专利名称：确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域。具体而言，本发明涉及确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物。
背景技术：
ApoE是一种载脂蛋白，其遗传多态性主要受控于两个SNP位点rs429358和rs7412，这两个SNP位点通过不同的核酸组合决定了 ApoE的三种等位基因型:ε 2(rs429358 为 T, rs7412 为 T)、ε 3 (rs429358 为 Τ, rs7412 为 C)、ε 4 (rs429358 为 C,rs7412为C)，这三种类型等位基因分别编码三种ApoE蛋白亚型，即ApoE2 (其蛋白序列的112位和158位均为半胱氨酸)、ApoE3 (其蛋白序列的112位为半胱氨酸，158位为精氨酸)、ApoE4 (其蛋白序列的112位和158位均为精氨酸)。因此，ApoE基因有ε 2/ ε 2、ε 3/ε3、和ε 4/ε 4三种纯合子型与ε 2/ε 3、ε 2/ε 4和ε 3/ε 4三种杂合子型。目前ApoE基因分型的方法主要有:传统DNA测序法、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法、聚合酶链反应-单链构象多态性法、聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性法、多重扩增受阻突变体系PCR技术法、高分辨率溶解曲线法以及双色荧光分子探针法等。然而，目前确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了可以有效确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。在本发明的一 个方面，本发明提出了一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。根据本发明 的实施例，该方法包括:利用第一引物和第二引物对所述核酸样本进行PCR扩增，并且在所述PCR扩增体系中加入核酸探针，所述核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分的核酸序列；以及检测反应体系的发光，以便确定所述核酸样本的预定位点是否存在已知突变，其中，所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基，所述第一引物和第二引物之一作为正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另一个作为反向引物，所述核酸探针具有:发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5’端，调节基团，所述调节基团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光。根据本发明实施例的方法，能够通过检测PCR扩增体系所产生的荧光，有效地确定所检测的核酸样本的两个预定位点同时存在相应的已知突变，并进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型，对于老年痴呆症及心脑血管等与ApoE基因型相关疾病的预防、早期诊断以及疾病预后具有非常重要的意义。根据本发明的一些实施例，上述确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法还可以具有下列附加技术特征:根据本发明的一个实施例，所述核酸样本来源于人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞，优选地采用人类全基因组DNA。根据本发明的实施例，可以对上述来源的核酸样本进行有效地确定突变类型，从而可以对提供核酸样本的个体进行有效地分析。根据本发明的一个实施例，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412。由此，利用根据本发明实施例，可以有效地确定核酸样本中在两个预定位点SNP rs429358和rs7412是否具有已知突变，从而可以有效地确定ApoE等位基因分型。根据本发明的一个实施例，所述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基。由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法对核酸样本进行检测，在PCR反应时引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，从而可以特异地扩增出ApoE的不同等位基因，并进一步可以有效地确定ApoE等位基因的类型。根据本发明的一个实施例，所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基。根据本发明的一个实施例，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物。根据本发明的一个实施例，所述第一引物为选自下列的至少之一:5’ -CGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ -GCGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ - CGCGGACA TGGAGGA CGTGT - 3’，5’ -CGGACATGGAGGACGTGC-3> , - GCGGA CA TGGAGGA CGTGC - 3’，5’ -CGCGGACATGGAGGACGTGC-3’。所述第二引物为选自下列的至少之一:5’ -TGGTACACTGCCAGGCA-3’，5’ -CTGGTACACTGCCAGGCA-3’，5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’，5，-TGGTACACTGCCAGGCG-3，，5，-CTGGTACACTGCCAGGCG-3，，5，-CCTGGTACACTGCCAGGCG-3，。由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法对核酸样本进行检测，在PCR反应过 程中，引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，从而可以特异地扩增出ApoE的不同等位基因，并进一步可以有效地确定ApoE等位基因的类型。