G蛋白偶连受体拮抗剂的制作方法

专利名称：G蛋白偶连受体拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明的技术领域趋化因子也即intecrines，是细胞因子家族中可溶的、低分子量的一种，具有趋化吸引功能。趋化因子能够选择性诱导血液中有形部分的趋化性(除红细胞外)，包括白细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜伊红粒细胞、嗜碱细胞、乳突细胞和淋巴细胞如T细胞、B细胞、多形核细胞(中性细胞)。除激发趋化性外，趋化因子还在应答细胞中选择性诱导其他变化，包括细胞形状的改变、胞内自由钙离子浓度的瞬间升高、粒物质细胞外渗、整合蛋白调高、伴随白细胞激活的生物活性脂类(例如白三烯)的形成和呼吸困难。因此，趋化因子是炎症反应的早期诱因，它引起炎症介质的释放、趋化反应、和向炎症部位或感染部位的细胞外渗作用。
迄今为止，对趋化因子的了解都仅限于一级结构，它们都保留有四个半胱氨酸残基以形成二硫键。对几种趋化因子进行cDNA克隆和生化鉴定显示，此类蛋白有一个长约20-25个氨基酸残基的前导序列，在分泌过程中被切除，生成一条长约92-99个氨基酸残基的成熟多肽。基于保留的半胱氨酸结构域，可将趋化因子家族划分为两类，即C-C趋化因子(β趋化因子)和C-X-C趋化因子(α趋化因子)，前两个保留半胱氨酸要么相连，要么被别的氨基酸残基分隔[Baggiolini,M.and C.A.Dahinden,Immunology Today,15:127-133(1994)]。
C-X-C趋化因子包括大量能够趋化吸引并激活中性白细胞的趋化吸引物，如白介素8(IL-8)、PF4、中性细胞激活多肽2(NAP-2)。C-C趋化因子包括人单核细胞趋化因子蛋白1-3(MCP-1,MCP-2,MCP-3)、RANTES(调节活化，正常T细胞表达和分泌)、巨噬细胞炎症蛋白1α和1β(MIP-1α和MIP-1β)，是单核细胞和淋巴细胞的趋化吸引物和激活剂，但不是中性细胞的趋化吸引物。例如，离体培养中，重组RANTES不仅是记忆T细胞的趋化吸引物，而且是单核细胞的趋化吸引物[Schall,T.J.et al.,Nature,347:669-671(1990)]。最近，还鉴定出一种能吸引淋巴细胞、带有单一半胱氨酸对的，称为淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)的趋化因子[Kelner,G.S.,et al.,Science,266:1359-1395(1994)]。
C-C趋化因子由于其在变应性炎症中的潜在的作用而具有重要性。例如，MCP-1诱导人嗜碱细胞的细胞外渗，导致大量炎症介导物的释放，如组胺和白三烯C4。同样，C-C趋化因子的受体也具有重要性，它们结合趋化因子后引起这些细胞事件。最近有人克隆了一个C-C趋化因子的受体，报道称它结合MIP-1α和RANTES。因此，该MIP-1α/RANTES的受体被称为C-C趋化因子受体1[CKR-1；Neote,K.et.al.,Cell,72:415-425(1993),Horuk,R.et al.,WO94/11504,1994年5月26日发表；Gao,J.-I.et al.,J.Exp.Med.,177:1421-1427(1993)]。一个MCP-1受体也被克隆出来[Charo,I.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:2752(1994)]。据报道这个被称为CKR-2的受体与MCP-1有高亲合力，与MCP-3有低亲合力[Charo,I.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:2752-2756(1994)]。CKR-2有两种存在形式，因为在异型A上引入不同的剪接位点而导致不同的细胞质尾部。异型B的此区域不被剪接，结合及信号传导实验显示它是MCP-1和MCP-3的功能性受体[Charo,I.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:2752-2756(1994)；Myers,S.J.,et al.,J.Biol.Chem.,270:5786-5792(1995)]。最近，有人描述了一种称为CKR-4的新型受体，根据报道，将其注入X.Laevis (Power,C.A.et al.,J Biol.Chem.270:19495-19500(1995))的卵细胞中，作为对MCP-1、MCP-1α和RANTES的应答，该受体cRNA会产生一个钙离子激活的氯离子流。
MCP-1受体(CKR-2)和C-C趋化因子受体1被预言属于具有七个跨膜G蛋白偶连受体的一个超家族[Gerard C.,and Gerard,N.P.,Annu.Rev.Immunol.,12:775-808(1994)；Gerard C.,andGerard N.P.,Curr.Opin.Immunol.,6:140-145(1994)]。G蛋白偶连(蛇根碱)受体的家族包括一大群膜内蛋白，含有七个跨膜区域。这些受体的配体包括多种不同分子，包括小的生物胺分子，如肾上腺素、去甲肾上腺素、多肽，如P物质、神经激肽，以及大的蛋白质，如趋化因子。受体和G蛋白相连，G蛋白是异源三聚体调节蛋白，能结合GTP并能通过偶连受体来介导信号的传导，例如，通过产生细胞内介导物。
两个IL-8受体的cDNA的克隆和测序研究显示，C-X-C趋化因子受体蛋白与七跨膜G蛋白偶连受体蛋白也有序列同源性[Mruphy P.M.and H.L.Tiffany,Science,253:1280-1283(1991)；Murphy et al.,WO93/06299；Holmes,W.E.et al.,Science,253:1278-1280(1991)]。通过克隆鉴明了其他一些趋化性蛋白受体如C5a和细菌甲基化三肽fMLP，他们所编码的蛋白与这些七跨膜G蛋白偶连受体蛋白也有序列同源性[Gerard,N.P.and C.Gerard,Nature,349:614-617(1991)；Boulay,F.et al.,Biochemistry,29:11123-11133(1990)]。尽管已经鉴定并克隆了许多其他的与这种趋化因子受体有显著序列同源、相同组织和淋巴细胞亚群分布的蛋白质，然而这些受体的配体确依然不明。因此，这些受体被称为婴儿期受体。
对其它的基因及其编码的受体的分离和鉴定，以及相应配体的鉴定，都对于理解趋化因子和靶细胞相作用及其引发的细胞事件是十分必要，包括理解白细胞的趋化性和细胞激活。本发明的概述本发明涉及编码一种称为C-C趋化因子受体3(CKR-3或CCR3)的哺乳动物(如人)受体蛋白的分离和/或重组核酸。本发明也关于重组核酸结构体，例如质粒或者逆转录病毒载体，它们包含编码本发明中受体蛋白的整体或其一部分的核酸。这些核酸和结构体被用来制备重组受体蛋白。在另一个实施方案中，核酸编码一个反义核酸，其能够与第二个编码本发明受体蛋白的核酸杂交，若导入细胞，能够抑制受体的表达。
另一方面，本发明涉及蛋白质和多肽，在本文中称为分离的，重组的哺乳动物CKR-3受体蛋白。根据本文的描述，可以在宿主细胞中制备重组CKR-3受体蛋白或多肽。在一个实施方案中，受体蛋白被认定为以高亲合力结合一个或多个趋化因子如趋红素(eotaxin)、RANTES和/或MCP3，和/或能够刺激一种或多种细胞反应(例如，趋化反应、细胞外渗、释放一种或多种炎症介导物)。
利用受体或其部分作为免疫原，或利用表达受体蛋白的细胞，能够制备与受体作用的抗体。这些抗体及其片段在治疗上、诊断和研究上都十分有用，包括受体蛋白的纯化和研究、表达表面受体细胞的鉴定、以及细胞分类或计数。
本发明还涉及鉴定受体配体的方法，以及受体功能的抑制剂(拮抗剂)和增强剂(刺激剂)。在一个实施例中，适宜的宿主细胞是将一个核酸导入细胞使其成为一种合适的工程细胞，能够表达该核酸所编码的受体蛋白或多肽，该宿主细胞被用来鉴定和评价受体功能的配体、抑制剂或促进剂的效力。这样的细胞也可用来评价所表达的受体蛋白或多肽的功能。
根据本发明，能够鉴定受体功能的配体、抑制剂和促进剂并进一步评价它们的治疗效果。如果需要的话，配体和促进剂可以用来刺激通常的受体功能，抑制剂却可以用来减轻或防止受体活性。因此本发明提供了一种全新的抗炎症治疗策略，对于多种炎症疾病或自身免疫疾病很有用，包括为某一个体(例如哺乳动物)给予受体功能的抑制剂。相反，将受体功能的配体或促进剂提供给某一个体来刺激受体活性，提供了一种选择性激活淋巴细胞功能的新途径，对于治疗例如寄生虫感染疾病十分有用。附图的简要说明

图1A-1C说明基因克隆上的一个核苷酸序列，其编码人CKR-3蛋白也叫Eos L2受体(SEQ ID NO:1)，以及通过开放阅读框预测所编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图2A-2B说明编码人CKR-3受体(SEQ ID NO:3)的cDNA所决定的一个核苷酸序列，以及通过开放阅读框预测所编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图3说明一种透内皮趋化实验。一个培养插入子置于容器中，例如24孔板，在孔里形成了第一室和第二室。ECV304内皮细胞生长于插入子内侧的多糖膜上形成单细胞层。对某种物质(例如，趋化因子)应答的待测细胞置于上室，所述的物质置于下室。移去插入子，用适宜的方法检查和计数细胞，就可以通过检测穿过内皮细胞层迁移到下室的细胞来评价趋化性。例如可以用细胞流计收集、检测下室中的细胞(例如，FACS分析，光散射)。
图4是一柱形图，说明人嗜伊红粒细胞应答于不同趋化因子的趋化特性。用标准方法纯化人嗜伊红粒细胞，在24孔透内皮趋化性实验中用显微镜分析其对不同趋化因子的应答。
图5说明用Eos L2转染的多种克隆L1-2前B细胞的FACS实验。来自多于200个克隆的细胞用M2抗-FLAG Mab染色，然后用抗-鼠Ig-FITC(Y轴，细胞数；X轴，荧光强度)。在阴性对照(PAUL001)中，转染细胞用非相关的抗体染色。
图6是一柱形图，说明RANTES和MIP-1α与人嗜伊红粒细胞的结合。在存在或不存在250nM不同的冷趋化因子(MIP-1α、RANTES、IL-8、MCP-1、MCP-3)情况下，纯化的正常人嗜伊红粒细胞与0.1nM125Ⅰ-标记MIP-1α或RANTES(“热”)温育。
图7说明不同的冷趋化因子(RANTES、MIP-1α、MCP-1、MCP-3)抑制125Ⅰ标记RANTES与人嗜伊红粒细胞的结合。人嗜伊红粒细胞与0.1nM放射性标记的RANTES以及明确浓度的冷趋化因子一起温育，每个点的数据是每一个样品测量数据的平均值和标准偏差。
图8是一个柱形图，说明0.1nM125Ⅰ-标记的MIP-3(“热”)或0.1nM125Ⅰ-标记的RANTES(“热”)结合Eos L2转染SF9细胞(cpm，每分钟计数)。(从左至右热Rantes自身；热Rantes+冷Rantes；热MCP-3自身；热MCP-3+冷MCP-3。)图9A-9D说明用MAb LS26-5H12和细胞流计测定在白细胞上对CKR-3的表达。白细胞亚单元用抗CKR-3 MAb LS26-5H12(实线)或者IgG1同型匹配对照抗体(MOPC-21)(阴影面)染色。图9A，嗜伊红粒细胞；图9B,T细胞；图9C，单核细胞；图9D，中性细胞。死细胞用碘化丙啶染色而排除。
图10A-10C说明CKR-3受体快速转染L1.2细胞的细胞表面染色(图10A)，不成功转染L1.2对照细胞的染色(图10B)，或者细胞株E5(一个稳定的L1.2CKR-3转染子)的染色(图10C)，染色用了抗CKR-3单克隆抗体(LS26-5H12，实线)。背景染色用对照单克隆抗体MOPC-21(阴影面)。
图11A-11D说明放射性标记人趋红素对E5细胞系(一个稳定的用CKR-3受体转染的L1-2细胞系，图11A)或对人嗜伊红粒细胞(图11B)的竞争性配体结合。细胞与0.6nM125Ⅰ-标记的趋红素以及不同浓度的未标记的趋红素(0),RANTES(▲)，或MCP-3(□)一起温育。室温下60分钟后，洗涤细胞层并计数，根据数据计算未标记趋红素各点的竞争值(图11C,E5细胞系；图11D，嗜伊红粒细胞)。
图12是一个矩形图，说明不同趋化因子对人趋红素与E5细胞系结合的抑制作用。E5细胞系(稳定的L1-2/CKR-3转染子)与0.6nM放射性标记的趋红素和250nM未标记趋化因子的一起温育，或没有竞争试剂。
图13A-13C是一个矩形图，说明L1.2细胞和L1.2受体转染子的趋化性。1×106E5细胞(稳定的L1-2/CKR-3转染子)(图13A)，亲代L1.2细胞(图13B)，或IL-8 RB L1.2受体转染子细胞系LSLW-2(图13C)，被置于上室，各种给定浓度的趋化因子被置于下室。迁移四个小时，并对迁移到下室的细胞进行计数。全部实验都重复进行，结果代表至少三次独立实验。X轴是趋化因子，Y轴是迁移细胞的数目，Z轴是趋化因子的浓度。
图14A-14B说明两个不同个体的嗜伊红粒细胞趋化性反应。类似于CKR-3 L1.2转染子的应答反应，发现了嗜伊红粒细胞对趋红素、RANTES、MCP-3和MCP-1作出趋化性应答的供体-供体的变化。从血中纯化嗜伊红粒细胞，然后评价其对各种不同浓度趋化因子的趋化性应答。各数值来自于至少四次具有代表性的实验，使用的是相同的两个血液供体。
图15说明125Ⅰ-标记的RANTES与稳定的细胞系(A31-293-20)细胞膜的结合，该细胞系由A31cDNA克隆(以中间点积分)转染293细胞得来，其结合结果与结合于未转染293细胞(实心圈)的细胞膜实验进行比较。
图16是一个矩形图，说明125Ⅰ-标记的MCP-3与稳定的细胞系(A31-293-20)细胞膜的结合，该细胞系由A31cDNA克隆转染293细胞得来，其结合结果与结合于未转染293细胞的细胞膜实验进行比较。分别在没有冷MCP-3(0nM)或者在有冷MCP-3(100nM)条件下，测定标记的MCP-3与转染细胞(A31-20)或未转染细胞(UT293)的细胞膜的结合。
图17是一个矩形图，说明结合的特异性，通过测定125Ⅰ-标记的MCP-3的结合量来评价，也可以用取自转染细胞(A31-20)或未转染细胞(UT293)的细胞膜的冷MCP-3代替。
图18A是稳定的L1.2转染子荧光密度的FACs图谱，能够表达CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CXCR1(IL-8RA)，或者CXCR2(IL-8RB)，用抗-CCR3 mAb 7B11染色。全部L1.2转染子染色的阴性对照(未给出)类似于7B11对CCR1转染子的染色。
图18B是人嗜伊红粒细胞、淋巴细胞、T胚细胞、单核细胞、和粒细胞的FACs图谱，用mAb 7B11染色，染色图谱代表至少四次实验结果。
图18C是一个矩形图，说明放射性标记人趋红素、RANTES、MCP-2、或MCP-3与L1.2CCR3或CCR1转染子的结合，以及用mAb 7B11或冷趋化因子抑制。细胞与下列物质进行温育0.1nM125Ⅰ-标记的趋红素、RANTES、MCP-3、以及50μl或100μg/ml不相关mAb(MOPC21)、mAb 7B11、或250nM冷趋化因子。室温60分钟后，洗涤细胞层并计数。
图19说明mAb 7B11抑制放射性标记趋红素，RANTES和MCP-3与人嗜伊红粒细胞的结合。人嗜伊红粒细胞与0.1nM125Ⅰ-标记的趋红素、-RANTES、-MCP-3、和不同浓度mAb 7B11一起温育。室温60分钟后，洗涤细胞层并计数。用KaleidaGraph分析数据，计算出趋红素的IC50为25.7ng/ml，对RANTES为13.7ng/ml，对MCP-3为18.8ng/ml。图的左下方示出250nM冷趋化因子的抑制水平。
图20A说明mAb 7B11抑制嗜伊红粒细胞趋向趋红素的剂量效果。细胞迁移的背景水平(没有趋化因子)以图标田表示(左下方)。
图20B是一个矩形图，说明5μg或20μg/ml的7B11 mAb抑制嗜伊红粒细胞趋向不同趋化因子。在图20A和图20B的实验中，1×106人嗜伊红粒细胞被置于上室，10nM的趋化因子被置于下室，不同浓度7B11 mAb被置于上室，细胞向下室迁移1.5个小时，用细胞流计测定，结果代表至少四次独立的实验。
图21是一系列轨迹，说明7B11 mAb抑制人嗜伊红粒细胞应答趋红素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4时[Ca2+]i的改变，人嗜伊红粒细胞用Fura-2标记，被下列物质依次激活(A)mAb,40秒后(B)趋化因子，100秒后(C)C5a。使用荧光光谱仪记录[Ca2+]i的荧光改变。该轨迹代表至少五次独立的实验，分别用来自于不同供体的嗜伊红粒细胞。上面的各图使用了非相关对照mAb(MOPC-21)，下面各图中使用了mAb 7B11。所用的抗体终浓度为6.4μg/ml，所使用的趋化因子为趋红素10nM,RANTES 20nM,MCP-2200nM,MCP-3200nM,MCP-410nM,CSa为400pM。
图22A是一个FACs图谱，说明新鲜分离于一个健康对象的嗜伊红粒细胞上IL-8受体的表达。嗜伊红粒细胞用mAb染色，CXCR1(实线)，CXCR2(点标线)，或者对照mAb(阴影)，用细胞流计分析。
