA连接酶及目标核酸分子与捕获探针杂交； 3)加入环状DNA、BSA、聚合酶及扩增原料进行滚环扩增； 4)当二氧化硅纳米颗粒的聚集状态由自由分散状态变为白色团块状物时，则判定目标核酸分子存在。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中，所述目标核酸分子为单链DNA或RNA。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中，所述二氧化硅纳米颗粒，直径为540nm,其表面带有链激酶亲和素分子修饰。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中，所述捕获探针为一段单链DNA片段，其5’端带有连接分子修饰。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中，所述捕获探针的3’末端碱基与目标核酸分子的5’末端碱基互补。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述连接分子为生物素，通过与链激酶亲和素结合，将捕获探针修饰到颗粒的表面。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的引物探针为一段单链DNA，其5’端带有磷酸基团修饰。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的引物探针5’末端序列与目标核酸分子的3’末端的一段碱基互补配对，其3’末端序列与环状DNA的一段碱基互补配对。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的DNA连接酶包括T4DNA连接酶。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的环状DNA为单链环状DNA，为滚环扩增的模板。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的聚合酶为等温聚合酶，包括Phi 29DNA聚合酶，RNA聚合酶。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的核酸扩增原料，当检测目标核酸分子为单链DNA时为四种脱氧核糖核苷酸，当检测目标核酸分子为RNA时为四种核糖核苷酸。
全文摘要
本发明提供一种基于纳米颗粒和滚环扩增的核酸定性检测方法。该检测方法主要利用滚环扩增之前，二氧化硅纳米颗粒在溶液中呈分散状态，当存在目标核酸分子时，滚环扩增发生，二氧化硅纳米颗粒聚集在一起，在溶液中形成肉眼可见的白色团块状物质，以达到定性检测目标核酸分子的目的。该方法通过滚环扩增前后二氧化硅纳米颗粒的聚集状态即可判断目标核酸分子的有无，既实现了对微量核酸分子的大量扩增，又实现了结果的快速直观检测，无需专门的检测仪器，降低检测的成本，适合临床检测的推广。
文档编号C12Q1/68GK103014169SQ20121059133
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者桑建明, 王玮 申请人:北京大学