根据本发明的一个实施例，所述核酸探针的长度为20个核苷酸。根据本发明的一个实施例，所述核酸探针的序列为5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3’。根据本发明的一个实施例，所述核酸探针的发光基团为荧光基团。根据本发明的一个实施例，所述荧光基团为FAM。根据本发明的一个实施例，所述调节基团为淬灭基团。根据本发明的一个实施例，所述淬灭基团为BHQ1。由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法对核酸样本进行检测，通过检测各基因型对应的扩增体系中有无荧光信号，即可判断待测样品中是否含有该亚型的ApoE基因。在本发明的又一个方面，本发明提出了一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒可以应用于前面所述的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的试剂盒对核酸样本进行检测，可以有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，并进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型，对于老年痴呆症和心脑血管疾病的预防以及早期诊断具有非常重要的意义。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法所描述的特征和优点，也当然地适用该试剂盒，不再赘述。在本发明的又一个方面，本发明提出了一组确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的PCR引物。根据本发明的实施例，所述PCR引物可以应用于前面所述的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法以及试剂盒。由此，PCR扩增过程中引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可以按照预定方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增出不同等位基因。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法及试剂盒所用引物的描述的特征和优点，也当然地适用该PCR引物，不再赘述。根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法可以实现下列优点至少之一:1、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，该方法操作简便，仅需PCR扩增和荧光检测两个步骤；2、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，该方法容易实现自动化操作，可以大大减小手工操作过程中的人为误差，使得到的结果更加准确；3、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，该方法快速省时，完成整个检测的时间不到1.5小时，耗时少于现有的方法；4、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，该方法的成本较低，仅需一个荧光探针和常规PCR体系即可；5、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，该方法的检测结果直观，根据荧光信号的有无即可定性判断待测样本中是否具有该扩增体系引物对所对应的ApoE 等位基因型，无需繁琐的分析过程。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的不同引物对ApoE不同等位基因特异性扩增原理示意图，在该图中，I表示含SNPrs42358和rs7412的ApoE基因DNA片段示意图；图2是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的ApoE基因PCR扩增体系示意图，在该图中，I表示ApoE基因DNA模板反义链，2表示正向扩增引物，3表示偶联有荧光基团(F)和淬灭基团(Q)的DNA分子探针，4表示ApoE基因DNA模板正义链，5表示反向扩增引物，6表示DNA聚合酶；图3是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的荧光探针工作原理示意图，在该图中，I表示ApoE基因DNA模板反义链，2表示正向扩增引物，3表示荧光基团(F)脱离的DNA分子探针，4表示ApoE基因DNA模板正义链，5表示反向扩增引物，6表示DNA聚合酶；
图4是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的实例样品检测荧光信号读值结果图；图5是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的实例样品检测荧光信号读值的柱型分析图。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“厚度”、“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。在本发明的一个方面，本发明提出了一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。根据本发明的实施例，确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法可以包括以下步骤:SlOO:利用第一引物和第二引物对核酸样本进行PCR扩增，并且在PCR扩增体系中加入核酸探针在该步骤中，针对核酸样本的两个预定位点之一的核酸序列设计一条PCR引物:第一引物，针对核酸样本的两个预定位点另一个预定位点的核酸序列设计一条PCR引物:第二引物，并且加入核酸探针，然后对核酸样本进行PCR扩增。由此，获得PCR扩增样本，以便进一步对其进行荧光检测。发明人发现，在PC R扩增时，如果第一引物的近3’端包含与核酸样本的两个预定位点之一的已知突变对应的碱基，第二引物的近3’端包含与核酸样本的另一个预定位点的已知突变对应的碱基，以及第一引物和第二引物之一作为正向引物，第一引物和所述第二弓丨物的另一个作为反向引物，则在PCR扩增时弓丨物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可以按照预定方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增出不同等位基因。