图22B是一个FACs图谱，说明用IL-5处理过的嗜伊红粒细胞上IL-8受体的表达。嗜伊红粒细胞和IL-5一起培养5天，如图22A用mAb染色。
图22C是一个FACs图谱，说明分离于一个嗜伊红粒细胞性对象的嗜伊红粒细胞上IL-8受体的表达。如图22A和图22B用mAb染色。
图22D说明mAb 7B11对和IL-5一起培养了5天的嗜伊红粒细胞应答于不同趋化因子发生[Ca2+]i改变的抑制。方法同图21所述，所使用的mAb的和趋化因子为1．对照mAb，趋红素，C5a；2．7B11，趋红素，C5a；3．对照mAb,RANTES,C5a；4．7B11,RANTES,C5a；5．对照mAb,IL-8,C5a；6．7B11,IL-8,C5a。实验结果代表至少三次独立的实验。
图23A是一个矩形图，说明单克隆抗体7B11对趋红素、RANTES、和MCP-3所诱导的嗜伊红粒细胞过氧化物酶(EPO)释放的抑制作用，浅色柱显示分别由10nM趋红素，100nM趋红素，100nM RANTES,100nM MCP-3所诱导的EPO释放量。黑柱显示当10μg/ml 7B11存在于嗜伊红粒细胞脱粒实验中时，EPO的释放量。标记为“空白”的柱对应于一个无趋化因子、无抗体(缓冲液)的对照。
图23B是一个矩形图，说明mAb 7B11对C5a诱导的嗜伊红粒细胞过氧化物酶(EPO)释放的影响效果。浅色柱显示1nM C5a所诱导的EPO释放量，黑柱显示当10μg/ml 7B11存在于嗜伊红粒细胞脱粒实验中时，EPO的释放量。
图24A说明通过测定嗜伊红粒细胞过氧化物酶(EPO)和嗜伊红粒细胞阳离子蛋白质(ECP)的释放，了解趋红素所诱导的嗜伊红粒细胞脱粒过程。
图24B说明通过测定嗜伊红粒细胞过氧化物酶(EPO)和嗜伊红粒细胞阳离子蛋白质(ECP)的释放，了解C5a所诱导的嗜伊红粒细胞脱粒过程。
图25说明趋红素刺激嗜伊红粒细胞释放过氧化物酶。
图26说明趋红素刺激嗜伊红粒细胞释放葡萄糖醛酸酶。
图27说明趋红素刺激人嗜伊红粒细胞释放芳香硫酸酯酶。
图28说明在全血中嗜伊红粒细胞和嗜碱性细胞上CCR3的表达。全血用7B11-FITC染色，再如实施例12用链霉素量红染色，细胞流计分析。
图29是一个矩形图，说明为应答趋化因子人嗜伊红粒细胞释放组胺。
图30A说明为应答趋红素和MCP-4，嗜碱性细胞的趋化性。
图30B是一个矩形图，说明抗-CCR3 mAb 7B11对应答于趋红素和MCP-4嗜碱性细胞的趋化性的阻滞作用。本发明的详细描述这里将要详细说明的是，编码一种全新的、被称为Eos L2或者C-C趋化因子受体3(CKR-3)、也即“CCR3”的人受体的核酸，已经被分离出。已经鉴定该核酸片段的人体基因和cDNA克隆。从一名患有高嗜伊红粒细胞综合症病人采集嗜伊红粒细胞，由此构件嗜伊红粒细胞的cDNA文库，从中分离到cDNA克隆。对此克隆的序列分析揭示了基因内包含一个长1065个核苷酸的开放阅读框，其编码推测的长355个氨基酸残基的蛋白质(图1A-1C和2A-2B；SEQ ID NOS:2和4)，其和别的C-C趋化因子受体有氨基酸序列同源，该蛋白被认为是一种G蛋白偶连受体，有一个类似的七跨膜区域的结构。
这个由CKR-3基因或者cDNA克隆编码的推测的蛋白质包含四个半胱氨酸残基，在每一个胞外区域都有一个，位置分别是24、106、183、273(SEQ ID NOS:2和4)。所有的趋化因子受体在这些位点都保留了半胱氨酸，包括CKR-1、CKR-2、CKR-4、IL8-RA和IL8-RB。此外，该受体还包含一个氨基酸结构域，DRYLAIVHA(残基130-138)(SEQ ID NOS:2和4)，在其他C-X-C和C-C趋化因子受体也高度保留，推测属于一种细胞内蛋白。有两个一致的蛋白激酶C磷酸化位点[Kishimoto,A.,et al.,J.Biol.Chem.,260:12492-12499(1985)；Woodgett,J.R.,Eur.J.Biochem.,161:177-184(1986)]，其中一个在第三个细胞内环上，氨基酸位点为231，另一个在细胞质尾部的333位点。另外，在细胞质尾上有八个丝氨酸/苏氨酸残基，作为G-蛋白偶连受体激酶的磷酸化位点，例如从中性细胞分离的激酶[Haribabu,B.and R.Snyderman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:9398(1993)]或者别的相关家族成员[Benovic,J.L.and Gomez,J.,J.Biol.Chem.,268:19521-19527(1993)；Kunapuli,P.,and Benovic,J.L,.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5588-5594(1993)]。丝氨酸/苏氨酸富集的细胞质尾也是趋化因子受体的共同特点。不象CKR-1、CKR-2、CKR-4、IL-8RA和IL-8RB受体，CKR-3在任何一个细胞外区域都不包含N-连接的糖基化位点。CKR-3受体完全不同于C-C趋化因子受体1，也被称为MIP-1α/RANTES受体。
从基因组和cDNA文库获得的核酸序列都是线状的，但有如下不同之处，两种序列在启始密码子的上游发生分歧(图2A的位点78)。基因组克隆有一个内涵子，分隔开启动子和编码区域中绝大多数5’端未翻译区。这种基因组排列方式类似于在其他七跨膜趋化因子受体[Gerard,N.P.,et al.,Biochemistry,32:1243-1250(1993)；Murphy,P.M.,et al.,Gene,133:285-290(1993)]，包括IL-8RA和RB[Ahuja,S.K.,et al.,J.Biol.Chem.,269:26381-89(1994)；Sprenger,H.,et al.,J.Biol.Chem.,269:11065-11072(1994)；Sprenger,H.,et al.,J.Immunol.,153:2524-2532(1994)]以及CKR-1[Gao,J.L.,et al.,J.Exp.Med.,177:1421-1427(1993)]。除此之外，检查基因组在分歧点附近的序列，发现规范的剪接受体序列。
启始序列信息揭示，两个区域里的cDNA序列存在边框漂移，其原因是，先发生一个碱基的插入，再发生一个碱基的缺失，或者先发生一个碱基的缺失而后再发生一个碱基的插入。这种替换导致了预测蛋白质分别在位点263-266和276-279出现四个相邻氨基酸的差异。其他不同导致了在预测蛋白质位点182、196、197、315的氨基酸差异。SEQ ID NOS:5中的核苷酸序列是一相同序列，包括两个克隆中都有的区域，用启始核苷酸序列简单排列(碱基连碱基)就可以构建该结构。SEQ ID NOS:6中存在于基因组和cDNA克隆之间的启始氨基酸差异，用Xaa标出，代表SEQID NOS:5的预期蛋白质。然而，进一步的序列分析发现，开放阅读框的核苷酸序列仅仅在对应于图2B核苷酸918-919的位点有所不同。基因组克隆在此位点是一个CG，而cDNA克隆是GC。因此，基因组克隆在位点276编码苏氨酸(ACG),cDNA克隆则编码丝氨酸(AGC)。这种差异是由于序列的不确定性，或者是在逆转录过程中在cDNA导入了错误。也有可能，这种保留的替换(丝氨酸/苏氨酸)是由于个体之间的多态性。另一种解释是，病人嗜伊红粒细胞的受体基因发生突变，而制备cDNA文库的RNA又取自于此。
利用受体N端合成多肽技术，制备了对人源C-C趋化因子受体3有特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。利用一种单克隆抗体(LS26-5H12)进行FACS(荧光激活细胞分类)，发现人嗜伊红粒细胞上此受体的显著表达，而不是白细胞上面的表达，如单核细胞，中性细胞，淋巴细胞，T细胞，T胚细胞(通过CD3 MAb激活来制备)(图9A-9D)。用来源于高度纯化的白细胞亚单元RNA的Northern杂交可以证实这种表达方式。然而在一些实验里，T淋巴细胞中可以检测到CKR-3mRNA或者受体，因此，有可能的是CKR-3在T淋巴细胞亚单元进行表达(实施例5)。此外，如本文所述，还产生了特异于人源C-C趋化因子受体3的单克隆抗体(实施例10)。该mAb也叫7B11，是一种人源C-C趋化因子受体3的抗体拮抗物，执行受体的功能。7B11杂交细胞系依据Budapest条款于1996年9月25日存放于美国典型培养物中心(American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,20852，保藏号HB-12195，保藏人LeukoSite,Inc.,215 First Street,Cambridge MA02142,U.S.A.)。
基因组和cDNA克隆也在多种系统上进行过表达。抗体被用来检测已转染哺乳动物细胞和杆状病毒转染的昆虫细胞上基因组克隆抗体的表达。构建出表达CKR-3的哺乳动物细胞的稳定转染子，结果显示所编码的受体高亲合力地特异结合放射性标记的趋红素，能够与在嗜伊红粒细胞发现的结合力相比较。用转染的哺乳动物细胞进行的研究，显示此受体同样也能高亲合力地特异结合RANTES和MCP-3，然而别的供试CC或CXC趋化因子就不是这个样子了。下面的实验结果与这个结合数据相吻合，鼠B淋巴细胞系产生的受体转染子在趋化性实验中，应答趋红素、RANTES和MCP-3，作出迁移反应，但对其他供试趋化因子没有反应。在几种异源系统中表达时，所用条件下人受体不显著结合MIP-1α。除此之外，用嗜伊红粒细胞做的趋化性和配体结合实验，显示RANTES和MCP-3通过一个受体与嗜伊红粒细胞结合，该受体不同于C-C趋化因子受体、MIP-1α/RANTES受体。
MIP-1α作为一种嗜伊红粒细胞趋化因子的作用一直就是有争议的。一些研究人员检测到了趋化反应[Rot,A.,et al.,J.Exp.Med.,176:1489-1495(1995)]，而另一些却没有检测到[图4，实施例1；Ebisawa,M.,et al.,J.Immunol.,153:2153-2160(1994)；andPonath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,(1996)]。十分有趣的是，MIP-1α是老鼠的一种嗜伊红粒细胞趋化因子，并且表现为通过鼠CKR-3同系物介导，其也能够结合趋红素并发生信号[Post,T.W.,et al.,J.Immunol.,155:5299-5305(1995)；该文献的教导都通过在此引述而全文合并于本文]。
利用本发明的蛋白质和抗体，不仅能够鉴定更多表达CKR-3受体的细胞类型(例如，白细胞，嗜碱性细胞)，而且能够鉴定更多配体。例如，如同本文所述，利用7B11已经证实嗜碱性细胞表达CCR3。根据本发明，可以评估其他趋化因子结合哺乳动物CKR-3受体的能力。
编码一种新受体的克隆的基因克隆和鉴别实验，可证明在诸如趋红素，RANTES,MCP-3等诱导下能够作出结合反应与介导趋化性反应的CKR-3受体的分离与鉴别实验，都暗示了这种受体属于七跨膜G蛋白偶连受体家族中的一员，参与应答趋化因子时作出的选择性白细胞趋化过程和激活过程。CKR-3受体或CCR3受体及其哺乳动物同系物不同于MIP-1α/RANTES受体和MCP-1受体[即，它们是不同于C-C趋化因子1(CKR-1)和MCP-1受体(CKR-2)及其类似物的受体]。
因为趋化因子受体在应答于趋化因子选择性诱导白细胞趋化作用和白细胞激活中的作用，所以趋化因子受体在白细胞迁移作用中扮演重要角色，尤其是伴随炎症发生的迁移作用。在炎症和感染位点产生的趋化因子，将特异性地从循环系统吸引某种白细胞亚类型富集到炎症部位。接下来，趋化因子结合到白细胞趋化因子受体上，激活整合蛋白，通过白细胞整合蛋白和内皮细胞黏附分子，白细胞紧密黏附到内皮细胞上。白细胞变得扁平，穿过内皮迁向炎症部位。在某些场合，白细胞对于组织和炎症部位的特异性，决定于趋化因子-受体相互作用的水平，而不是整合蛋白与细胞黏附分子之间黏附作用的水平。
对于嗜碱性细胞和嗜伊红粒细胞，RANTES和MCP-3都属于最强有力的趋化性细胞因子。另据报道，RANTES是一种T淋巴细胞亚类-记忆T淋巴细胞的趋化因子。如本文所述，RANTES和MCP-3可以诱导嗜伊红粒细胞的趋化反应。CKR-3受体蛋白质也能够高亲合力地与RANTES和MCP-3结合。
如本文进一步所述，CKR-3以高亲合力特异性结合趋红素(可与嗜伊红粒细胞的结合亲合力相比)，CKR-3受体在其表达上被严格限制。尽管已经鉴别出许多嗜伊红粒细胞的趋化因子，例如RANTES和MCP-3[Baggiolini,M.and Dahinden,C.A.,Immunol.Today,15:127-133(1994)；Dahinden,C.A.,et al.,J.Exp.Med.,179:751-756(1994)；Kameyoshi,Y,et al.,J.Exp.Med.,176:587-592(1992)；Rot,A.,et al.,J.Exp.Med.,176:1489-1495(1995)]，以及PAF、C5a、IL-16[Wardlaw,A.J.et al.,J.Clin.Invest.,78:1701-1706(1986)；Gerard,N.P.,et al.,J.Biol.Chem.,264:1760-1765(1989)；Rand,T.H.,et al.,J.Exp.Med.,173:1521-1528(1991)]，这些趋化因子也能够诱导其他白细胞类型的迁移作用。相比之下，趋化因子中的趋红素，最初发现于豚鼠接着在鼠和人都有发现的一种强有力的嗜伊红粒细胞趋化因子，对于嗜伊红粒细胞是有选择性的趋化作用[Jose,P.J.,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,205:788-794(1994)；Jose,P.J.,et al.,J.Exp.Med.,179:881-887(1994)；Rothenburg,M.E.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92:8960-8964(1995)；Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97(3):604-612(1996)]。另外，趋红素结合于CKR-3并通过他高度可信地传递信号，相比之下，趋化因子例如MCP-3除了结合CKR-3外还结合CKR-1和CKR-2[Ben-Baruch,A.,et al.,J.Biol.Chem.,270:22123-22128(1995)]，或者MIP-1α，其结合CKR-1和CKR-4[Neote,K.,et al.,Cell,72:415-425(1993)；Power,C.A.,et al.,J.Biol.Chem.,270:19495-19500(1995)]。CKR-3在嗜伊红粒细胞上受限制的表达，以及趋红素结合CKR-3的可信度，为嗜伊红粒细胞在组织里选择性地富集和迁移提供了一种机制。从这个角度来看，组织内趋红素的生成将导致选择性的嗜伊红粒细胞富集；把趋红素注入到恒河猴的皮肤内，引起选择性的嗜伊红粒细胞迁移。另外，在体内培养时，趋红素以低于RANTES十倍的量富集嗜伊红粒细胞，类似于体外培养实验中CKR-3转染子的趋化作用[Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97(3):604-612(1996)]。
根据本发明，通过抑制或者促进受体功能，例如结合，信号或刺激细胞应答，能够调整哺乳动物CKR-3受体的功能，如此便提供了一种抑制或促进白细胞介导炎症作用的行之有效的和选择性的途径，尤其是嗜伊红粒细胞、嗜碱性细胞和/或T细胞。例如那些在这里已经鉴定并被说明过的CKR-3受体功能的配体、抑制剂、促进剂、都能够为了医疗目的用来调整白细胞功能。
嗜伊红粒细胞不表达MIP-1α受体，也不表达显著量的MCP-1受体。此外，如上所述，趋红素和RANTES属于嗜伊红粒细胞最强有力的趋化因子，趋红素和RANTES特异性地、高亲合力地与CKR-3受体结合。作为嗜伊红粒细胞和淋巴细胞的一种主要的趋化因子受体，CKR-3受体是干涉或促进嗜伊红粒细胞、嗜碱性细胞和/或T淋巴细胞功能过程的重要靶物质。根据本发明的方法，已经鉴别的能够抑制或促进CKR-3受体功能的物质，例如配体、抑制剂或促进剂，对于为医疗目的调整嗜伊红粒细胞、嗜碱性细胞和/或T淋巴细胞功能的过程尤其实用。
例如，如同本文中所述，抗-CCR3抗体7B11抑制趋红素和CCR3结合所诱导的嗜伊红粒细胞脱粒作用(实施例11)。这里同样也证实了，7B11不仅抑制嗜碱性细胞应答趋化因子时组胺的释放，还抑制嗜碱性细胞趋向趋红素和MCP-4(实施例13)。趋化因子 其它名称 已经鉴定的配体受体CCR1 CCCKR1 MIP-1α,RANTES,MCP-3CCR2a,b MCP-1Ra,b MCP-1,MCP-3,MCP-4CCR3 CKR-3 趋红素，RANTES,MCP-2,3,4CCR4 RANTES,MIP-1α,MIP-1CCR5 CCCKR5 RANTES,MIP-1α,MIP-1βCXCR1IL-8RA,IL-8R1 IL-8CXCR2IL-8RB,IL-8R2 IL-8,GROα,NAP-2,ENA-78CXCR3无 IP-10,MigCXCR4Fusin/humstr/Lestr SDF-1核酸，结构体和载体本发明涉及分离的和/或重组的(包括相当高纯度的)核酸，其所含序列能够编码被标为Eos L2或C-C趋化因子受体3(CKR-3，在这里也称CCR3)的哺乳动物(如人)受体蛋白或者他的一部分。在一个实施例里，该核酸或其一部分编码一个蛋白质或多肽，它们具有至少一个哺乳动物C-C趋化因子受体(例如哺乳动物CKR-3受体)的功能特征，例如结合活性(例如，配体、抑制剂和/或促进剂结合)，信号活性(激活哺乳动物G蛋白，诱导细胞质自由钙离子[Ca2+]i浓度的迅速及短暂升高)，和/或刺激细胞应答(例如，刺激趋化反应、细胞外渗或白细胞释放炎症介导物、整合蛋白活化)。本发明还特别涉及分离的和/或重组的核酸或其一部分，所含片段编码哺乳动物CKR-3受体或其一部分。