根据本发明的实施例，第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基。根据本发明的实施例，第一引物作为正向引物，第二引物作为反向引物。根据本发明的实施例，第一引物为选自下列的至少之一:5’ -CGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ -GCGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ -CGCGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ - CGGA CA TGGAGGA CGTGC - 3’，5’ -GCGGACATGGAGGACGTGC-3’，5’ -CGCGGACATGGAGGACGTGC-3’。所述第二引物为选自下列的至少之一:5，-TGGTACACTGCCAGGCA-3，，5，-CTGGTACACTGCCAGGCA-3，，5， -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3，，5， -TGGTACACTGCCAGGCG-3，，5， -CTGGTACACTGCCAGGCG-3，，5’-CCTGGTACACTGCCAGGCG-3’。由此，PCR扩增时引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可以按照预定5’到3’方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增出不同等位基因。根据本发明的具体实施例，针对SNP rs429358为T或C的核酸序列分别设计一条PCR正向引物(以下称为pll2T或pll2C)，针对SNP rs7412为T或C的核酸序列分别设计一条PCR反向引物(以下称为pl58T或pl58C)。根据ApoE基因型的区别可得知，ApoE不同基因型SNP rs429358和rs7412之间的核酸序列可由如下引物对在PCR反应中特异扩增:引物pll2T和pl58T能够特异扩增ε 2型基因，引物ρ112Τ和pl58C能够特异地扩增ε 3型基因，以及引物P112C和pl58C能够特异地扩增ε 4型基因。由此，PCR能够特异地扩增出不同等位基因，从而可以有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，进一步可以有效地确定核酸样本中ApoE等位基因的类型。在该步骤中，针对核酸样本的两个预定位点之间的核酸序列设计一段具有特异性的核酸荧光探针，核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列。发明人发现，如果核酸探针具有:发光基团，发光基团形成于所述核酸探针的5’端，调节基团，调节基团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光，则当含有核酸探针对应核酸序列被PCR扩增时，探针能够特异结合到扩增模板上，此时核酸聚合酶的外切酶活性能够切下探针5’端基团，使发光基团和调节基团分离，从而发出可检测的信号。根据本发明的具体实施例，核酸探针的发光基团为荧光基团，优选荧光基团为FAM。根据本发明的实施例，核酸探针的调节基团为荧光基团，优选调节基团为BHQ1。根据本发明的实施例，核酸探针的长度不受特别限制，例如，核酸探针的长度可以为20个核苷酸。根据本发明的具体实施例，针对SNP rs429358和rs7412之间的核酸序列设计一段具有特异性的核酸荧光探针。根据本发明的一个实施例，核酸探针的序列为5’FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’。由此，当检测核酸样本的ApoE基因型时，仅需在PCR扩增体系中加入按上述方法设计的核酸荧光探针，利用E2/E3/E4基因型各自对应的不同引物分别PCR扩增待测DNA模板。PCR反应结束后，检测各基因型对应的扩增体系中有无荧光信号，即可判断待测核酸样本中是否含有该亚型的ApoE基因。根据本发明的实施例，核酸样本的类型及来源并不受特别限制，例如，可以是人基因组DNA的至少一部分，可以来源于任何人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞。由此，利用根据本发明 实施例的方法，可以有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型，对于老年痴呆症和心脑血管疾病的预防以及早期诊断具有非常重要的意义。在本发明中所使用的术语“核酸样本”的含义是指在任何涉及人基因组DNA的至少一部分，检测的核酸样本可以来源于任何人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞。在本发明中，除非特别说明，“第一与、第二”仅是为了便于描述本发明，不能理解为对本发明的限制。在本发明中，除非特别说明，“近3’端”指的是，距离3’末端的碱基为预定范围以内的碱基，例如距离10个，9个，8个，7个，6个，5个，4个，3个，2个，I个或者O个(即3’末端)。S200:检测反应体系的发光，以便确定核酸样本的预定位点是否存在已知突变在该步骤中，对步骤SlOO中所得到的PCR扩增样本进行荧光检测，在荧光检测时，根据PCR扩增体系中有无荧光信号即可定性判断待测核酸样本中是否具有该PCR扩增体系引物对所对应的ApoE等位基因分型。由此，可以确定核酸样本的预定位点是否存在已知突变，并进一步可以有效地确定ApoE等位基因的类型。