本发明更进一步涉及分离的和/或重组的核酸，其特征为(1)能够和下列物质杂交(a)含有序列SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5的核酸，(b)SEQ ID NO:1或3或5的互补物，(c)包含编码区(SEQ ID NO:1的核苷酸181-1245,SEQID NO:3的核苷酸92-1156,SEQ ID NO:5的核苷酸15-1079)的前述物质的一部分，或者(d)任意一个前述部分的RNA对应物，其中U替换T；或者(2)编码多肽的能力，所编码的多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或者功能相似物(即，具有受体的一个或多个天然的或生理的配体结合活性)，和/或应答于配体结合的激活功能的多肽(例如，趋化因子，白细胞所引起的细胞外渗，或释放炎症介导物)；或(3)兼有两种活性。
在一个实施方案里，SEQ ID NO:2、4或6及其功能相似物之间的氨基酸相同序列百分比为70％(≥70％)。在一个更好的实施方案里，SEQ ID NO:2、4或6功能相似物与SEQ ID NO:2、4或6之间有80％的序列同源。优选地，SEQ ID NO:2、4或6功能相似物与SEQ ID NO:2、4或6之间有90％的氨基酸系列同源，或者更优选地，至少95％。符合此标准的分离的和/或重组的核酸包括有与天然存在的哺乳动物CKR-3受体或一部分、或与天然存在的序列的变体序列有同源性的序列。这些变体包括由于一个或多个残基添加、缺失或替换所产生的突变体，一个或多个残基被修饰了的被修饰核酸(例如，DNA或RNA类似物)，以及含有一个或多个修饰残基的突变体。
在高度严紧或中度严紧条件下用杂交手段可以检测或分离到这种核酸。例如，核酸杂交的“高度严紧条件”和“中度严紧条件”解释于现代分子生物学手册2.10.12-2.10.16各页(尤其2.10.8-11各页)和6.3.1-6各页(Ausubel,F.M.et al.,eds.,Vol.1,Suppl.26,1991)，其中的教导通过在此引述而合并于本文中(还可见实施例2)。一些因素例如探针长度，碱基组成，杂交序列间错配百分比，温度和离子强度都将影响核酸的杂交。因此，可以根据经验决定高度和中等严紧条件，部分依赖用于与未知的核酸进行同源性比较的已知的DNA的特征。
根据与核酸序列SEQ ID NO:1、3、5或其中任何一个的互补物的杂交能力而定性的分离的和/或重组的核酸(在高度严紧或中度严紧条件下)，可以进一步编码至少有一个哺乳动物C-C趋化因子受体的功能(如哺乳动物CKR-3受体)的蛋白质或多肽，所述的功能包括例如结合活性(例如，与配体、抑制剂和/或促进剂结合)，信号活性(例如，激活哺乳动物G蛋白，诱导细胞质自由钙离子[Ca2+]i浓度的迅速及短暂升高)，和/或刺激细胞反应(例如，刺激趋化反应、胞外渗透、白细胞对炎症介导物的释放、整合蛋白的活化)。
利用应答于受体结合G蛋白质活性的酶学实验可以检测杂交核酸编码的蛋白或多肽的信号功能(利用膜碎片，G蛋白质的α亚基上GTP与GDP的交换)。能够进一步检测G蛋白质的偶连，在所用的检测中，G蛋白的刺激被用G蛋白质特有的抑制剂(例如Bordetella pertussis毒素)对细胞或适宜的细胞组分(例如，膜)进行处理或预处理所封闭[Bischoff,S.C.et al.,Eur.J.Immunol.23:761-767(1993)；Sozzani,S.et al.,J.Immunol.147:2215-2221(1991)]。
通过趋化性或介质释放的标准实验可以检测杂交核酸编码的蛋白质或多肽的刺激功能，使用的是表达这种蛋白或多肽的细胞，监测趋化性，细胞外渗(例如嗜伊红粒细胞过氧化物酶，β-葡萄糖醛酸酶之类的酶)，或应答于配体或促进剂的介导物释放(如趋红素，RANTES,MCP-3之类的趋化因子)。
通过结合检测或结合抑制实验可以检测杂交核酸编码的蛋白质或多肽的结合功能，所用的膜片含有受体或者细胞表达受体[见实施例9；Van Riper et al.,J.Exp.Med.,177:851-856(1993)；Sledziewski et al.,U.S.Patent No.5,284,746(Feb.8,1994)]。因此，所编码的蛋白或多肽结合配体的能力，如结合趋红素、RANTES、MCP-3、抑制剂和/或促进剂的能力都可以被检测。用其他适当方法也能够检测哺乳动物CKR-3受体特有的功能。
这些方法自己或与其他合适方法相结合，也能够用于对具有SEQ ID NO:2,4,6或功能相似物的氨基酸序列的、并具有可被检测的活性的多肽的编码核酸的鉴别和/或分离的程序中。编码SEQ ID NO:2,4,6的具有特定功能的多肽部分的分离核酸的部分，也能够用该法鉴定或分离。
本发明的核酸可以用来制备蛋白质或多肽。例如，拥有编码哺乳动物CKR-3受体的全部或部分核酸，与SEQ ID NO:1,3,5序列杂交的DNA，或SEQ ID NO:1,3,5中任意一个的互补物，都能够整合到不同结构体和载体中，进一步进行序列操作或在适当宿主细胞中制备所编码的蛋白质。
这里所指的“分离”的核酸是指从基因组DNA及其来源的细胞RNA中分离的核酸(存在于细胞内或核酸混合物中，如基因文库)，也可以经过进一步的加工。“分离”的核酸包括使用这里所描述方法、类似方法或其他合适方法而获得的核酸，包括化学合成的核酸与高纯度核酸，联合使用化学的和生物的方法获得的核酸，以及分离的重组核酸。这里所指的“重组”核酸是指利用重组DNA方法学制备的核酸，包括依赖于人工重组过程得到的核酸，例如多聚酶链式反应(PCR)和/或用限制性内切酶克隆到载体中。“重组”核酸也指在细胞里由天然机理发生的重组事件形成的核酸，但是在细胞导入了核酸后需要筛选，得到理想的重组体。反义结构在另一个实施方案里，所用核酸是一段反义核酸，与包含有意义链的目标分子完全或部分互补，能够与目标分子杂交。靶可以是DNA或他的RNA对应物(在DNA中的T碱基换成RNA中U)。用已知的方法或其他合适方法导入细胞后，反义核酸能够封闭有意义链基因的表达。反义核酸可用标准技术制备。
在一个实施方案里，反义核酸能够完全或部分与靶核酸互补以及杂交，其中的靶核酸能够与互补于SEQ ID NO:1、3、5的序列或其RNA对应物进行杂交。例如，反义核酸能够与靶核酸杂交，后者含有序列SEQ ID NO:5或其足够进行杂交的一部分。在另一个实施方案里，反义核酸能够完全或部分互补于编码哺乳动物CKR-3受体(例如，人Eos L2受体)的靶核酸，并杂交。
反义核酸可以用于多种目的，包括研究和治疗。例如，包含反义核酸的一个结构体能够被导入合适的细胞中抑制受体的表达。这种细胞提供了一种有价值的对照细胞，例如，在用母代细胞或其他相关细胞类型评估受体-配体结合特异性。另一方面，该结构体被导入一些或全部的哺乳动物细胞。反义核酸抑制受体的表达，含有这种结构体的细胞中的CKR-3受体介导的炎症过程同样也被抑制了。因此，利用本发明的反义核酸可以用来治疗炎症疾病。合适的含有这种反义核酸的实验动物为缺少白细胞功能提供了一个有用的模型，尤其是缺少嗜伊红粒细胞的模型，也为评价CKR-3受体功能提供了更进一步的信息。这种动物为感染性疾病提供了一种十分有价值的模型，便于研究白细胞的功能，例如在宿主防卫中嗜伊红粒细胞和/或T淋巴细胞的作用。哺乳动物核酸由于在理解和治疗炎症和自体免疫疾病以及寄生虫感染方面的长足进展将给人们带来巨大利益，人CKR-3或CCR3是本发明的实验中使用最多的种类。然而，在分离和控制人CKR-3的基因组以及cDNA中所使用的，用来构建载体和宿主细胞株的，以及制备并使用受体和片段的方法，都能够用在别的哺乳动物上，包括但不限于灵长目(除人之外的灵长目动物，如猴子，比如cynomolgus猴)，牛科(如乳牛)，绵羊科(如绵羊)，马(如马)，犬科(如狗)，猫科(如家猫)，和啮齿类(如豚鼠，鼠类如家鼠，大鼠)。这里所描述的人CKR-3cDNA或基因组克隆，或者充足的局部，不论是分离的和/或重组的或合成的，包括PCR制备的编码序列片段，都能够作为探针来检测和/或回收相似的CKR-3基因或别的从其他哺乳动物来的相关受体基因(如新的C-C趋化因子受体基因)(通过杂交，PCR或别的方法)。用这里所描述的技术或别的方法都能够实现上述目标。蛋白质和多肽本发明也涉及由本发明的核酸所编码的蛋白质和多肽。本发明的蛋白质和多肽可以是分离和/或重组的。这里所说“分离”的蛋白质或多肽是指纯度超过在哺乳动物细胞内的水平的纯化的蛋白质或多肽。“分离”的蛋白质或多肽包括用这里所述方法，相似方法或其他合适方法制备的蛋白质或多肽，包括高纯度蛋白质或多肽，化学合成制备的蛋白质或多肽，化学以及生物的联合方法制备的蛋白质或多肽，以及分离的重组蛋白质或多肽。这里所指的“重组”的蛋白质或多肽是利用重组核酸表达的蛋白质或多肽。
在一个优选的实施方案里，蛋白质或多肽有哺乳动物CKR-3受体的至少一个特性，例如结合特性(配体、抑制剂和/或促进剂的结合)，信号活性(激活哺乳动物G蛋白，诱导细胞质自由钙离子[Ca2+]i浓度的迅速及短暂升高)，和/或刺激细胞反应(刺激趋化反应，细胞外渗或白细胞释放炎症介导物，整合蛋白活化)。这些蛋白质被称为哺乳动物源的CKR-3蛋白或者哺乳动物趋化因子受体3蛋白，包括天然存在的哺乳动物CKR-3受体，这些蛋白的变体和/或其局部。变体包括多形态变种和天然或人为的突变体，通过一个或多个氨基酸残基的添加，缺失或替换，或者一个或多个残基修饰的被修饰多肽，以及包括一个或多个修饰残基的突变体。一个例子是结合趋红素的哺乳动物CKR-3受体蛋白。
在一个特别优选的实施方案里，类似天然发生的哺乳动物CKR-3受体蛋白或多肽，本发明的哺乳动物CKR-3受体蛋白对一个或多个天然的或生理的配体有结合功能，和/或应答于配体结合的激活性能，以便能够刺激细胞反应(刺激趋化反应，细胞外渗或白细胞释放炎症介导物，整合蛋白活化)。例如，在人趋化因子受体3蛋白的情况，分离的CKR-3受体蛋白能够结合一个或多个天然或生理的配体。如本文所示，分离的人CKR-3受体蛋白特异性高亲合力地结合RANTES和趋红素，特别是结合MCP-3。在一个实施方案中，人CKR-3受体蛋白或多肽也能够刺激白细胞对配体结合作出应答，启动趋化反应，细胞外渗，或者白细胞释放炎症介导物。
本发明更进一步涉及融合蛋白，其包含哺乳动物CKR-3受体蛋白或多肽(如上所述)作为第一基团，与第二基团相连，第二基团并非是自然状态下哺乳动物CKR-3受体所有。因此，这个第二基团可能是氨基酸或者多肽。第一基团可能在N端位置，C端位置，或在融合蛋白的内部。在一个实施方案里，融合蛋白包含人CKR-3受体作为第一基团，第二基团包含连接序列和亲合配体(例如，酶，抗原，附加表位)。
融合蛋白可以用许多不同的方法来制备。例如，一些实施例里将CKR-3基因或其一部分插入一个合适的表达载体，例如BluescriptⅡSK+/-(Stratagene),pGEX-4T-2(Pharmacia),pET-15b(Novagen)。得到的结构体再导入合适的宿主细胞进行表达。表达后，用合适的亲合基质从细胞裂解液中分离纯化融合蛋白[参见，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M.et al.,eds.Vol.2,Suppl.26,pp.16.4.1-16.7.8(1991))]。另外，亲合标记提供了在融合蛋白中检测CKR-3受体蛋白或多肽的方法。例如，带有抗原或表位亲合标记的融合蛋白在细胞表面表达或者存在于细胞特定部位，能够用适当的抗体检测(见实施例3)。
本发明也涉及哺乳动物CKR-3受体的分离的和/或重组部分，例如人CKR-3受体的一部分。如在下面详细描述的那样，哺乳动物CKR-3受体的部分能够被制备(合成多肽)，并用来制备抗体。在一个实施方案里，某个哺乳动物CKR-3受体的分离的和/或重组部分(如多肽)，至少有一个免疫特征。如本文中，对受体的一部分而言，所述的免疫特征包括免疫反应性(由本发明中哺乳动物CKR-3受体蛋白或一部分刺激生成的抗体的结合)，免疫原性(在一个适当免疫方法里诱导抗体反应)，和/或交叉反应性(诱导生成与特定的哺乳动物受体反应的抗体)。还可以产生CKR-3受体的带有哺乳动物的至少一个特有功能的部分，例如结合活性，信号活性或刺激功能(刺激细胞反应)。对哺乳动物G蛋白偶连受体的结构和功能的深入研究，使我们能够将哺乳动物CKR-3受体划分为多个功能区域[参见，Lefkowitz etal.,J.Biol.Chem.,263:4993-4996(2988)；Panayotouand Waterfield,Curr.Opinion Cell Biol.,1:167-176(1989)]。能够生成带有受体的全部或部分功能的部分体，或者是这样的部分体，当其在与另外的第二受体部分结合(其全部，部分，或本身无功能)时，组建的功能蛋白带有一个哺乳动物CKR-3特有的功能(配体、抑制剂或促进剂的结合功能)。[参见，例如，Sledziewski et al.，U.S.Patent No.5,284,746中关于在检测某待测样品配体的存在时，构建该结构体并使用杂交G蛋白偶连受体)。制备重组哺乳动物CKR-3受体的方法本发明另一方面涉及哺乳动物CKR-3受体或其部分体的制备方法。也提供了适于哺乳动物CKR-3受体或其部分体的表达的结构体。该结构体可以被导入适当的宿主细胞中，表达重组哺乳动物CKR-3受体的细胞能够被分离出来，并在培养基中生长。这种细胞有多种用途，例如制备特异蛋白，分离和/或纯化，在结合实验中用来检测配体、抑制剂或促进剂。合适的宿主细胞可以是原核细胞，包括细菌如E.coli,B.subtilis，和其他合适的细菌，或真核细胞，如真菌和酵母细胞(例如，Pichia pastoris,Aspergillu species,Saccharomyces cerevisiae,Schizosaccharomyces pombe,Neurospora crassa)，或其他低等真核生物和再高一点的真核细胞如昆虫细胞(Sf9昆虫细胞)或哺乳动物细胞[293细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)]。[参见，例如，Ausubel,F.M.et al.,eds.Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons Inc.,(1993)]。也还提供了制备哺乳动物趋化因子受体3蛋白或其局部的方法，该方法包括在适于核酸表达的条件下，培养带有编码所述受体及其功能局部的重组核酸的宿主细胞，表达编码的蛋白质，制备所述受体或局部。
产生重组哺乳动物CKR-3受体、其局部、或融合蛋白的宿主细胞也能制备。编码全部或局部重组哺乳动物CKR-3受体或融合蛋白的核酸，能够被插入到核酸载体中，例如DNA载体，例如质粒，病毒或其他适于表达的复制子。许多载体都是能够获得的，包括以单拷贝或多拷贝存在的载体，或者整合到宿主细胞染色体中的载体。
某种CKR-3受体的转录和/或翻译信号，可以被用来指导表达。另外，合适的表达载体能够获得到。适于表达全部或局部哺乳动物CKR-3受体或融合蛋白的载体，可包含一些额外的组件，包括但不限于下列的一种或多种复制起点，可选择的标志基因，一个或多个表达控制元件，如转录控制元件(启动子，增强子，终止子)和/或一个或更多的翻译信号；一个信号序列或前导序列(由载体、受体或其他来源编码的膜靶向分子)。
在合适的宿主细胞中可以提供用于表达的启动子。启动子可以是组成型的也可以是诱导型的。例如，启动子可以与编码受体蛋白全部或局部或融合蛋白的核酸可工作地相连，以便能够指导所编码多肽的表达。可以获得的适宜的启动子有各种原核细胞启动子(E.coli的lac,tac,T3,T7等启动子)和真核细胞的启动子[酵母乙醇脱氢酶(ADH1),SV40,CMV]。
另外，典型的表达载体带有可选择的标记，以筛选含有可复制表达载体的宿主细胞。编码抗生素或药物抗性物质的基因是经常使用的可选择标记，原核细胞常用(β内酰胺酶基因(青霉素抗性)，四环素抗性的Tet基因)，真核细胞常用(新霉素(G418或基因霉素)，gpt(霉酚酸)，青霉素或潮霉素抗性基因)。二氢叶酸还原酶基因是能够在多种宿主细胞中用氨甲喋呤进行筛选的。在酵母细胞中经常使用营养缺陷型基因为筛选标记(LEU2,URA3,HIS3)。也可使用病毒(杆状病毒)或噬菌体载体，以及能够整合到宿主细胞基因组的载体，如逆转录病毒。本发明也涉及带有这些表达载体的细胞。