根据本发明的具体实施例，对人体基因组DNA的PCR扩增样本进行荧光检测，如果仅在ε 2扩增体系中检测到荧光信号，则该样品来源的待测人ApoE基因型为ε2/ε2;同理如果仅在ε3(或ε 4)扩增体系中检测到荧光信号，则该样品来源的待测人ApoE基因型为ε 3/ ε 3 (或ε 4/ ε 4);如果同时在ε 2和ε 3扩增体系中检测到荧光信号，则该样品来源的待测人ApoE基因型为ε 2/ε 3;同理如果同时在ε2和ε 4扩增体系中检测到荧光信号，则该样品来源的待测人ApoE基因型为ε2/ε4;同理如果同时在ε2和ε 4 (或ε3和ε 4)扩增体系中检测到荧光信号，则该样本来源的待测人ApoE基因型为ε 2/ ε 4 (或ε 3/ε 4)。由此，可以有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型，对于老年痴呆症和心脑血管疾病的预防、早期诊断以及疾病预后具有非常重要的意义。根据本发明的实施例，PCR扩增及荧光检测的手段并不受特别限制，可以借助任何已知的方法与设备来进行PCR扩增及荧光检测。例如根据本发明的具体实施例，利用美国Applied Biosystems 公司的 7500Fast Real-Time PCR system,可以将 PCR热循环、突光检测及各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况，PCR实验结束后可以马上得到结果，无需凝胶电泳分析，无需纯化PCR产物，具有时间省、灵敏度高、准确性好等优点，再例如，相关技术人员可以根据具体实际需要的不同，对引物以及PCR温度等进行相应的调整，在此不再赘述，这些均在本发明的权利保护范围之内。在本发明的又一个方面，本发明提出了一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的试剂盒。根据本发明的具体实施例，该试剂盒可以应用于前面所述的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的试剂盒对核酸样本进行检测，可以有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，并进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法所描述的特征和优点，也当然地适用该试剂盒，不再赘述在本发明的又一个方面，本发明提出了一组确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的PCR引物。根据本发明的具体实施例，该引物可以应用于前面所述的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法以及试剂盒。由此，PCR扩增过程中引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可以按照预定方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增出不同等位基因。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法及试剂盒所用引物的描述的特征和优点，也当然地适用该PCR引物，不再赘述。本法明的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒及引物可以应用在老年痴呆症以及心脑血管等疾病的预防以及早期诊断方面，相关技术人员当然也可以将其扩大至其它其应用领域，在此不予赘述，这些均在本发明的权利保护范围之内。下面通过具体的实施例， 对本发明进行说明，需要说明的是这些实施例仅仅是为了说明目的，而不能以任何方式解释成对本发明的限制。另外，在下列实施例中如果没有特别说明，则所采用的设备和材料均为市售可得的。一般方法:
I材料与试剂:I) DNA 引物 pll2T:5，-GCGGACATGGAGGACGTGT-3，，Tm=59.5 °C，GC 含量=63.2%，5.6nM/0D/管，加无菌去离子水55.6 μ I配制成100 μ M反应液，于4 °C储藏；5’ -CGGACATGGAGGACGTGT-3’，Tm=57.2°C，GC 含量=61.1%，5.9nM/0D/ 管，加无菌去离子水58.9 μ I配制成100 μ M反应液，于4°C储藏。引物均合成于上海博尚生物技术有限公司，纯化方式为:PAGE纯化。2) DNA 引物 pll2C:5，-CGGACATGGAGGACGTGC-3，，Tm=59.5。。，GC 含量=66.7%,5.91^/00/管，加无菌去离子水59111配制成100 μ M反应液，于4°C储藏。引物均合成于上海博尚生物技术有限公司，纯化方式为:PAGE纯化。3) DNA 引物 pl58T:5，-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3，，Tm=59.5。。，GC 含量=63.2%,
5.7nM/0D/管，加无菌去离子水57.2 μ I配制成100 μ M反应液，于4°C储藏。引物均合成于上海博尚生物技术有限公司，纯化方式为:PAGE纯化。4)DNA 引物 pl58C:5，-CTGGTACACTGCCAGGCG-3，，Tm=59.5°C ,GC 含量=66.7%, 6nM/OD/管，加无菌去离子水60 μ I配制成100 μ M反应液，于4°C储藏。引物均合成于上海博尚生物技术有限公司，纯化方式为:PAGE纯化。5)荧光 DNA 分子探针:5’ FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’，Tm=65°C，GC 含量=70%，5.1nM/OD/管，加无菌去离子水51 μ I配制成100 μ M反应液，于4°C避光储藏。荧光DNA分子探针合成于英潍捷基(上海)贸易有限公司，纯化方式为:HPLC纯化。6)PCR预混液:购于美国 Applied Biosystems 公司的 TaqMan Genotyping MasterMix (包括DNA聚合酶，dNTPs，R0X参比荧光)，ROX参比荧光在PCR反应中不会加入扩增，它作为荧光内参能够矫正在PCR反应中由于浓度和体积改变引起的荧光信号变化。
7)无菌去离子水:去离子水取自英国ELGA纯水仪(型号purelab3000)，并经高压蒸汽灭菌后所得。8) 1.5ml离心管:购于美国Axygen公司。9) PCR 板:MicroAmp 0ptical96-ffell Reaction Plate 购于美国 AppliedBiosystems 公司。10) PCR 封板膜:Mi_croAmp 96-Well Optical Adhesive Film 购于美国 AppliedBiosystems 公司。11) 一次性医用无菌注射器:一次性医用无菌注射器(5ml规格)购于河南新乡市宇安医用卫材有限公司。12)人血液基因组DNA提取相关试剂:a、红细胞裂解液:称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷(Tris)L 3g加水溶解并稀释至500ml, 0.22m滤膜(购于美国Millipore公司)过滤除菌,于4°C保存；b> Nuclei Lysis Solution (购于美国 Promega 公司)；c、Precipitation Solution (购于美国 Promega 公司)。13) ε 2/ ε 2DNA已知样本:从ε 2/ ε 2基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。14) ε 3/ ε 3DNA已知样本:从ε 3/ ε 3基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。