当编码受体蛋白或多肽的核酸插入到载体中，与这些元件中一个或多个可工作地相连，所得结构体再导入宿主细胞，在适于表达的条件下生长，则产生受体蛋白或多肽。用适合选定的宿主细胞的方法导入结构体(转化，转染，电渗透，传染)。为产生受体，在适于表达的条件下培养带有结构体的宿主细胞，例如存在诱导剂，补充有适当盐、生长因子、抗生素、营养补充剂的培养基等。抗体本发明进一步涉及与CKR-3受体或其局部反应的抗体。在一个实施方案里，对抗于分离的和/或重组的哺乳动物CKR-3受体蛋白或其局部(例如，一个肽)而产生抗体。在一个更好的实施方案里，抗体特异性结合CKR-3受体(CCR3)或其部分。本发明也包括能够抑制哺乳动物特有的一个或多个功能的抗体，如结合活性、信号活性、和/或细胞反应的激活，例如，抗体能够抑制配体(一个或多个配体)与CKR-3(CCR3)的结合和/或一个或多个应答于配体由CKR-3(CCR3)介导的功能。例如，单克隆抗体7B11能够抑制趋红素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4与人CKR-3(CCR3)的结合。7B11能够进一步抑制人CKR-3(CCR3)介导的功能，包括趋化因子诱导的钙离子流、嗜伊红粒细胞和嗜碱细胞的趋化性、组胺及其他粒物质的释放。因此本发明一个实施方案中的抗体，具有与哺乳动物趋化因子受体3蛋白或其局部的结合特异性，此抗体抑制配体与受体的结合，抑制伴随配体结合受体出现的功能。
在一个特别优选的实施方案里，本发明的抗体具有针对人CKR-3(CCR3)的特异性，以及类似于鼠7B11单克隆抗体的抗原表位特异性。带有类似于鼠7B11单克隆抗体的抗原表位特异性的抗体，能够根据其与鼠7B11竞争结合人CCR3(例如，人CCR3携带细胞，如嗜伊红粒细胞、嗜碱细胞、本发明核酸转染的细胞)的能力来鉴定。
本发明的抗体可以是多克隆的或单克隆的(参见实施例5)，术语抗体一词的意思指的是包括单克隆和多克隆二者。本发明的抗体可以对抗于适当免疫原而产生，免疫原包括本发明的蛋白质或多肽，如分离和/或重组的人CKR-3受体蛋白或其局部，或者合成分子，如合成多肽。另外，受体表达细胞，如转染细胞能够用做免疫原或用来筛选结合受体的抗体[参见例如，Chuntharapai et al.,J.Immunol.152:1783-1789(1994)]。
用适当的技术能够制备免疫抗原、多克隆和多克隆抗体。已经介绍了多种方法[参见，例如，Kohler et al.,Nature,256:495-497(1975)and Eur.J.Immunol.6:511-519(1976)；Milstein etal.,Nature 266:550-552(1977)；Koprowski et al.,U.S.Patent No.4,172,124；Harlow,E.and D.Lane,1988,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY)；Current Protocols In Molecular Biology,Vol.2(Supplement27,Summer＇94),Ausubel,F.M.et al.,Eds.,(John Wiley&Sons:NewYork,NY),Chapter11,(1991)]。通常，将一永生细胞株(如骨髓瘤细胞株SP2/0)和产生的抗体细胞相融合而生成杂合子。抗体产生细胞，尤其是脾脏和淋巴结的抗体产生细胞，是从用目标抗原免疫过的动物获得的，用选择性培养条件可以分离融合细胞(杂合子)，通过限制稀释度来克隆。用适当的方法(例如，ELISA)能够筛选预期特异性的抗体产生细胞。
本发明和术语“抗体”也包括单链抗体、嵌合的、人化的或灵长目化(CDR-移植)的抗体，以及嵌合的或CDR-移植的单链抗体。这些抗体的不同部分能够用常规技术化学性地相互连接起来，或者用基因工程技术制备成邻接蛋白。例如，编码嵌合的或人化链的核酸能够表达产生一种邻接蛋白[参见，例如，Cabilly etal.,U.S.Patent No.4,816,567；Cabilly et al.,European Patent No.0,125,023B1；Boss et al.,U.S.Patent No.4,816,397；Boss et al.,European Patent No.0,120,694 B1；Neuberger,M.S.et al.,WO86/01533；Neuberger,M.S.et al.,European Patent No.0,194,276B1；Winter,U.S.Patent No.5,225,539；and Winter,European Patent No.0,239,400B1.参见Newman,R.et al.,BioTechnology,10:1455-1460(1992)，涉及灵长化的抗体，and Ladner et al.,U.S.Patent No.4,946,778and Bird,R.E.et al.,Science,242:423-426(1988)关于单链抗体]。
另外，也能够制备抗体的功能片段，包括嵌合的、人化的、灵长目化的或单链抗体。上述抗体的功能片段保留他们起源的完整长度抗体的至少一个结合功能和/或调节功能。较好的功能片段保留了对应全长抗体的抗原结合功能[例如，对哺乳动物CKR-3(CCR3)特异性]。更好的功能片段保留了对一个或多个哺乳动物CKR-3(CCR3)特有功能的抑制作用，如结合活性、信号活性、和/或细胞反应刺激活性。例如，在一个实施例里，一个功能片段能够抑制CKR-3(CCR3)与他的一个或多个配体(趋红素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4)相作用和/或能够抑制一个或多个受体-介导的功能，如趋化因子结合CKR-3(CCR3)所诱导的嗜伊红粒细胞、嗜碱细胞趋化反应和/或脱粒作用。例如，本发明中能够结合哺乳动物CKR-3受体或其局部的抗体片段，包括但不仅仅局限于Fv,Fab,Fab’,F(ab’)2片段。这种片段能够用酶切或重组技术生成。例如，胰蛋白酶或木瓜蛋白酶切分别能够生成Fab,F(ab’)2片段。也可以多种截断方式生成抗体，所用的抗体基因在天然终止位点的上游导入了一个或多个终止密码子。例如，一个编码F(ab’)2重链的嵌合基因能被设计成带有编码重链CH1区和铰链区的DNA。
这里所用的术语“人化免疫球蛋白”是指包含不同来源免疫球蛋白部分的免疫球蛋白，其中至少一个部分是人源的。本发明涉及一个具有哺乳动物CCR3结合特异性(人CCR3)的人化免疫球蛋白，所指免疫球蛋白包括一个非人源(啮齿类)抗原结合区和至少一部分人源免疫球蛋白(人框架区、人恒定区或其局部)。例如，人化抗体包括带有所需特异性的非人源免疫球蛋白部分，如鼠，包括人源免疫球蛋白部分(嵌合的免疫球蛋白)，用常规化学方法使相连(合成)，或用基因工程技术(编码嵌合抗体蛋白质部分的DNA能表达产生邻接多肽链)制备成邻接多肽。本发明人化免疫球蛋白的另一个例子是包含有一或多个非人源CDR免疫球蛋白链(一个或多个非人源抗体的CDR)和一人源轻和/或重链框架区(有或没有框架区改变的CDR-移植抗体)。在一个实施例中，人化免疫球蛋白能够与鼠7B11单克隆抗体竞争结合人CCR3(人CCR3产生细胞，如嗜伊红粒细胞、嗜碱细胞或用本发明中核酸转染的细胞)。在一个更好的实施例里，人化免疫球蛋白的抗原结合区来源于7B11单克隆抗体。人化免疫球蛋白也包括嵌合的或CDR-移植的单链抗体[参见，例如，Cabilly et al.,U.S.Patent No.4,816,567；Cabilly et al.,EuropeanPatent No.0,125,023B1；Queen et al.,European Patent No.0,451,216B1；Boss et al.,U.S.Patent No.4,816,397；Boss et al.,European Patent No.0,120,694 B1；Neuberger,M.S.et al.,WO86/01533；Neuberger,M.S.et al.,European Patent No.0,194,276 B1；Winter,U.S.Patent No.5,225,539；and Winter,European Patent No.0,239,400B1.(参见Newman,R.et al.,BioTechnology,10:1455-1460(1992))，涉及灵长化的抗体，and Ladner et al.,U.S.PatentNo.4,946,778and Bird,R.E.et al.,Science,242:423-426(1988)关于单链抗体]。
本发明的抗体有多种用途，包括研究、诊断和治疗。在一个实施例里，抗体用合适的标记物标记(荧光标记，化学发光标记，同位素标记，或酶标记)。例如，能够用来分离和/纯化受体或其局部，以及研究受体结构(构型)和功能。
本发明的抗体也能够用来在研究和治疗中调节受体功能。例如，抗体能作为抑制剂来抑制(减轻或防止)(a)与受体结合(配体，第二个抑制剂或促进剂)，(b)受体信号，(c)和/或刺激功能。作为受体功能抑制剂的抗体能够直接或间接阻止配体或促进剂的结合(通过构型改变)。例如，通过抑制配体的结合或通过去敏感作用(联合或不联合配体结合的抑制)抗体能够抑制受体功能。
结合受体的抗体也能够作为受体功能的配合剂，引起或刺激受体功能，例如结合受体后信号和/或刺激受体功能(趋化作用，细胞外渗作用或释放原炎症介质)。
另外，本发明的多种抗体也能够用来检测或测量受体的表达，例如，在白细胞上，如嗜伊红粒细胞、嗜碱细胞和淋巴细胞，或在受体基因转染的细胞上。如此，他们也能够用于为诊断或研究目的的细胞分类(细胞流计，荧光激活的细胞分类)。
也提供了抗独特型抗体，抗独特型抗体能够识别另一个抗体的抗原结合位点的抗原决定簇。通过免疫一个相同种类动物能够制备对抗第二个抗体的抗独特型抗体，最好使用与产生第二个抗体的动物相同种的动物。还提供了抗独特型抗体。抗-独特型抗体识别与另外抗体的抗原结合位点相关的抗原决定族。可以在同种动物中免疫制备针对第二抗体的独特型抗体，优选与产生第二抗体的动物相同的动物。参见美国专利第4,699,880号。
在一个实施例里，对抗受体或其局部而产生抗体，然后用这些抗体来制备抗独特型抗体。因此抗独特型抗体能够与可结合受体的物质相结合，例如，受体功能的配体、抑制剂、促进剂，能够在免疫实验中用来检测或鉴别或定量这些物质。尽管他本身不结合受体，这种抗独特型抗体也能够作为受体功能的抑制剂。
抗独特型抗体(抗-Id)本身还可以用来生成另一个抗独特型抗体(抗-抗-Id)。这样的一个抗体在特异性上相同或相似于起始用来免疫的抗体。在一个实施例里，阻止抗体结合受体的抗体拮抗物能够用来生成抗-Id，抗-Id再用来生成抗-抗-Id，后者具有相同或类似于抗体拮抗物的特异性。能够评估这些抗-抗-Id对受体功能的抑制效果，以判别是否拮抗物。
除嵌合的或CDR-移植的单链抗独特型抗体，也能够制备单链，和嵌合的，人化或灵长目化(CDR-移植)的单链抗独特型抗体，也包括在抗独特型抗体的范围之内，这种抗体的抗体片段也能够制备。受体功能的配体、抑制剂、促进剂的鉴定正如这里所用的，配体是结合受体蛋白质的物质。某种哺乳动物CKR-3受体的配体是结合该哺乳动物受体的物质。在一个实施例里，配体能够选择性地结合两个或更多哺乳动物趋化因子受体，包括CKR-3。在一个更好的实施例里，配体以高亲合力结合哺乳动物CKR-3受体的配体。所谓配体实质是这样一些物质，包括但不仅仅局限于，天然配体，分离的和/或纯化的，合成的，和/或重组的，天然配体的类似物(来自其他哺乳动物)，抗体，这些分子的局部，以及结合受体的其他物质。特定哺乳动物受体的天然配体能够在生理条件下结合受体，和哺乳动物CKR-3受体的配体相类似。所谓配体除了包括结合受体但没有抑制剂或促进剂功能的物质外，还包括受体活性的抑制剂或促进剂。
这里所用的抑制剂是指至少抑制哺乳动物C-C趋化因子受体(哺乳动物CKR-3受体)特有的一种功能的抑制剂，例如结合活性(配体、抑制剂、促进剂的结合)，信号活性(活化哺乳动物G蛋白，诱导细胞质中自由钙离子浓度[Ca2+]i在瞬间迅速升高)，和/或刺激细胞反应。所谓抑制剂是指这样一些物质，包括结合受体的拮抗物(一个抗体或其局部，天然配体的突变体，配体结合的别的竞争性抑制剂)，以及不结合受体但能够抑制受体功能的物质(抗独特型抗体)。
这里所用的促进剂是指至少促进哺乳动物C-C趋化因子受体(哺乳动物CKR-3受体)特有的一种功能的促进剂，例如结合活性(配体、抑制剂、促进剂的结合)，信号活性(活化哺乳动物G蛋白，诱导细胞质中自由钙离子浓度[Ca2+]i在瞬间迅速升高)，和/或刺激细胞反应。所谓抑制剂是指这样一些物质，包括结合受体的加强物(一个抗体，其他种类天然配体的类似物)，以及不结合受体但能够促进受体功能的物质(通过活化一个伴随蛋白质)。
下面将要介绍的，依赖于本发明核酸或蛋白质的实验，能够单独使用或者联合其他方法一起使用，用来鉴定哺乳动物CKR-3受体蛋白或多肽的配体、抑制剂、促进剂。人CKR-3在细胞内的水平不适于高通量的检测；因此，含有并表达本发明中核酸的细胞，十分有利于鉴定人CKR-3受体蛋白或多肽的配体、抑制剂、促进剂。
从一个哺乳动物分离CKR-3受体基因，再整合到表达系统内，生成上述的受体蛋白或多肽。分离和/或重组的受体蛋白或多肽，例如带有本发明核酸的结构体稳定或瞬间转染的细胞所表达的受体，或者包含受体的细胞片段(转染细胞的膜片段)，能够用在受体功能的检测实验中。如果需要，受体还能够进一步纯化，受体功能的检测实验可以在离体培养或在活体培养中进行。
分离的、重组的哺乳动物CKR-3受体蛋白，例如图1A-1C所示人CKR-3受体蛋白(SEQ ID NO:2)，图2A-2B(SEQ IDNO:4)或SEQ ID NO:6，都能够用在本方法中，用此法或其他技术监测受体功能来评估一个化合物的效果。例如，稳定或瞬间的转染子，A31/293/#20稳定转染子(见例9)，鼠L1-2前B细胞的稳定转染子(见实施例3)，杆状病毒感染的Sf9细胞(见实施例4)，能够用于结合实验。鼠L1-2前B细胞的稳定转染子或其他有趋化性的细胞能够用于趋化性实验(实施例3)。
根据本发明的方法，化合物可以单个的筛选，一个或多个化合物的实验可以同时进行。检测化合物的混合物时，用此法选择出化合物、分离并用合适的方法鉴定(PCR、测序、色谱法)。待测样品中若含有一个或多个化合物(配体、抑制剂、促进剂)，也能够用此法测定。
用结合的化学合成或别的方法生成的大的连接的化合物文库(有机物，重组或合成的多肽、“类多肽”，核酸)也能够被检测[参见，例如，Zuckerman,R.N.et al.,J.Med.Chem.,37:2678-2685(1994)and references cited therein；Ohlmeyer,M.H.J.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922-10926(1993)and DeWitt,S.H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6909-6913(1993)；relating to tagged compounds；Rutter,W.J.et al.U.S.Patent No.5,010,175；Huebner,V.D.et al.,U.S.Patent No.5,182,366；andGeysen,H.M.,U.S.Patent No.4,833,092]。用本法从连接文库中筛选的化合物带有独特的标记，用色谱法鉴定个别化合物是可能的。
在于一个实施例里，运用了噬菌体显示法，例如受体与噬菌体接触(一个噬菌体或文库这种的噬菌体群落)，在适于受体结合(在合适的结合缓冲液)的条件下显示多肽。用标准技术或其他合适的方法选择出与受体结合的噬菌体。用洗脱液将噬菌体从受体分离开。例如离子强度或pH的改变能够引起噬菌体的释放。洗脱液或者也可以含有释放组分，或将组分设计成能够破坏化合物的结合(一个或多个能够破坏显示多肽与受体结合的化合物，如竞争性抑制结合的配体、抑制剂、促进剂)。筛选过程可以重复进行，另一个筛选步骤可以用来进一步富集结合受体的噬菌体。鉴定被显示的多肽(通过噬菌体DNA测序)，所鉴定的多肽能够被制备并进一步检测其配体结合功能，抑制剂和/或促进剂功能。能够生成这种多肽的类似物，具有提高的稳定性或别的性能。
在另一个实施例里，可以生成一种可表达并显示融合蛋白的噬菌体，这种融合蛋白含有一个随机序列核酸编码N端肽的外被蛋白。表达本发明受体蛋白或多肽的宿主细胞，与噬菌体接触，筛选、回收并鉴定被结合的噬菌体。[参见，例如，Doorbar,J.and G.Winter,J.Mol.Biol.,244:361(1994)讨论了与G蛋白-偶联受体一起使用的噬菌体显示方法]。
哺乳动物CKR-3受体的配体、抑制剂、促进剂的其他潜在的来源，包括但不仅仅局限于，别的趋化因子类物质；其他趋化因子(趋红素)，如作为受体的来自于同中哺乳动物的哺乳动物趋化因子，来自其他哺乳动物的趋化因子(对于人受体，非人来源的人趋化因子类似物)；其他趋化因子的变体，如天然发生的，合成的或重组的变体；其他哺乳动物CKR-3受体的配体、抑制剂、促进剂(抗体，拮抗物，支持物)，及其变体；其他G-蛋白偶连的受体配体、抑制剂和/或促进剂(拮抗物或支持物)；哺乳动物CKR-3受体的可溶解部分，例如合适受体多肽或能够抑制受体功能的类似物(参见，例如，Murphy,R.B.,WO94/05695)。