15) ε 4/ ε 4DNA已知样本:从ε 4/ ε 4基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。16) ε 2/ ε 3DNA已知样本:从ε 2/ ε 3基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。17) ε 2/ ε 4DNA已知样本:从ε 2/ ε 4基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。16) ε 3/ ε 4DNA已知样本:从ε 3/ ε 4基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。2仪器与设备:I)移液器:微量移液器(10 μ L, 20 μ L, 100 μ L, 1000 μ L)购于德国 Eppendorf 公司。2)离心机:小型高速离心机(型号:5424),购于德国Eppendorf公司。3)离心机:Universal32R型控温高速离心机,购于德国Hettich zentrifugen公司。4)涡旋混合器: 购于江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司。5)全波长扫描式多功能读数仪:Thermo Scientific Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪，购于Thermo Scientific公司。6) Real-Time PCR 仪器:7500Fast Real-Time PCR system,购于美国 AppliedBiosystems 公司。7)分析软件:7500software V2.0.6,购于美国 Applied Biosystems 公司。在下列实施例中(详细见下面的实施例1-3)，确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法的步骤如下:I引物设计:ApoE基因的DNA序列由美国国家生物科技信息中心(NCBI)网站提供，根据包含ApoE基因多态性位点SNP rs429358和SNP rs7412的DNA序列信息，对引物进行如下设计:I)针对SNP rs429358位点核酸形式为T的正向PCR扩增引物(ρ112Τ)，其DNA序列为:5’ -GCGGACATGGAGGACGTGT-3’ 和 5’ -CGGACATGGAGGACGTGT-3’ ；2)针对SNP rs429358位点核酸形式为C的正向PCR扩增引物(pll2C)，其DNA序列为:5’ -CGGACATGGAGGACGTGC-3’ ；3)针对SNP rs7412位点核酸形式为T的反向PCR扩增引物(ρ158Τ)，其DNA序列为:5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3，；4)针对SNP rs7412位点核酸形式为C的反向PCR扩增引物(pl58C)，其DNA序列为:5’ -CTGGTACACTGCCAGGCG-3，。2荧光DNA分子探针设计:根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)网站提供的ApoE基因DNA序列信息，该基因 SNP rs429358 位点与 SNP rs7412 位点之间的 DNA 序列为:tgcggccgcctggtgcagtaccgcggcgaggtgcaggccatgctcggccagagcaccgaggagctgcgggtgcgcctcgcctcccacctgcgcaagctgcgtaagcggctcctccgcgatgccgatgacctgcagaagcgc，选取该序列中的一段作为探针的互补核酸序列部分，该序列为5’ -CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3’。选用荧光探针，选取FAM荧光基团以及BHQl淬灭基团，FAM荧光基团偶联在互补核酸序列的5’端，BHQl淬灭基团偶联在互补核酸序列的 3’ 端，荧光探针为:5’ FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’。以下部分以人血液基因组DNA样本为检测样品进行阐述:3操作流程I)样本采集:使用一次性医用无菌注射器(5ml)抽取人静脉血Iml于含有1.5mg EDTA钠抗凝血剂的管中，放置4 °C冰箱储藏待用。2)人血液基因组DNA提取:a、从4°C冰箱取出采集的人血液并轻轻混匀，然后用移液器取300ul血液转移到含有900ul红细胞裂解液的1.5ml离心管中，上下颠倒5_6次。b、室温放置10分钟(期间颠倒2-3次)，室温条件下13000_16000g离心20秒。C、吸去上清，剩下约10_20ul于管底。d、润旋振荡重悬白细胞,加入Nuclei Lysis Solution,吹吸5-6次,可选步骤加入
1.5ul的RNA酶混匀，37°C条件下放置15分钟。e、加入 IOOul Precipitation Solution,润旋振荡 10-20 秒。f、室温条件下1 3000_16000g离心10分钟。g、转移上清到新的1.5ml离心管，加入300ul异丙醇，上下轻轻颠倒直到有白色絮状DNA出现。h、室温条件下13000-16000g离心I分钟。1、吸去上清，加入70%乙醇，轻轻的上下颠倒几次洗涤DNA，室温条件下13000-16000g 离心 I 分钟。j、轻轻吸去乙醇，将1.5ml离心管倒置在干净的吸水纸上10-15分钟。k、加入IOOul无菌去离子水溶解DNA，65°C水浴I小时，也可以4°C过夜。1、利用全波长扫描式多功能读数仪中的DNA浓度测量程序测量所提DNA的浓度，取一部分DNA溶液用无菌去离子水稀释至2ng/ml，作为后续PCR检测模板，剩余DNA溶液存放于2 8°C或_20°C。3) PCR反应体系配制:根据ApoE基因的三个多态性，与三种检测试剂(ε 2试剂、ε 3试剂和ε 4试齐[J)，分别用于人群中存在6种不同ApoE基因型ε2/ε2，ε 3/ ε 3, ε 4/ ε 4, ε 2/ ε 3, ε 2/ ε 4和ε 3/ ε 4的检测。6种已知ApoE基因型DNA已知样本(ε 2/ ε 2DNA已知样本、ε 3/ ε 3DNA已知样本、ε 4/ε 4DNA已知样本、ε 2/ε 3DNA已知样本、ε 2/ε 4DNA已知样本和ε 3/ε 4DNA已知样本)作为对照其中ε 2试剂包括:a、对应ApoE ε 2等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物ρ112Τ (该实例中核酸序列为 5’ -GCGGACATGGAGGACGTGT-3’ )。b、对应ApoE ε 2等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物P158T(该实例中核酸序列为 5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’)。C、荧光探针(该实例中探针形式为 5’ FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’)。d、PCR 预混液 TaqMan Genotyping Master Mix。
其各成分具体剂量为:TaqMan Genotyping Master Mix 4.925 μ Iε 2 正向引物 ρ112Τ (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ Iε 2 正向引物 ρ158Τ (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ I荧光探针(100μ Μ)0.05 μ I其中ε 3试剂包括:a、对应ApoE ε 3等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物ρ112Τ (该实例中核酸序列为 5’ -CGGACATGGAGGACGTGT-3’ )。b J^SApoE ε 3等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物pl58C(该实例中核酸序列为5’ -CTGGTACACTGCCAGGCG-3’)。C、荧光探针(该实例中探针形式为 5’ FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’)。d、PCR 预混液 TaqMan Genotyping Master Mix。其各成分具体剂量为:TaqMan Genotyping Master Mix 4.925 μ Iε 3 正向引物 ρ112Τ (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ I
ε 3 正向引物 pl58C (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ I荧光探针(100μ Μ)0.05 μ I其中ε 4试剂包括:a、对应ApoE ε 4等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物pi 12C (该实例中核酸序列为 5’ -CGGACATGGAGGACGTGC-3’ )。b J^SApoE ε 4等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物pl58C(该实例中核酸序列为5’ -CTGGTACACTGCCAGGCG-3’)。C、荧光探针(该实例中探针形式为 5’ FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’)。d、PCR 预混液 TaqMan Genotyping Master Mix。其各成分具体剂量为:TaqMan Genotyping Master Mix 4.925 μ Iε 4 正向引物 pll2C (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ Iε 4 正向引物 pl58C (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ I荧光探针(100μ Μ)0.05 μ I使用ApoE基因分型检测试剂需要10 μ I反应体系就可以充分检测到信号。ε 2基因检测的PCR反应体系为:ε2 试剂:5μ1待测DNA 样品(2ng/ μ I): 5 μ Iε 2阳性对照检测体系1:ε2 试剂:5μ1ε 2/ ε 2DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 2阳性对照检测体系2:ε2 试剂:5μ1ε 2/ ε 3DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ I
ε 2阳性对照检测体系3:ε2 试剂:5μ1ε 2/ ε 4DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 2阴性对照检测体系1:ε2 试剂:5μ1ε 3/ ε 3DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 2阴性对照检测体系2:ε2 试剂:5μ1ε 4/ ε 4DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 2阴性对照检测体系3:ε2 试剂:5μ1ε 3/ ε 4DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 3基因检测的PCR反应体系为:ε3 试剂:5 μ1待测DNA 样品(2ng/ μ I): 5 μ Iε 3阳性对照检测体系1:ε3 试剂:5μ1ε 3/ ε 3DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 3阳性对照检测体系2:ε3 试剂:5μ1ε 2/ ε 3DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 3阳性对照检测体系3:ε3 试剂:5μ1ε 3/ ε 4DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 3阴性对照检测体系1:ε3 试剂:5μ1ε 2/ ε 2DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 3阴性对照检测体系2:ε3 试剂:5μ1ε 4/ ε 4DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 3阴性对照检测体系3:ε3 试剂:5μ1ε 2/ ε 4DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 4基因检测的PCR反应体系为:ε 4 试剂:5 μ I待测DNA 样品(2ng/ μ I): 5 μ Iε 4阳性对照检测体系1:ε4 试剂:5μ1ε 4/ ε 4DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ I