本发明的体外培养方法能够用于高通量筛选，这些实验适于大批量的样品(96孔模式)。对于这种筛选，由于分离嗜伊红粒细胞的困难性，采用表达受体的宿主细胞而不是分离的嗜伊红粒细胞。
对于结合实验，优选宿主细胞有高水平的受体表达。能够用多种方法监测受体表达，利用本发明中结合受体或其局部的抗体监测表达。也有可供商品抗体用来检测抗原的表达，或带有受体蛋白或多肽的表位标记融合蛋白(FLAG标记的受体；见实施例3)。结合实验分离和/或重组的受体蛋白，其局部，或本发明融合蛋白，可用来选择和鉴定结合(一个或多个)哺乳动物CKR-3受体蛋白的化合物，如人CKR-3受体蛋白，和配体或受体活性潜在的抑制剂或促进剂。该法筛选的化合物包括配体、抑制剂、促进剂，能够进一步评估其对受体功能和/或治疗用途的抑制或刺激效果。
在一个实施例里，结合一个有活性的，分离的和/或重组的哺乳动物CKR-3受体蛋白或多肽的化合物，可以用该法鉴定。在本实施例里，所用受体蛋白或多肽至少带有一个CKR-3受体特有的功能，例如信号功能(哺乳动物G蛋白的活化)，刺激功能(刺激趋化因子或释放炎症介质)，和/或结合功能(配体、抑制剂、促进剂的结合)。在更好的实施例里，分离和/或重组的哺乳动物CKR-3受体蛋白或多肽具有配体结合功能，以便结合受体的天然配体。
例如，分离的和/或重组的哺乳动物CKR-3受体蛋白或多肽能够在适于结合的条件下保存，受体与待测化合物结合，结合是可检测可度量的。因此提供了一种检测哺乳动物趋化因子受体3蛋白或其局部的配体的方法，包括在适于结合配体的条件下将待测化合物与有活性的、分离的哺乳动物趋化因子受体3蛋白结合，并检测或度量所谓化合物和活性分离的蛋白质的复合物的构型。在一个实施例里，受体蛋白质表达于稳定或瞬间转染的细胞，用包含编码本发明受体的核酸序列的结构体转染。在适于受体表达的条件下培养细胞。在适于结合的条件下(在合适的结合缓冲液里)细胞与化合物接触，用标准技术检测这种结合。相应的，提供了一种鉴定哺乳动物趋化因子受体3蛋白或其局部的配体的方法，包括步骤(a)在适于结合配体的条件下将待测化合物与有活性的、分离的哺乳动物趋化因子受体3蛋白结合，(b)检测或度量所谓化合物和活性分离的蛋白质的复合物的构型。为测量结合，结合的意义范围有所用对照决定(在没有化合物存在下由于背景比较，与第二化合物(标准)的结合进行比较，与化合物结合未转染细胞进行比较)。带有受体的细胞片段如膜碎片可用来代替完整细胞(见实施例9)。
在一个实施例里，用合适的标记物标记化合物(荧光标记，同位素标记)，通过检测标记来决定结合。结合特异性可以用竞争或替换实验来评价，例如用未标记化合物或第二配体作为竞争剂。
哺乳动物受体的配体包括来自同种哺乳动物或其他种类哺乳动物的天然配体，用这种方法可以鉴定。用这种配体结合实验也能够评价促进剂或抑制剂的结合活性。
结合抑制实验也能够用来鉴定配体、抑制剂、促进剂，都是结合受体并阻止别的化合物如配体的结合。在一个实施例里，本发明涉及一种鉴定哺乳动物趋化因子受体3蛋白或其局部的抑制剂的方法，包括步骤(a)在存在配体适于配体结合的条件下将待测化合物和表达活性重组哺乳动物趋化因子受体3蛋白的宿主细胞结合；和(b)检测或度量所谓化合物和活性分离的蛋白质的复合物的构型。例如，在结合实验里检测或测量，与第二化合物存在下第一化合物的结合相比较，(没有第二化合物存在下)第一化合物的结合的减少。受体可以和第一化合物第二化合物同时接触，或者一个接一个，不论先后。第二化合物存在下，第一化合物的结合范围的减少说明第二化合物对结合的抑制。例如，第一化合物的结合可能被减少或取消。
在一个实施例里，用第二化合物直接抑制第一化合物(一种趋化因子如RANTES)与人CKR-3受体的结合。例如可以指示某种化合物去抑制125I-标记的MCP-3或125Ⅰ-标记的RANTES结合人CKR-3。这种实验可以用完整细胞(嗜伊红粒细胞，或带有编码人CKR-3受体核酸的细胞系)，也可以用上述细胞的膜片段。
还有鉴定结合受体的化合物的其他方法，例如检测受体结合所引起的事件的方法，事件包括信号功能和/或刺激细胞反应(见下)。例如通过检测可表达活性重组哺乳动物趋化因子受体3蛋白的宿主细胞应答于配体结合所发生的信号活性或细胞反应，来检测结合。
可以理解本发明抗体的抑制效果可以通过结合抑制实验来评价。在适于抗体结合的条件下，也能用这种方法评价抗体之间对于受体结合的竞争，实验中第一化合物就是另一个抗体。
除了受体结合抑制剂(拮抗物)和促进剂(支持物)外，用这种方法鉴定的配体能够被进一步评价是否继结合之后抑制或激活CKR-3受体其他功能，和/或评价他们的治疗功能。信号实验配体或促进剂例如支持物的结合将导致G蛋白偶连受体的信号发生，G蛋白的活性的激活。用任何合适的方法检测化合物对信号功能的诱导作用。例如，G蛋白活性，GTP水解成GDP，或由受体结合引起的后续信号事件，如诱导细胞质中游离钙离子浓度[Ca2+]i迅速而短暂的升高，也能够用本法或其他合适的方法来评价[参见，例如，Neote,K.et al.,Cell,72:415-425(1993)；VanRiper et al.,J.Exp.Med.,177:851-856(1993)；Dahinden,C.A.etal.,J.Exp.Med.,179:751-756(1994)]。
Sledziewski等人的用杂交G蛋白偶连受体进行的功能实验，也能够用来检测配体或促进剂的受体结合与激活G蛋白能力(Sledziewski et al.,U.S.Patent No.5,284,746，该文献中的教导都通过在此引述而合并于本文)。
监测(结合杂交受体引起的)宿主细胞的生物学反应，检测到反应说明待测样品中有配体存在。Sledziewski et al描述了一种检测待测样品中配体存在的方法，其中的配体是能够被受体上配体结合区域结合的化合物。在本方法的一个实施例里，酵母细胞用一个能够指导生物活性杂交G蛋白偶连受体(融合蛋白)合成的DNA结构体转化。杂交受体包括哺乳动物G蛋白偶连受体，其中至少一个非配体结合区被酵母G蛋白偶连受体相应的区域代替，如STE2基因产物。培养带有结构体的酵母宿主细胞，表达杂交受体，在适于配体结合杂交受体的条件下，细胞与待测样品接触。如本文所述进行实验，检测(由结合杂交受体引起的)宿主细胞的生物应答，检测到应答说明有信号功能。
在一个实验里STE2基因产物杂交受体的结合，导致BAR1启动子的诱导。启动子的诱导通过报道基因(β-gal)的方法来测定，报道基因被连接于BAR1启动子在第二结构体导入宿主细胞。通过细胞裂解液的离体酶学检测或者通过培养基中有报告物(X-gal)的培养皿上兰色菌落的存在，可以检测报告基因的表达。
在另一个实施例里，实验用来鉴定受体功能的潜在抑制剂。用实验中的配体或促进剂测定化合物的抑制活性，评价化合物对由配体或促进剂引起的活性的抑制作用。
多种已知配体也能够用来检查对G偶连蛋白活性刺激功能的降低(减少的活性或无活性)。该实施例里，尽管化合物有配体结合活性，参与到受体不引起或仅仅微弱引起G偶连蛋白活性，这种化合物是潜在的拮抗物，并施与进一步的实验。例如，在一个配体或促进剂存在下进行同样的实验，评价该化合物对配体或促进剂活性的抑制作用。趋化性和细胞激活性能的实验趋化性实验也能够用来检测受体功能，这些实验是基于在离体或活体内化合物诱导的功能性迁移，能够用于评价配体、抑制剂、促进剂的结合和/或趋化效果。离体透内皮趋化性实验的使用被描述于实施例1,Springer等人描述了一种透内皮趋化性实验[Springer et al.,WO 94/20142，发表于1994年9月15日，该文献的教导通过在此引述而合并于本文，还可以参见Berman,etal.,Immunol Invest.17:625-677(1998)]。透过内皮迁入胶原蛋白胶也有描述[Kavanaugh et al.,J.Immunol,146:4149-4156(1991)]。鼠L1-2前B细胞稳定的转染子或有趋化性的宿主细胞能够用在趋化性实验(见例如实施例3)。
通常，趋化性实验检测合适细胞(如白细胞(淋巴细胞、嗜伊红粒细胞、嗜碱细胞))直接运动或迁移进入或穿过屏障(内皮，过滤器)，至化合物升高的水平，从屏障第一表面到相对的第二表面。膜或过滤器是常规的屏障，便于检测合适细胞直接运动或迁移进入或穿过屏障，至化合物升高的水平，从屏障第一表面到相对的第二表面。一些实验里，膜外被一种便于黏附的物质，如ICAM-1，纤维黏附素或胶原蛋白。
例如，在一合适容器里可以检测或测量细胞的迁移，从第一室进入或穿过微孔膜再进入包含有待测化合物的第二室，第一室与第二室之间以膜相隔。合适的膜有对应于化合物的适当的孔尺寸，以检测特异的迁移，包括硝酸纤维素、多糖。可以使用大约3-8微米的孔径，最好是5-8微米的孔径。孔径可以是全部统一的或者在一定范围内。
为评价迁移，迁入过滤器的距离，穿过过滤器并黏附于过滤器第二表面的细胞数，和/或积聚于第二室的细胞数，都可以用标准技术来测定(显微镜)。在一个实施例里，细胞用一可探测标记物标记(放射性同位素，荧光标记，抗原或抗原表位标记)，通过检测黏附于膜和/或存在于第二室的标记来评价迁移(检测放射活性，荧光强度，免疫检查)。能够确定化合物诱导的相对于合适对照的迁移范围。(和没有化合物存在确定的背景迁移比较，第二化合物诱导的迁移范围(标准)，和化合物诱导的未转化细胞的迁移范围)。
室可以用多种固体材料制作，如塑料、玻璃、聚乙烯等。可从室剥离的膜如Biocoat或Transwell膜，是便于计数黏附细胞。
在容器里，膜摆放的位置是膜能够和第一室里含细胞的液体接触，也能够和第二室液体接触。除待测化合物，或为检测目的的额外配体，抑制剂，促进剂外，膜两边的液体最好相同。室内液体可以包含有助提高稳定性或抑制细胞和/或培养基非特异性结合的蛋白质溶液(牛血清白蛋白，小牛血清，人血清白蛋白)。
在一个更好的实施例里，尤其对于嗜伊红粒细胞、嗜伊红粒细胞样细胞、淋巴细胞、表达CKR-3受体的细胞，检测其透内皮迁移。优选透内皮迁移检测。这些检测是更好的生理模型，因为他们最接近活体内条件，白细胞穿过排布于管壁的内皮细胞层，从血管向组织中有趋化因子的炎症部位迁移。另外，透内皮检测有较低的背景(信噪比)。
在这个实施例里，评价了穿过内皮细胞层的迁移。为了制备细胞层，可以在微孔滤器或膜上培养内皮细胞，可能外被一些物质如胶原蛋白，纤维黏附素或其他胞外基质蛋白质，便于内皮细胞的依附.培养内皮细胞直至形成丰富的单细胞层，多种哺乳动物细胞能够形成单细胞层，包括静脉，动脉，毛细血管内皮细胞，如人脐静脉内皮细胞(Clonetics Corp.San Diego,CA)或合适的细胞株如ECV304。为检测对于特定哺乳动物受体的应答趋化，最好使用同种哺乳动物的内皮细胞；然而也有使用异种或异属的哺乳动物的内皮细胞。
总体来说，实验是通过检测细胞迁向或穿过滤膜的定向迁移，从滤器第一表面向背面的第二表面，化合物的浓度逐渐升高，滤器在第一表面上有内皮细胞层。定向迁移是从第一表面附近区域进入或穿过膜，迁向位于滤器背面的化合物。第二表面附近区域的化合物浓度高于第一表面附近区域。
在一个实施例里，趋化因子被用来检验化合物的配体或促进剂的活性，含有能够迁移和表达哺乳动物CKR-3受体的化合物置于第一室，含有待测化合物的混合物置于第二室，第一室里最好没有可诱导细胞趋化反应的其他配体或促进剂存在，但是可以有一个或多个有趋化吸引功能的配体或促进剂。实验中能够结合受体并有诱导哺乳动物CKR-3受体细胞趋化反应的化合物是受体功能的配体或促进剂。
用来检测抑制剂的实施例里，含有可迁移和表达啊CKR-3哺乳动物受体的化合物置于第一室，含有可诱导第一室细胞趋化反应的一个或多个配体或促进剂(有趋化吸引能力)，置于第二室，在将细胞置于第一室之前一点或同时，放置带有待测化合物的混合物，最好放在第一室。实验中能够结合受体并抑制由哺乳动物CKR-3受体表达细胞的配体或促进剂诱导的趋化反应的化合物，是受体功能的抑制剂(激活反应的抑制剂)。在待测样品存在下配体或促进剂诱导迁移范围的减少，说明有抑制活性(见实施例5)。独立的结合实验将确定抑制作用是待测样品结合于受体的结果，还是通过不同的机制。
下面描述了(见炎症模型部分)在活体实验中，将化合物注射到组织中，引起白细胞的渗漏作用。该模型测定了应答于配体或促进剂，细胞迁出并向炎症部位趋化的能力。
除本方法外，还可以用合适的受体表达细胞检测其对活性受体诱导所作出的细胞应答，从而评价配体，抑制剂，促进剂对受体刺激功能的影响效果。类似地，这些实验也能够用来确定受体的功能。例如，细胞外渗作用(嗜伊红粒细胞脱粒作用，导致嗜伊红粒细胞阳离子蛋白和/或一或多个酶，其他粒组分的释放；从嗜碱细胞释放组胺)，炎症介质释放(生物活性脂类如白三烯的释放)，呼吸障碍[Rot,A.et al.,J.Exp.Med.,176:1489-1495(1992)]等，都可以用已知的适宜的方法监测[Bischoff.S.C.et al.,Eur.J.Immunol.,23:761-767(1993)and Baggliolini,M.and C.A.Dahinden,Immunology Today,15:127-133(1994)以及其中所引述的文献]。
在一个实施例里，通过检测脱离过程或细胞外渗中酶类的释放，鉴定配体，抑制剂，促进剂。带有本发明核酸的细胞，所编码的受体蛋白能够刺激细胞外渗作用或脱粒作用，在合适的条件和培养基里培养这种细胞，使表达受体诱导脱粒过程。受体与待测化合物接触，评价释放的酶类。用适当的检测方法检测或测定释放到培养基的酶，例如免疫学检测，或酶活性的生化检测。
通过向培养基中(细胞与化合物结合之前、同时或之后)直接投入检测成分(底物，协同因子，抗体)，检测培养基。也可以在与细胞分离开的培养基上或在实验前进一步破碎的培养基上进行检测。
例如，可提供用来分析β-葡萄糖醛酸酶和嗜伊红粒细胞过氧化物酶等的常规检测方法[White,S.R.et al.,A kinetic assay foreosinophil peroxidase activity in eosinophils and eosinophilconditioned media,J.Immunol.Methods,144(2):257-263(1991)]。
一种化合物的脱粒刺激功能说明该化合物是哺乳动物CKR-3受体的配体或促进剂。另一个实施例里，对脱粒过程的抑制说明是抑制剂，这个实施例里，表达受体的细胞与配体或促进剂结合，在此之前，之后或同时，已经加入了待测化合物。炎症模型已经有多种炎症活体培养模型，可用来检测活体培养时，配体，抑制剂，促进剂作为治疗药物的效果。
例如已经有活体检测嗜伊红粒细胞渗透到肺里的原始模型[参见，例如，Wegner,C.D.et al.,Science,247:456(1990)]。在一个实施例里，给予动物一种可与人CKR-3反应，也可与灵长目CKR-3交叉反应的抗体(如单克隆抗体)。测定一系列参数以评价活体效果，包括但不仅局限于支气管肺泡渗出液中嗜伊红粒细胞数目，呼吸通畅，呼吸率、气管过敏症状的减少说明有治疗效用。
此外，气喘的绵羊模型，被动皮肤过敏症的豚鼠模型，或其他模型可用来在活体培养下评价化合物[参见，例如，Weg,V.B.et al.,J.Exp.Med.,177:561(1993)；Abraham,W.M.et al.,J.Clin.Invest.,93:776(1994)]。
向合适动物如鼠，兔，豚鼠皮内注射化合物后，检测白细胞的渗透[参见，例如，Van Damme J.et al.,J.Exp.Med.,176:59-65(1992)；Zachariae,C.O.C.et al.,J.Exp.Med.171:2177-2182(1990)；Jose,P.J.et al.,J.Exp.Med.,179:881-887(1994)]。在一个实施例里，用皮肤活检来组织学评价白细胞的渗透(如嗜伊红粒细胞，粒细胞)。另一个实施例里，给予动物一种有趋化反应和渗出作用的标记细胞(稳定转染的CKR-3受体表达细胞，用111In标记)，应答于注射待测样品(在某种缓冲液或载体里的待测化合物)的细胞渗透作用说明配体或促进剂的存在，例如样品中支持剂的存在。实验也可以经修改来鉴定趋化反应和白细胞渗出作用的抑制剂。例如可以在给予实验动物配体或支持剂之前，同时或之后，给予一个抑制剂，和没有抑制剂存在时比较，抑制剂存在下渗透作用范围的减少说明有抑制效果。诊断用途本发明还有多种诊断用途，包括但不限于下面所讨论的各种用途。
哺乳动物CKR-3受体基因的突变可导致编码受体至少一个功能的缺陷，降低或加强了受体功能。例如，产生受体变体或改变表达水平的突变型，能够降低或增强受体功能，能够降低或增强受体介导的炎症反应。
例如，检测或测量受体功能的方法可以用来鉴定个别细胞(白细胞)中受体的活性或从该细胞分离受体的活性。在这些实验里，能够评价受体功能的降低或增强。
本发明的核酸提供了筛查，鉴定和/或分离一种缺陷的哺乳动物CKR-3受体基因的试剂，该基因编码的受体有降低或升高的活性，可以采用筛查缺陷基因的标准方法。缺陷基因及其编码受体的活性可被分离并表达于合适的宿主细胞，用于进一步评价哺乳动物CKR-3受体。许多人类疾病都伴有G蛋白偶连受体功能的缺陷[Clapham,D.E.,Cell,75:1237-1239(1993)；Lefkowitz,R.J.,Nature,365:603-604(1 993)]。