ε 4阳性对照检测体系2:ε4 试剂:5μ1ε 2/ ε 4DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 4阳性对照检测体系3:ε4 试剂:5μ1ε 3/ ε 4DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 4阴性对照检测体系1:ε 4 试剂:5 μ Iε 2/ ε 2DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 4阴性对照检测体系2:ε4 试剂:5μ1ε 3/ ε 3DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ Iε 4阴性对照检测体系3:ε 4 试剂:5 μ I ε 2/ ε 3DNA 已知样本(2pg/ul): 5 μ I4) PCR扩增反应:将待测样品即人血液提取的基因组DNA (2ng/y I)与已知ApoE基因型的DNA已知样品分别加入ε 2，ε3和ε4基因检测的10μ1 PCR反应体系中。用灭菌的去离子水作为整个PCR体系的阴性对照。在PCR板中配制好所有PCR反应体系后，用PCR封板膜封闭好PCR板，残留在PCR板孔壁上液体用Universal32R型控温高速离心机离心到管底并排除气泡。然后，将该 PCR 板放入 7500Fast Real-Time PCR system 仪器中，打开 7500softwareV2.0.6软件,选择软件中的Genotyping模块,在Plate setup中设置对应放入PCR板上每孔的检测内容。然后在Run method中设置PCR反应程序及反应体系，这些项目设置完毕后，便可运行程序，该程序默认PCR反应之前先在60°C条件下预读取本底荧光强度值再进行PCR扩增以消除背景荧光值。待PCR反应完成之后，仪器可自动在60°C条件下收集荧光数据。表I为该实例PCR反应过程的标准热循环程序。表IPCR反应程序
权利要求
1.一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，其特征在于，包括: 利用第一引物和第二引物对所述核酸样本进行PCR扩增，并且在所述PCR扩增体系中加入核酸探针，所述核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分的核酸序列；以及检测反应体系的发光，以便确定所述核酸样本的预定位点是否存在已知突变， 其中， 所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基， 所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基， 所述第一引物和第二引物之一作为正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另一个作为反向引物， 所述核酸探针具有: 发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5’端， 调节基团，所述调节基 团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光， 任选地，所述核酸样本来源于人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞， 任选地，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412， 任选地，所述述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基， 任选地，所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基， 任选地，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物， 任选地，所述第一引物为选自下列的至少之一:5， -CGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -GCGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -CGCGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -CGGACATGGAGGACGTGC-3，5， -GCGGACATGGAGGACGTGC-3，5， -CGCGGACATGGAGGACGTGC-3，， 所述第二引物为选自下列的至少之一:5， -TGGTACACTGCCAGGCA-3’5， -CTGGTACACTGCCAGGCA-3’5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’5， -TGGTACACTGCCAGGCG-3’5， -CTGGTACACTGCCAGGCG-3’5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCG-3’， 任选地，所述核酸探针 的长度为20个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸探针的序列为:5， -CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3，。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸探针的发光基团为荧光基团， 任选地，所述荧光基团为FAM，任选地，所述调节基团为淬灭基团， 任选地，所述淬灭基团为BHQl。
4.一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的试剂盒，其特征在于，包括: 第一引物，所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基， 第二引物，所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基， 核酸探针，所述核酸探针与两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列，并且所述核酸探针具有: 发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5’端， 调节基团，所述调节基团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光， 任选地，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412， 任选地，所述述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基， 任选地，所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基， 任选地，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物， 任选地，所述第一引物为选自下列的至少之一:5， -CGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -GCGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -CGCGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -CGGACATGGAGGACGTGC-3，5， -GCGGACATGGAGGACGTGC-3，5， -CGCGGACATGGAGGACGTGC-3，， 所述第二引物为选自下列的至少之一:5， -TGGTACACTGCCAGGCA-3’5， -CTGGTACACTGCCAGGCA-3’5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’5， -TGGTACACTGCCAGGCG-3’5， -CTGGTACACTGCCAGGCG-3’5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCG-3’， 任选地，所述核酸探针的长度为20个核苷酸。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸探针的序列为:5， -CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3，。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸探针的发光基团为荧光基团， 任选地，所述荧光基团为FAM， 任选地，所述调节基团为淬灭基团，任选地，所述淬灭基团为BHQl。
7.一组确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的PCR引物，其特征在于，包括: 第一引物，所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基， 第二引物，所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基， 核酸探针，所述核酸探针与两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列，并且所述核酸探针具有: 发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5’端， 调节基团，所述调节基团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光， 任选地，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412， 任选地，所述述第一 引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含 与rs7412的已知突变对应的碱基， 任选地，所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基， 任选地，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物， 任选地，所述第一引物为选自下列的至少之一:.5， -CGGACATGGAGGACGTGT-3，.5， -GCGGACATGGAGGACGTGT-3，.5， -CGCGGACATGGAGGACGTGT-3，.5， -CGGACATGGAGGACGTGC-3，.5， -GCGGACATGGAGGACGTGC-3，.5， -CGCGGACATGGAGGACGTGC-3，， 所述第二引物为选自下列的至少之一:.5， -TGGTACACTGCCAGGCA-3’.5， -CTGGTACACTGCCAGGCA-3’.5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’.5， -TGGTACACTGCCAGGCG-3’.5， -CTGGTACACTGCCAGGCG-3’5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCG-3’。
全文摘要
本发明公开了确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物。其中，该方法包括利用第一引物和第二引物对核酸样本进行PCR扩增，并且在PCR扩增体系中加入核酸探针，核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列；检测反应体系的发光，以便确定核酸样本的预定位点是否存在已知突变，第一引物的近3’端包含与两个预定位点之一已知突变对应的碱基，第二引物的近3’端包含与另一个已知突变对应的碱基，核酸探针具有发光基团，发光基团形成于核酸探针的5’端，调节基团，调节基团形成于核酸探针的3’端，并且调节基团可以调节发光基团的发光。利用该方法能够有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变。
文档编号C12Q1/68GK103103259SQ20121059241
公开日2013年5月15日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者许华曦, 卜国军, 张含, 张云武, 刘家珍 申请人:厦门人瑞生物医药科技有限公司