本发明的抗体可以用来检测细胞表面的受体，这种受体为可表达它的白细胞类型提供了一个筛选标记，尤其是嗜伊红粒细胞。例如，针对受体蛋白或多肽产生的抗体能够用来计数表达受体的细胞。细胞计数可以用来诊断多种疾病，或发现有升高或降低白细胞类型的条件(如高嗜伊红粒细胞综合症里的嗜伊红粒细胞；低嗜伊红粒细胞症。样品中升高水平的嗜伊红粒细胞的出现，说明有炎症疾病或ASTHMA、寄生虫等感染所致的嗜伊红粒细胞渗漏。另外，这些抗体也能够用来在细胞混合物中对受体表达细胞进行分类。为此目的可采用一些适合的细胞计数法和/或细胞分类法(细胞流计法，荧光激活细胞分类法)。
抗体还可以用来检测或测量在多种疾病或在白细胞受到改变(以正常细胞表达水平为对照的降低或升高)的炎症条件下受体表达水平的降低或升高。例如从某个体分离白细胞(嗜伊红粒细胞，T淋巴细胞等淋巴细胞，单核细胞，嗜碱细胞)，用适当的免疫学检测(ELISA,FACS分析)来评价表达水平。哺乳动物CKR-3受体的表达水平可用来诊断哺乳动物CKR-3受体表达升高或降低的疾病或条件。转基因动物用重组DNA技术改变动物宿主的基因组，构建转基因动物。在一个实施例里，改变是不可遗传的(改变的是躯体细胞，如祖代骨髓细胞)，另一个实施例里改变是可遗传的(改变的是生殖细胞)。用标准技术或其他方法可以构建转基因动物[参见，例如，Cooke.M.P.et al.,Cell,65:281-291(1991)关于对T淋巴细胞的修饰；Hanahan,D.,Science,246:1265-1275,(1989)]。
一方面，在某种动物宿主使内源哺乳动物CKR-3受体基因全部或部分失活(用基因凋损技术)，产生转基因动物。本发明核酸可以用来评价包含失活CKR-3基因的成功宿主细胞结构体(Southern杂交)。另外，通过检测编码受体的功能来评价包含失活CKR-3基因的成功宿主细胞结构体。
在另一个实施例里，将编码哺乳动物CKR-3受体蛋白或多肽的核酸导入适当宿主细胞，制备转基因动物。更好的实施例里，转基因动物的内源CKR-3受体基因是失活的(通过同源重组导入核酸的同时使失活，损坏并替换内源基因)。例如，可制备转基因动物(鼠，豚鼠，绵羊)，其白细胞(嗜伊红粒细胞，T淋巴细胞)中能够表达不同哺乳动物种类(人)的CKR-3受体，为评价该受体功能提供了一个方便的动物模型。另外，给予转基因动物某种化合物，用适当的分析方法检测该化合物在受体介导的炎症反应中的作用[参见，例如，Weg,V.B.et al.,J.Exp.Med.,177:561(1993)；Abraham,W.M.et al.,J.Clin.Invest.,93:776(1994)。以这种方式可以鉴定抑制或促进受体功能的化合物，或者评价其体内效果。治疗方法根据本发明，通过抑制或促进至少一种哺乳动物CKR-3受体特有的功能，调节其功能，为抑制或促进白细胞介导的炎症反应提供了一种有效的选择性的方法。这里所述CKR-3受体功能的一个或多个配体，抑制剂和/或促进剂，能够用来为治疗疾病调节白细胞的功能。在一个实施例里，本发明涉及一种调节哺乳动物CKR-3受体至少一个功能的方法，其中步骤包括该蛋白与其至少一个功能的抑制剂或促进剂相接触。
哺乳动物CKR-3受体作为主要的嗜伊红粒细胞和淋巴细胞趋化因子受体，为干涉或促进哺乳动物如人嗜伊红粒细胞和/或淋巴细胞功能提供了靶向。相一致地，在特定的炎症渗透情况下发现T细胞和嗜伊红粒细胞的共同定位。因此，本发明所鉴定的抑制或促进CKR-3受体功能的化合物如配体，抑制剂(7B11)和促进剂，尤其能够为了治疗目的调节嗜伊红粒细胞，嗜碱细胞和/或淋巴细胞功能。
因此本发明提供一种为治疗目的抑制或促进炎症反应的方法，包括给予病人一种可抑制或促进哺乳动物CKR-3受体功能的化合物。
在一个实施例里，给予一种抑制哺乳动物CKR-3受体(人CKR-3受体)一个或多个功能的化合物，以抑制炎症(减轻或预防)。结果一或多个炎症过程例如白细胞的渗出，趋化反应，细胞物质外渗(酶或组胺)或炎症介导物的释放，受到了抑制。例如，根据本发明嗜伊红粒细胞向炎症部位渗透(例如，在哮喘中)受到了抑制。因此可提供一种治疗炎症疾病或条件的方法，包括给予哺乳动物有效治疗量的哺乳动物CKR-3受体蛋白抑制剂。
另一个实施例里，给予一种能够促进哺乳动物CKR-3受体(人CKR-3受体)一个或多个功能的化合物，以刺激(诱导或加强)炎症反应，如白细胞的渗出，趋化反应，细胞物质外渗(酶或组胺)或炎症介导物的释放，导致有利的炎症反应激活。例如，嗜伊红粒细胞能够富集以抵抗寄生虫感染。
根据本发明的方法，除了灵长目动物如人外，还有许多其他哺乳动物能够用此法治疗。这些哺乳动物包括但不仅仅局限于乳牛，绵羊，山羊，马，狗，猫，豚鼠，兔等。然而这种方法也能够用于其他种类，如鸟类(鸡)。
伴随炎症和感染的疾病和条件能够用这种方法来治疗，在一个更好的实施例里，疾病是为了调节炎症反应，嗜伊红粒细胞和/或淋巴细胞的活性受到了抑制或促进。
人或其他种类动物的疾病可以用CKR-3受体功能的抑制剂来治疗，包括但不局限于◎炎症或变应性疾病，包括呼吸变应性疾病如气喘，变应性鼻炎，过敏性肺病，过敏性肺炎，嗜伊红粒细胞性肺炎(Loeffler＇s综合症，慢性嗜伊红粒细胞性肺炎)，间隙肺病(自发性肺纤维化，风湿性关节炎伴发的ILD，系统性红斑狼疮，关节强硬脊椎炎，系统硬化，Sjogron＇s综合症，多肌炎或皮肤肌炎)，系统性过敏症或超敏反应，药物变应性(青霉素，头孢霉素)，昆虫叮咬变应性，肠炎症，如Crohn＇s病和溃疡性结肠炎，脊椎关节病，硬皮病，牛皮癣和皮肤炎症如皮炎，湿疹，特应性皮炎，变应性接触皮炎，急性寻麻疹，结节性脉管炎(坏死性的或过敏性的)；◎嗜伊红粒细胞性肌炎，嗜伊红粒细胞性肌膜炎；◎自身免疫疾病，如风湿性关节炎，牛皮癣性关节炎，多重硬化，系统性红斑狼疮，重症肌无力，少年型糖尿病，血症性肾小球性肾炎，自体免疫甲状腺炎，Behcet＇s病；◎移植排斥反应(器官移植)，包括异体移植排斥反应或移植-宿主疾病；◎皮肤或器官白细胞渗透性癌症；◎其他疾病包括但不限于，再灌注损伤，粥样硬化，某些败血症，细胞因子毒性(败血性休克，内毒性休克)，多肌炎，皮肤肌炎；能够用CKR-3受体促进剂治疗的人或其他种类动物的疾病，包括但不局限于
◎免疫抑制，例如免疫缺陷综合症AIDS，放疗，化疗，进行自体免疫疾病治疗，或其他药物治疗(皮质类固醇治疗)将导致免疫抑制，受体功能先天缺陷的免疫抑制；◎感染性疾病，如寄生虫病，包括但不局限于蠕虫感染，如线虫；(Trichuriasis,Enterobiasis,Ascariasis,Hookworm,Strongyloidiasis,Trichinosis,filariasis)；吸虫(fluxes)(Schistosomiasis,Clonorchiasis),cestodes(tape worms)(Echinococcosis,Taeniasis saginata,Cysticercosis)；绦虫(Toxocara)；内脏蠕虫，内脏游走性幼虫病，肠胃炎(例如，Anisaki spp.,Phocanema ssp.)；皮肤游走性幼虫病(Ancylostomabraziliense,Ancylostoma caninum)。在某些炎症反应尤其是气喘中嗜伊红粒细胞作为靶细胞嗜伊红粒细胞产生于骨髓再循环到组织中，主要是到黏膜组织，例如肺，胃肠道，和生殖道。嗜伊红粒细胞在血液里一般占白细胞的1-3％，但是在变应性疾病和蠕虫感染疾病患者的组织或血里有嗜伊红粒细胞的积累，嗜伊红粒细胞的积累对宿主可以是有益的也可以是有害的。
例如，嗜伊红粒细胞有许多粒物质，带有阳性蛋白质，IgG,IgA,IgE受体的参与或血小板激活因子(PAF)，白三烯，趋化因子等炎症介质的刺激，将引起嗜伊红粒细胞的脱粒作用，导致粒物质的释放。嗜伊红粒细胞产物也会伤害宿主细胞，最大的危害来自于阳性蛋白，从气喘病人可检测到升高的阳性蛋白。嗜伊红粒细胞也产生大量炎症介质，如白三烯C4,PAF。这些介质使器官平滑肌收缩，促进黏液分泌，改变管道通透性，减少嗜伊红粒细胞和中性细胞的进一步渗透。
嗜伊红粒细胞参与变应性/气喘素质的启始和维持。在一个实施例里，除其他嗜伊红粒细胞并发症外，本法还可以用来治疗气喘或过敏性(变应性)疾病，尤其是那些包括黏膜组织的疾病。在一个更好的实施例里，给予气喘病人一种能够抑制哺乳动物CKR-3受体一到多个功能的化合物。
嗜伊红粒细胞岁于宿主十分重要，能够防御大的，不可被吞噬的组织，如多细胞蠕虫。嗜伊红粒细胞也是免疫反应对付可诱导高水平IgE抗体的抗原的重要效应细胞。因此，本法可用来治疗感染性疾病，如寄生虫疾病，刺激或促进炎症防御，或抑制有害宿主的炎症应答。嗜伊红粒细胞和气喘药物病因学气喘的特征是器官或支气管的阻塞，是由各种药理介质引起的支气管过敏和迅速狭窄。现在广泛认为支气管黏膜的慢性炎症在气喘的发展方面充当重要角色。
在气喘和其他过敏反应，发现了支气管黏膜有强烈的嗜伊红粒细胞，巨噬细胞，淋巴细胞的渗透。通常嗜伊红粒细胞向炎症气道选择性迁移很重要，可能由于嗜伊红粒细胞从血里分离并和内皮细胞特异结合。嗜伊红粒细胞尤其是引起支气管黏膜损伤的作用物质，对气喘病人的研究显示，血液嗜伊红粒细胞的数目与支气管过敏程度相关。另外支气管活检和的气喘支气管肺泡隐藏液的研究都表明在嗜伊红粒细胞和临床严重程度之间有明确的相关性。因此存在嗜伊红粒细胞和不利的免疫反应尤其是气喘之间有强烈的联系。
嗜伊红粒细胞和淋巴细胞上主要的趋化因子，在选择性趋化反应，外渗和应答于趋化吸引的活化方面发挥作用，也为干涉嗜伊红粒细胞的富集提供了完美的靶向。能够抑制哺乳动物CKR-3受体至少有或多个功能的抑制剂，例如抑制趋化因子结合，提供了一种治疗气喘的有效途径。通过减轻或防止白细胞特别是嗜伊红粒细胞向炎症肺或气道组织的富集(外渗，渗透)，和/或减弱这些组织中白细胞功能，能够抑制气喘破坏性的炎症过程，并缓解症状。
有证据显示阻止嗜伊红粒细胞向肺部富集可以环节气喘的症状。据报道，用α4整合蛋白活性的单克隆抗体可抑制嗜伊红粒细胞向肺部和气道的积聚，可以抑制绵羊身上抗原引起的气道过敏反应。在气喘的灵长目模型里，有报道ICAM-1单克隆抗体可减少气道嗜伊红粒细胞和过敏反应。另外，在被动皮肤过敏症的豚鼠模型上，离体培养用抗α4单克隆抗体预处理嗜伊红粒细胞，可阻止嗜伊红粒细胞的积聚[参见，例如，Wegner,C.D.et al.,Science,247:456(1990)；Weg,V.B.et al.,J.Exp.Med.,177:561(1993)；and Abraham,W.M.et al.,J.Clin.Invest.,93:776(1994)有关这些模型。给药方式根据本方法，通过合适的途径，给予宿主一或多种化合物，单独给药或配合其他药物，给予一个有效量的化合物(抑制配体结合的受体多肽，抗体或抗体片段)。一个有效量是指在给药条件下足够达到预期治疗效果的量，例如，足够抑制或促进CKR-3受体从而分别抑制或促进炎症反应的量。
有多种可能的给药途径，包括但不局限于口服给药，胃肠道给药，局部给药，肠胃外给药(静脉内，动脉内，肌内，皮下注射)，吸入剂(支气管内，鼻内，或口腔吸入，鼻内滴注)，根据疾病状态及条件来确定给药途径。对于呼吸系统变应性疾病如气喘，吸入方式是首选给药途径。
根据给药途径不同，化合物的形式差别很大(溶液，乳剂，胶囊)，用一个生理可接受的载体制备包含化合物的药物。对于溶液或乳剂，合适的载体包括氯化钠溶液，Ringer｀s葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳糖化Ringer｀s或固定油。静脉内载体包括多种添加剂，防腐剂，或液体，营养剂或电离再生剂。对于吸入剂，化合物可以溶解再装入一个合适的给药分散器中(喷洒器，喷雾器，空压分散器)。实施例本发明将有下列实例来说明，但并不意味仅局限于此。
实施例1人嗜伊红粒细胞的趋化特性人嗜伊红粒细胞的趋化性为鉴定嗜伊红粒细胞趋化因子受体的拮抗剂，有必要鉴定嗜伊红粒细胞趋化反应中重要的趋化因子，并确定这些趋化因子所结合的受体。在灵敏和经改进的趋化分析里进行趋化实验，其中使用在趋化反应孔多聚碳水化合物膜上生长的内皮细胞。嗜伊红粒细胞的分离100ml肝素化血液用PBS以1∶1稀释，分别取20ml样品铺在65％、75％Percoll梯度上，室温下1500rpm离心25分钟。嗜伊红粒细胞/中性细胞层转至一新试管，加入20ml 0.2％NaCl,1分钟后加入30ml 1.8％NaCl使红细胞裂解。用缓冲液PBS,0.5％BSA,0.5mM EDTA洗涤细胞两次，重溶于冷缓冲液到5×107cell/50μl，细胞中加入50μl CD16微珠。混合物4度下温育25分钟，然后加入900μl冷缓冲液。用miniMACSTM分离仪来取消CD16阳性细胞(中性细胞)，取200μl样品上柱，收集流出的细胞并进行组织学检验，嗜伊红粒细胞制备物纯度＞99％。趋化性检测趋化因子自Peprotech,Inc.获得(Rocky Hill,N.J.)。用24孔板中3.0微米Biocoat细胞培养插入子进行趋化性实验。在趋化实验之前两天内皮细胞在插入子上生长富足，实验用内皮细胞是ECV304，能够表达内皮细胞标记物如von Willebrand因子，ICAM-1,VCAM-1。因为人脐静脉内皮细胞天然可变，只能够用几次实验，而且比ECV304生长慢，所以该内皮细胞株极大地方便了实验。实验在37度下进行1.5小时，用倒置显微镜计数迁移细胞。结果结果如图4示，代表至少5次实验。在聚碳酸酯膜上生长的ECV304内皮细胞几乎完全地消除了背景迁移。用在透内皮细胞的趋化检测中的嗜伊红粒细胞表现了对多种趋化因子的迁移，特别是RANTES、MCP-3，对MCP-1的迁移相对较低。而MIP-1β、IL-8、MCP-2、和IP-10则几乎对嗜伊红粒细胞的趋化作用。在某些实验中，MIP-1α对嗜伊红粒细胞是趋化性的，虽然总体上是非活性的。在这些实验中，使用了相当范围内各种浓度的趋化因子，因为白细胞对不同的趋化因子的反应性各异，以及各种趋化因子制剂的质量不同。但一致的发现是，对RANTES和MCP-3的高水平的嗜伊红粒细胞的趋化反应。
实施例2主要嗜伊红粒细胞性趋化因子受体的鉴定引物的选择和设计对五种趋化因子受体基因比较它们对简并的寡核苷酸的的产生，用于从嗜伊红粒细胞中PCR克隆出新趋化因子受体。对这五种受体基因的选择根据是，其所结合的趋化因子配体的种类[I1-8受体A(IL8RA)、Ⅰ1-8受体B(IL8RB),MIP-1α受体(MIP1αR)]，或与这些受体有显著的序列相似性的婴儿受体，并且其表达被报道为仅限于淋巴样细胞或组织[Epstein BarrInducible receptor-1(EBI1R)and Burkitt′s Lymphoma Receptor-1(BLR1)]。根据已经出版的对位，将受体的序列相对位排列[IL-8RA,Holmes et al.,Science,253:1278-1280(1991)；IL-8RB,Murphy,P.A.et al.,Science,253:1280-1283(1991)；MIP1α/RANTES,Neote,K.et al.,Cell,72:41 5-425(1991)；EBIIR,Birkenbach,M.et al.,J.Virol.,67:2209-2220(1993)；and BLR1(Dobner,T.et al.,Eur.J.Immunol.,22:2795-2799(1992)]。
根据高度的序列相似性，选择了跨膜(TM)区域2、6和7，以及对TM3的C终端区域作为简并寡核苷酸设计的靶标。简并的寡核苷酸引物的核苷酸序列在下表中给出。
表引物Set2SEQ ID NO:
TM2a7引物2a-1(正向) 5’-TAC CTG CTS AAC CTG GCC ITG GCI G8嵌套引物2a-2(正向) 5’-AC CTG GCC ITG GCI GAC CTM CTC TTTM39引物3F(正向)5’-GAC CGY TAC CTG GCC ATI GTC CAY GCC10 引物3R(反向)CTG GCR ATG GAC CGG TAI CAG GTR CGG-5’TM6b11 引物6b-1(反向) GAR AMR ACC IRI GGG ATG TTRIAC CAI-5’12 嵌套引物6b-2(反向) AAG RAI GAR GAR AMR ACC IRI GGG ATG T-5’TM713 引物7-1 ACG SAG TTG GGI IAS IAG ATG CGG AAG-5’14 嵌套引物7-2(反向)GTG WCG ACG SAG TTG GGI IAS IAG A-5’1核苷酸缩写K=G/TM=A/CR=A/GS=C/GW=A/TY=C/T嗜伊红粒细胞的分离和纯化用PBS按1∶1将100ml的肝素化的血稀释。分别取20ml样品铺在65％、75％Percoll梯度上，室温下1500rpm离心25分钟。嗜伊红粒细胞/中性细胞层转至一新试管，加入20ml 0.2％NaCl,1分钟后加入30ml 1.8％NaCl使红细胞裂解。用缓冲液PBS,0.5％BSA,0.5mM EDTA洗涤细胞两次，重溶于冷缓冲液到5×107cell/50μl，细胞中加入50μl CD16微珠。混合物4度下温育25分钟，然后加入900μl冷缓冲液。用miniMACSTM分离仪(Miltenyi Biotec,Inc.,Auburn,CA95603)来取消CD16阳性细胞(中性细胞)，取200μl样品上柱，收集流出的细胞并进行组织学检验，嗜伊红粒细胞制备物纯度＞99％。
mRNA的分离和PCR用Micro-FastTrackTMmRNA分离试剂盒直接从纯化细胞提取mRNA for RT-PCR，在用7TMS退化引物之前，用PCR扩增β-肌动蛋白和/或GAPDH(甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶)mRNA。
根据实验手册，以寡聚dT和/或随机六聚体为引物，使用GeneAmpRNA PCR试剂盒(Perkin-Elmer)，将20-50ng的mRNA反转录，20μl终浓度。2-5μl cDNA(反转录的嗜伊红粒细胞信息)和200μM dNTPs和50-100pmol退化引物在50μl体积里进行混合。镁离子浓度和pH适合于每一个引物对，镁离子浓度从1.0到3.0mM波动，pH波动于8.5到10.0。尽管评价了多种循环参数，但是通常所用的条件类似于下面94℃,30秒；37℃,30秒；2分钟缓升到72℃,1分钟，然后30个循环94℃,45秒；48℃,1分钟；72℃,1分钟。
对于分离到的201bp片段，引物对2a-1和7-1，或引物对2a-1和3R，被用在PCR反应中，60mM Tris-HCl,pH9.5and 1.5mM MgCl2。1μl每个反应的产物被用在PCR独立的循环，使用“裸露”引物2a-2和3R。裸露PCR的反应条件完全同于第一个PCR中所述。
用琼脂糖凝胶电泳评价和分离PCR产物，用pCR-ScriptTMSK+克隆试剂盒纯化并亚克隆适当长度的片段。(适当的片段长度如下区域2a和7的引物对的PCR(见上表)，为约700bp长度；对来自区域2a的引物和引物3R的PCR，为约200bp长度；以引物3F和区域6b的引物的PCE，为约400bp长度，对以引物3F和区域7引物的PCR，为约550bp的长度)。根据假设相关的受体蛋白有结构相似性，可以预测片段的尺寸。快速筛查实验为了快速从大量克隆中检测出新的7TMS家族成员，如前述获得的细菌克隆插入子(即包括适当长度片段的质粒转染体亚克隆到pCR-Script SK+)，通过PCR用互补于填补多聚连接pCR-ScriptTM的填补序列T3和KS引物进行筛查。特别是，过夜转化的细菌克隆一部分直接混合于40μl的PCR混合物，包含200μM dNTPS,20mM Tris,pH8.5,50mM KCl,2.5mMMgCl2,50pmol各种引物和0.25活性单位Taq多聚酶。循环条件是25次循环94℃,20秒；55℃,20秒；72℃,30秒。通过在1.5％琼脂糖凝胶上评价20μl PCR产物来鉴定合适长度的插入子。用AluⅠ,HhaⅠ，和RsaⅠ降解剩下的20μl反应产物，并溶解于12％聚丙烯酰胺凝胶以筛查不同的降解模式。选择不同模式的克隆进行序列分析。结果产生于退化寡聚核酸PCR片段的序列分析，在pCR-Script中鉴定出一个201bp部分cDNA克隆(退化寡聚核酸是2a-1,2a-2,3F,3R和7-1)。该部分克隆称为Eos L2(也指L2和EL2)，与MIP1α/RANTES受体之间有78.3％的氨基酸相似性，和MCP-1受体之间有60.8％的氨基酸相似性，最近对序列碱基数据的查找发现这个部分克隆是唯一的。Southern和Northern分析标记PCR片段并用来探针Southern和Northern印迹，为准备PCR探针，用限制性内切酶EcoRⅰ和NotⅠ从pCR-Script载体释放201bp片段。240bp片段的降解结果包含201bp片段加上载体多聚连接的39个碱基对，通过琼脂糖凝胶电泳从载体上分离并纯化片段(Magic Mini Prep,Promega Corp.Madison,WI)。根据实验手册推荐的方法用购买于Boehringer Mannheim的随机引物DNA标记试剂盒标记大约200ng材料。
为Southern印迹，用限制性内切酶过夜处理基因组DNA(购买于Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA)并通过在0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，再毛细管转移到羟基-N尼龙膜(Amersham)，在包含5×Denhardt’s溶液(1×Denhardt’s溶液是0.02％牛血清白蛋白，0.02％Ficoll),10％w/v硫酸葡萄糖，2％SDS，和带鞘沙丁鱼卵DNA(100μg/ml)的6×SSC(1×SSC是0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠)65℃过夜杂交。用2×SSC,0.5％SDS、65℃洗涤膜两次，再用0.2×SSC、0.5％SDS,65℃洗涤两次。
Southern杂交显示单一强烈杂交片段和单一微弱杂交片段，和各自所用酶杂交。微弱杂交片段可能是MIP1α1/RANTES受体。
多组织Northern印迹购买于Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA。ExpressHybTMSolution购买于Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA。ExpressHybTMSolution也是购买于ClontechLaboratories,Inc.。按照实验手册的方法进行Multiple TissueNorthern印迹，探针如上面Southern印迹。Northern杂交结果显示在脾脏、边周血白细胞和胸腺细胞高水平的1.6kb信号，额外的Northern分析见于实施例5。筛查基因组文库用EMBL3 SP6/T7载体构建人基因组噬菌体文库，载体购买于CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,CA)。用201bpPCR片段筛查得到全长克隆，大约25,000个斑点形成单元混合于600μl过夜的E.coli菌株K802的细菌培养基，由NZCYM顶部琼脂糖的文库提供并铺板于包含NZCYM琼脂(NZYCM肉汤，琼脂和琼脂糖购买于Gibco/BRL)的150mm平板。37℃温育7小时后，在平板上铺BA-85硝酸纤维素膜(Schleicher andSchuell,Keene,NH)5分钟让噬菌体转移到膜上。膜在失活溶液中浸泡5分钟(1.5M氯化钠，0.5N氢氧化钠)，再用1.5M氯化钠，0.5M Tris,pH8.0中和。过滤器风干15分钟再于80℃进行真空烘烤2小时。如上面Southern印迹所述用过滤器杂交，201bpPCR片段包含寡聚核苷酸引物2a-2(TM2)a和3R(TM3)之间的序列。
基因组噬菌体克隆，标为Eos L2.8，包含带有Southern印迹中1.8kb HindⅢ片段的插入序列(完全的插入长度不明确但大概是17kb)。
用HindⅢ限制性内切酶降解噬菌体克隆Eos L2.8，琼脂糖电泳，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。1.8kb片段重溶解于水，连接到pBluescriptⅡKS+载体的HindⅢ位点(Stratagene)，然后转化到购买于Gibco/BRL的DH5α活性细胞。
对HindⅢ片段的两条链进行测序，片段中含有Eos L2受体的全部氨基酸编码序列，将该序列和下述cDNA克隆进行比较显示该克隆是全长克隆。1065核苷酸的开放阅读框编码一个355个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:2)，预测其分子量为41Kd。
比较全长Eos L2受体序列和MIP1α/RANTES和MCP-1受体序列发现分别有73.4％和60.5％的氨基酸相似性。为这个比较，手工排列序列，氨基酸总数乘以100倍来划分。
也可以用MegAlignTM(DNASTAR,Inc.)按照簇方法排列序列，和其他趋化因子受体序列进行比较发现和CKR-1,CKR-2B,和CKR-4之间分别有62％、47％、和41％的氨基酸相同性。相反，和IL-8受体A和B的氨基酸相同性，两者都只有27％。该受体与MIP1α/RANTES和MCP-1受体的氨基酸相似性，两个C-C趋化因子受体的实验结果和这里所报道的相吻合，说明EosL2是一个C-C趋化因子受体。
实施例3转染细胞株中Eos L2的表达FLAG-标记的Eos L2(CKR-3)受体结构按下法构建Eos L2受体融合蛋白1．pCDM8中的一个FLAG-PAF受体结构[按报道的方法构建，Kunz,D.et al.,J.Biol.Chem.,267:9101-9106(1992)]用HindⅢ和EcoRi双重降解，释放出包含FLAG多肽编码核酸的48bp片段，核酸序列是AAGCTTCCA GCA GCC ATG GAC TACAAG GAC GAC GAT GAC AAA GAATTC(SEQ ID NO:15)。氨基酸序列是MDYKDDDDKEF(SEQ ID NO:16)。包含FLAG核苷酸的48bp HindⅢ/EcoRⅠ片段亚克隆到pcDNA3载体的HindⅢ/EcoRⅠ位点(Invitrogen,San Diego,CA)，生产pcDNA3/FLAG。
2．用BamHⅠand Xho降解包含1.8kb Eos L2 HindⅢ片段的pBluescriptⅡKS+载体，释放出一个1.261kb片段，这个BamHⅠ-XhoⅠ片段包含穿过终止密码子并加上相同3’不翻译区域的核酸所编码Eos L2氨基酸91，还生成21bp的pBluescriptⅡKS+载体。
3．制备两个PCR引物，用来扩增Eos L2基因的5’端，转移第一个Met并接入EcoRⅠ位点，已经在第一步有描述，5’引物是(SEQ ID NO:17):
EcoRⅠ5’-TTAA GAATTC ACA ACC TCA CTA GAT AC该引物包括EcoRⅠ位点，除Met密码子外EosL2基因的前面17个核苷酸。
3’引物(SEQ ID NO:18)是5’-CATAGT GGATCC AGAATGEos L2基因的引物序列恰好是在BamHⅠ位点的3’端，通过pBluescriptⅡKS+载体用着两个引物来扩增，载体包含1.8kb EosL2片段作为模板扩增280bp片段，可以用EcoRⅠand BamHⅠ降解Eos L2的5’端，得到的片段用来如下述连接实验。
扩增的条件是100ng pBluescriptⅡKS+，包含1.8kb Eos12片段连接于在50μl反应体积里有200μM dNtps和50pmol引物，最后镁离子浓度是2.5μM和pH为8.0。片段进行扩增25个循环94℃,30秒；55℃,30秒；72℃,30秒。扩增产物分离于琼脂糖凝胶，如上进行电泳纯化。用EcoRⅠand BamHⅠ降解片段，在琼脂糖凝胶电泳上进一步纯化。
4．为构建Flag-标记的Eos L2基因，包含有FLAG片段的pcDNA3载体(描述于步骤1)用EcoRⅠ和XhoⅠ降解，通过电泳从多聚连接体分离载体片段(EcoRⅠ-XhoⅠ片段包含FLAG编码序列)，载体片段如同其他电渗出片段一样纯化。载体片段连接于PCR步骤3生成的EcoRⅠ-BamHⅠ片段，这两个片段来于步骤2。全部三个片段连接在一起，生成pcDNA3中的FlAG-tagged EosL2受体。连接的DNA转化入DH5a。瞬间转染293细胞(ATCC保藏号No.CRL1573)生长于培养基Minimal Essential Medium(MEM)Alpha Medium，购买于Gibco/BRL，并补充以10％小牛血清，谷氨酸，和青霉素/链霉素(都是购买于Gibco/BRL)。对于每一次瞬间转染，转染前一天将2×106293细胞放在平板上，35-mm的组织培养板，在转染的时候，细胞(贴壁生长的)用磷酸缓冲液洗涤一次(PBS,Gibco/BRL)，将DNA和lipofectAMINETM试剂(Gibco/BRL)的混合物给予细胞。
DNA/lipofectAMINETM试剂混合物，是通过在终浓度100μl OptiMEMTM(Gibco/BRL)里的2μg Flag-标记的Eos L2受体表达载体和100μl体积里的12μl LipofectAMINETM试剂，在室温下温育45分钟得来。最终体积是200μl。温育45分钟后，加800μl OptiMEMTM到200μl DNA/lipofectAMINETM试剂里，取1ml溶液铺在上述细胞上。细胞在37℃温育5小时，同时加入上述的1ml MEM Alpha Medium补充培养基，细胞继续温育另外12小时，这时移去所有培养基，并用PBS和2mls MEM Alpha培养基补充剂洗涤细胞两次。转染细胞温育额外的72小时。在PBS 10mM EDTA中温育后用温和的移液法收集细胞。
FLAG-标记的Eos L2的细胞表面表达，在转染293细胞上已经有证实。用荧光染色分析或FACS分析确定大约2.6％的细胞在表面表达受体。发现一些细胞的表达水平比背景大2log,说明该细胞的高表达水平。因为Eos L2基因在pcDNA3表达载体上(Invitrogen Corp.,San Diego,CA)，带有新霉素抗性基因，通过新霉素(G418)选择法可选出稳定的293转染子。稳定的细胞株用FLAG-标记的受体已经产生了超过500个稳定的鼠L1-2前B细胞株，L1-2pre-B细胞来自于(Dr.Eugene Butcher,StanfordUniversity,Stanford,CA)，生长于RPMI-1640(Gibco/BRL)培养基，补充10％BSA和青霉素/链霉素，从超过200个克隆中筛查细胞表面表达，先用M2抗-FLAG单克隆抗体染色(InternationalBiotechnologies,Inc.,New Haven,CT)，再用抗鼠Ig-FITC(JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.)染色，用荧光激活细胞分类法分析(FACS)。免疫荧光染色法和FACS分析按照CurrentProtocols in Immunology,Vol.1,Coligan,J.et al.,Eds.,(JohnWiley&Sons,Inc.,New York,NY)进行。对多个细胞株的FACS分析结果显示许多克隆表达高水平的Eos L2标记受体(图5)。未转染细胞(未显示)染色为阴性。有高度表达的稳定的细胞株能够用做免疫原来制备有Eos L2受体反应活性的抗体。另外，这些细胞株对于研究趋化性和配体结合十分有用。杆病毒表达为构建杆病毒表达载体，用HindⅢ降解pcDNA3中的Flag-标记的Eos L2受体，以移去Flag-标记基因。HindⅢ片段包含基因是用Klenow片段和dNTP’s填补超序列得到的钝端基因。钝端片段亚克隆到pVL1393(Invitrogen)的SmaⅠ位点。2.0μgpVL1393载体(包含Eos L2基因)与0.5μg AcMNPV病毒DNA(Invitrogen)混合。并按照实验指导用InsectinTM(Invitrogen)共同转染到Sf9昆虫细胞(Invitrogen)。第二天用5ml SF-9培养基[Grace’s Supplemented Insect Media(Gibco∥BRL)含有10％小牛血清]替换SF-900培养基(无血清)。细胞生长五天，以斑点纯化重组病毒，具体参见D.R.O’Reilly,L.K.Miller,and V.A.Luckow(1994)杆病毒表达载体A Laboratory Manual,OxfordUniversity Press,PP.149-158。
通过用纯化充足病毒斑点感染Sf9细胞，在Sf9细胞上获得Eos L2受体的表达。Sf9细胞(2×106cells/ml)受到感染，感染率为10∶1。感染进行72小时，用M2抗FLAG抗体染色。
用Sf9细胞中的杆病毒表达系统也获得了该受体的成功表达。基于抗-FLAG抗体染色获得了良好的表达水平(见实施例5)。用同种细胞Sf9转染子也获得了配体结合，通过FACS分析受体的表达。然而，用碘化丙锭排除法，可以显示缺陷的细胞表面表达，和阴性对照相比，这些细胞上的表达是很低的(即，用表达载体转染的Sf9细胞缺少Eos L2基因插入子)。为更高的细胞表面表达，可以降低感染长度，MOI可以进一步适应化。
实施例4配体结合研究配体结合过程用Eos L2受体转染的细胞或正常纯化的人嗜伊红粒细胞用Hanks平衡盐溶液洗涤(HBSS)，重新溶解于结合缓冲液50mMHEPES,1mM CaCl2,5mM MgCl2,0.5％Bovine Serum Albumin(BSA),pH7.3。在微离心管里，5×105细胞和0.1nM放射标记趋化因子温育(购自New England Nuclear,Massachusetts),200μl的量室温下60分钟。细胞单独与放射性标记趋化因子温育，或与作为竞争剂的未标记趋化因子温育(来自PeproTech)，使用表明的浓度。温育后，用结合缓冲液洗涤三次，每次洗涤都经过离心，7,000xg 2分钟。洗涤后，沉淀转移到LP3管里，细胞的放射性标记用gamma计数仪测定结合量。所有样品用两份，实验至少重复三次。在Macinto计算机上用MicroSoR Excell和CricketGraph计算结合数据。结合人嗜伊红粒细胞基于趋化性实验的发现，配体结合研究集中在RANTES,MIP-1α和MCP-3。放射标记趋化因子或不同冷的趋化因子作为竞争剂，进行配体结合研究。纯化的正常人嗜伊红粒细胞与0.1nM125Ⅰ-标记的MIP-1α或RANTES温育，存在或不存在不同冷趋化因子。进一步洗涤细胞后，用gamma计数仪测定结合。
图6是一个柱形图说明人嗜伊红粒细胞和RANTES、MIP-1α的结合，或者其他β-家族趋化因子，例如，MCP-1,MCP-3和RANTES。相反，嗜伊红粒细胞结合RANTES十分紧密。RANTES的结合不能够被过量冷MIP-1α有效抑制，说明在嗜伊红粒细胞上可能有不同于MIP-1α和RANTES的受体。
Scatchard点分析说明有1.8×103MIP-1α结合位点，亲合度为91pM。分析也显示对Rantes有较低的亲合度(883pM)，有较多的结合位点(3.6×104/cell)。在所用条件下，对嗜伊红粒细胞MCP-1没有显著结合，MCP-1不抑制RANTES的结合，除非在一个高的浓度(过量2500倍，图7)。Eos L2受体转染子在Eos L2的克隆和表达之后，转染细胞被用来检测和大量趋化因子的结合，用293转染子的第一次尝试是不成功的，加入冷趋化因子干涉结合，这也是其它的研究人员发现的一个现象。相反，用杆病毒感染SF9细胞，可以检测到好的RANTES结合。SF9细胞的检测条件不同于哺乳动物细胞。0.1nM125Ⅰ-labeledRANTES的结合发生于50mM HEPES,pH7.3,5mM MgCl2和1mM CaCl2，补充0.5％BSA。室温下60分钟后，用含有0.5MNaCl的结合缓冲液洗涤细胞三次，用gamma计数仪计算细胞沉淀中的放射性。
在这些配体结合实验里，MIP-1α或RANTES结合最有效的异源竞争剂是MCP-3。事实上，MCP-3也有效抑制MCP-1结合于活化T细胞。因此，MCP-3表现为结合CKR-1,CKR-2和CKR-3[CKR-1,Gao,J.L.,et al.,J.Exp.Med.,177:1421(1993)and Neote,K.,et al.,cell,72:415-425(1993)；CKR-2,Charo,I.F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:2752-2756(1994)and Myers,S.J.,et al.,J.Biol.Chem.,270:5786-5792(1995)]。
放射标记MCP-3也用于结合研究。细胞与0.1nM125Ⅰ-标记的MCP-3温育，结合缓冲液是HBSS加0.5％BAS和0.1％叠氮化钠。在37℃进行结合30分钟。细胞通过在800μl 20％蔗糖中以12,000xg离心2分钟将未结合同位素标记分离。试管封口后，在干冰里冷冻。用钳子铰开顶部后进行计数。
实施例5嗜伊红粒细胞趋化因子量体的表达为证实Eos L2受体是嗜伊红粒细胞上的功能性受体，用下法检测受体的表达(a)Northern印迹分析，和(b)用单克隆抗体或受体反应活性的抗多肽抗体的细胞流计。人嗜伊红粒细胞、中性细胞和PBMC的纯化嗜伊红粒细胞分离于肝素化血液，个体患有嗜伊红粒细胞增多症。梯度离心，用抗-CD16磁珠阴性选择。从Percoll离心得到的粒细胞部分CD16微珠温育30分钟。细胞上MACS柱，收集通过的嗜伊红粒细胞，组织学检查嗜伊红粒细胞的纯度＞99％。
室温下通过密度梯度离心从肝素化静脉血分离人中性细胞[Coligan et al.,Eds.,1992,Current Protocols in Immunology,(JohnWiley&Sons；New York,NY)]。RBCs裂解除去。
分离PBMCs(Coligan et al.,Eds.,1992,Current Protocols inImmunology,(John Wiley&Sons；New York,NY))。通过以磁化颗粒的CD14阳性选择纯化单核细胞，将淋巴细胞通过尼龙布来分离T细胞。为生成CD3胚细胞，2×106PBMCs/ml在RPMI-1640加10％FCS中被加入到组织培养盘，其首先外被抗-CD3抗体TR77。4-6天后，胚细胞转到新鲜培养基，补充IL-2(Genzyme)50单位/毫升。Northern分析CKR-3在嗜伊红粒细胞上选择性表达尽管趋红素是嗜伊红粒细胞的一个选择性趋化吸引剂，CKR-3受体也结合RANTES和MCP-3，它们都可吸引单核细胞和T细胞。在不同的白细胞类群中检测受体的信息表达。
初期Northern杂交(参见实施例2)显示，约1.6kb信息在脾、外周血白细胞、胸腺、一些白细胞亚类、如嗜伊红粒细胞和T细胞，以及在HL-60细胞系中都被表达。在嗜伊红粒细胞化的过程中，加入丁酸可以诱导在HL-60细胞中信息水平的急剧升高。
这就表明该信息很可能是Eos L2的，因为对在Southern印迹中杂交的MIP1α/RANTES受体的信息较弱并且被报道为3.0kb。当原始的201bp PCR片段被用在Southern印迹中作为探针时，就见到强力杂交的1.8kb HindⅢ片段。这就是所克隆和讨论的片段。除了这个片段之外，也观察到了约10kb的弱杂交的片段。该10kb的片段相应于所报道的MIP1α/RANTES受体的HindⅢ片段尺寸。该MIP1α/RANTES受体产生一个约3kb的信息，这是在Northern印迹中没有见到的。因此，在Northern印迹中见到的约1.6kb的信息可能来自于Eos L2基因。至此，EosL2的最丰富的表达是在来自于高嗜伊红粒细胞综合症患者的纯化嗜伊红粒细胞制剂中见到的(参见实施例8)。
因为CKR-3和其他CC趋化因子受体之间高度序列同源，以及在Southern印迹中与多种序列的全长克隆杂交的事实，在另外的Northern分析中使用了250bp片段该片段来自于在Southern印迹中不与其它的序列交叉杂交的基因组克隆的3’-未翻译区。杂交时，使用了包含1203-1453核苷酸的对CKR-3特异的3’-未翻译区探针(图1C)。
用来自不同的白细胞种群的RNA制备Northern印迹的材料，包括单核细胞、中性细胞、淋巴细胞、T细胞、用CD3 Mab活化产生的T细胞胚细胞，以及嗜伊红粒细胞。根据厂商的手册使用TriZOLTM制剂(Gibco/BRL)分离RNA。从每个高纯化白细胞种群中分离的总RNA各取15μg，于1.2％甲醛琼脂糖凝胶上分离，转移到Nytran-PlusTM尼龙膜(Schleicher and Schuell)，用Stratalinker交联。根据厂商的手册，用ExpressHybm Solution(Clontech)进行与放射性标记的3’-未翻译区探针的杂交。将Northern印迹在有增强膜的条件下对X-OMAT AR暴光3-5天。在0.5％SDS中煮沸去除CKR-3特异性探针，用自对照至各种浓度的β-肌动蛋白对印迹再次探针检测。
唯一能够有可检测信号的细胞类群是嗜伊红粒细胞，发现有一个1.8kb的信号。这些结果与在图13A-13D中的免疫学探察到的表面表达相一致。虽然在本实验中，静息态及活化的T细胞中都没有探察到信息，但是，有可能的是，T细胞的某个亚组表达受体。与嗜伊红粒细胞趋化因子受体反应的单克隆抗体(MAb)用对应于N端35氨基酸的合成多肽免疫老鼠，产生与EosL2受体反应的Mab。根据核苷酸序列(见图1A-1C；还可见SEQID NO:2)推测的Eos L2的N端35氨基酸被合成，并且与载体蛋白PPD偶联(Purified Protein Derivative of Mycobacteriumtuberculosis；Severn Biotech Ltd.,Cambridge,U.K.)。
雌性Balb/C小鼠用在4被PBS中的50μg的这种肽-载体共轭物免疫。使用Freund＇s完全(第一次注射)和Freund＇s不完全辅剂(随后的注射)将肽-载体共轭物腹膜内注射。最后免疫是通过无佐剂的静脉内注射。从合成多肽免疫过的老鼠收集多克隆抗血清。
进行两次成功的融合，产生超过15,000个的杂合子。最后一次注射四天后，取脾脏，在无血清DMEM培养基制备单一细胞悬液。这些细胞和SP2/0融合，具体操作如Galfre,G.等人所述[Galfre,G.et al.,Nature,266:550-552(1977)]。20ml的脾细胞和20ml的SP2/0合并起来，以800g旋转5分钟并去除培养基。将预温热到37℃的50％聚乙二醇1500在2分钟内加入到细胞中，然后在3分钟内加入10ml的DMEM培养基。细胞悬浮液以400g旋转3分钟，取出上清液。温和地将细胞重悬浮于DMEM培养基中，该培养基含20％小牛血清、2mM谷氨酸、100units/ml青霉素、100μl硫酸链霉素和HAT选择培养基。将细胞加到96孔平底微滴盘，每孔200μl。
10-14天后，通过ELISA实验，用酶标记抗鼠抗体检测孔上清液对多肽的反应性。大约筛选出200个mAb，说明对合成多肽的强反应性。通过限制性稀释亚克隆感举趣的杂合子。
为了确定那些抗体能够识别天生的表面表达分子，将Mab对用带有Eos L2基因组DNA的AcMNPV病毒感染的Sf9昆虫细胞进行筛选。这些昆虫细胞在细胞表面表达了Eos L2(CKR-3)受体，利用强抗-FLAG对约10％细胞的染色来判定的。先用M2抗-FLAG抗体再用抗鼠Ig-FITC进行染色，用荧光激活细胞分类法分析，通过FACScan分析来定量表达[Current Protocols inImmunology,Vol.1,Coligan,J.et al.,Eds.,(John Wiley&Sons,Inc.；New York,NY)]。
大约33％的抗多肽杂合子与Eos L2转染昆虫细胞反应，染色模式用于FLAG抗体，用抗鼠Ig-FITC作为第二抗体的FACS分析来确定。未转染昆虫细胞用抗FLAG染色是完全阴性。抗多肽抗体检测对抗未转染细胞，染色阴性。
能够染色转染昆虫细胞的Mab，用FACS分析来检测其与人嗜伊红粒细胞、边周血淋巴细胞、单核细胞、中性细胞、活化T细胞的反应性。用mAb LS25-5H12，再用FITC-抗鼠Ig进行细胞染色(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)。通过使用过量的正常人血清，控制Fc受体结合。
所有的嗜伊红粒细胞都被选择的抗-Eos L2 mAb、LS26-5H12染色。在检测条件下，中性细胞没有显著地被LS26-5H12染色。根据所预期的Eos L2受体的分布，以及其在RANTES结合中的功能，MAb LS26-5H12表现为识别该受体的天然的表达形式。除了LS26-5H12 Mab外，有约五种另外的Mab表现了相类似行为。
通过限制性稀释，进一步纯化LS25-5H12杂合子，在另一个实验里，用MAb LS26-5H12染色高度纯化的白细胞亚基，用细胞流计分析，染色模式代表至少四次实验。基于CD3染色鉴别T细胞，通过向前和侧向散光来监别单核细胞和中性细胞。
LS26-5H12强烈染色了高纯度嗜伊红粒细胞，说明嗜伊红粒细胞表面受体丰富的表达，和配体结合与Scatchard分析确定的高受体数目的结果相吻合。中性细胞、血T细胞和单核细胞表现出弱的或没有该MAb染色性。后来用再克隆杂合子抗体进行的实验结果，说明CKR-3在嗜伊红粒细胞上选择性表达，在其他供试白细胞类型无明显表达。然而有可能是T细胞亚族表达受体。
实施例6选择稳定的L1.2细胞转染物2％-5％瞬时转染的COS、HEK-293和CHO细胞用对FLAG-标记的受体鉴定为细胞表面阳性(见上述)，而大部分细胞内蛋白质可以被检查到，说明蛋白质运输的效率差。L1.2鼠pre-B细胞系被用来选择具有更高表面表达水平的细胞系，用于进一步对CKR-3的配体结合特异性和信号的传导进行评价。该细胞系已经被成功地用于对其它的趋化因子受体的研究中(Honda,S.,et al.,J.Immunol.,152:4026-4035(1994))，被转染的人趋化因子受体赋予了独各种配体的特异性趋化因子能力。
为监测CKR-3的表面表达，通过用序列对应于CKR-3N端35个氨基酸的合成多肽免疫老鼠，在受体N端区域产生单克隆抗体MAb，用ELISA检测抗多肽MAb，根据与人嗜伊红粒细胞的反应性和对瞬间转染子的染色，来鉴定识别天然受体的MAb。构建CKR-3/pcDNA3插入HindⅢ限制酶位点并对紧靠启始密码子的5’Kozak序列优化，对包含在1.8kb基因组片段中的CKR-3基因进行PCR。编码区和338bp的3’-未翻译区被插入到pcDNA3的HindⅢ位点，使该基因受载体的人CMV立即早期基因启动子控制。建立这个FLAG-标记的Eos L2(CKR-3)受体构建物的细节在实施例3中给出。转染和稳定的细胞系选择鼠前B淋巴细胞株L1.2由Eugene Butcher博士提供(Stanford University)并生长于RpMI-1640培养基中，补充以10％牛血清。20μg线性化的CKR-3/pcDNA3按照下述用来转染细胞株。L1.2细胞在HBSS中洗两次，并重悬浮于0.8ml相同的HBSS中。质粒DNA和细胞混合，室温下温育10分钟，转入0.4cm电渗透管，单一脉冲250v,960μF。室温温育10分钟后进行电渗透。加入G418，终浓度为0.8mg/ml，转染48小时后，细胞加入到96孔盘中，25,000细胞/孔。用药物选择2-3周后，G418抗性细胞用5H12抗-受体mAb染色(见下面)并用FACScan分析。
具有可检测表面染色的细胞株，用限制稀释进行扩展和多次克隆，通过Northern杂交进一步分析有最亮表面染色的克隆，以确证转染受体的存在，也可用RT-PCR法分析，互补于pcDNA3载体的T7引物为5’引物，CKR-3特异性引物为3’引物，在未加逆转录酶之前没有扩增反应。
为了短暂的转染，电渗透中使用20μlg超螺旋DNA，和制备稳定的细胞株完全一样，48-72小时后检测细胞表面染色。
用CKR-3/pcDNA3转染的L1.2细胞在组织培养基中稀释到1×106cells/ml。加入N-丁酸(钠盐，Sigma Chemical Corp.,Cat.No.B5887)至终浓度5mM(从1M母液被组织培养基稀释获得)。使用前，细胞生长过夜在37℃和5％Co2条件下(18-24小时)。较低浓度也已经被成功地使用了。N-丁酸盐处理已经被报道能诱导蛋白质水平提高约10倍，相对于未被诱导的对照而言。被人CMV立即早期基因启动子驱动的CKR-3mRNA水平被n-丁酸盐处理显著地提高了。单克隆抗体制备和细胞流计合成多肽反应活性MAb按实施例5的方法来制备。MAb按照下述用ELISA筛选。50μl肽，浓度为在碳酸盐缓冲液中2μg/ml，将其用于包被NUNC96孔Maxisorp盘，4℃下至少4小时。300μl/孔的封闭缓冲液(PBS+1％BSA)被加入，至少2小时。盘子被用PBS/Tween20洗至少4次，将50μl的Mab上清液加入到每个孔中，并在37℃下培养1小时。用PBS/Tween20洗盘子4次，在每个孔中加入在PBS中按1∶500稀释的碱性磷酸盐-共轭的第二抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories,WestGrovePA)。在37℃下培养30分钟后，用PBS/Tween20洗盘子4次。用于颜色反应的底物是溶于二乙醇胺缓冲液中的p-硝基苯基磷酸盐(Bio-Rad)。盘子在ELISA阅读器上以410nm读取数据。
为确定哪个抗多肽MAb能够识别天然的表面表达的CKR-3，利用短暂转染细胞和嗜伊红粒细胞筛查抗多肽MAb。为了MAb染色，细胞用PBS洗涤一次，并重悬浮于100μl的PBS中，其中含有2％FCS、0.1％叠氮化钠、5μg/ml纯化的抗体、5μg/ml与对照Mab相配的同型MOPC-21 IgG1或100μl杂交瘤培养上清。在4℃下30分钟后，细胞用FACS缓冲液洗两次，重悬浮于100μl FITC-共轭的亲和纯化F(ab’)2山羊抗-鼠IgG。培养在4℃下30分钟，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，FACScan分析以确定表面的表达水平，碘化丙锭被用来排除死细胞。表面受体表达稳定转染子图10A显示瞬间转染受体的可检测表面染色，在L1.2细胞的亚类群上进行，使用抗受体Mab,LS26-5H12。未转染L1.2细胞为阴性。按上面所述，对转染物进行有限稀释克隆并选择比较高的表面染色来建立了稳定的细胞系。该过程产生了有较高受体表达的细胞株(图10C)。Northern印迹分析证实一个亚克隆中转染CKR-3mRNA的存在，标为E5，在未转染L1.2细胞没有存在(未显示)。
实施例7稳定L1.2转染子的配体 结合特异性趋化因子重组人趋化因子得自于Peprotech,Inc.(Rocky Hill,NJ)，除了人趋红素是利用固相合成法合成的，本法特别适于全自动多肽合成仪(model 430A；Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)，所述如[Clark-Lewis,I.,et al.,Biochemistry,30:3128-3135(1991)]。人趋红素也可从该Peprotech公司购买。标记用Bolton Hunter试剂(NEN)制备125Ⅰ-标记趋红素，具体见[Coligan,J.E.,et al.,Eds.,1992,Current Protocols inImmunology(New York:John Wiley and Sons)]。经计算，放射性标记趋红素的特异活性为180 Ci/mM。配体结合用已经报道的改良方法[Van Riper,G.,et al.,J.Exp.Med.177:851-856(1993)]进行趋化因子对靶细胞的结合实验。细胞用PBS洗涤一次，重悬浮于结合缓冲液(50mM HEPES,pH7.5,1mM CaCl2,5mM MgCl2,0.5％BSA和0.05％叠氮物)，浓度为1×107/ml。将50μl的等份试样(5×105细胞)分布于试管，加入冷竞争剂和放射标记的趋化因子，终浓度为200μl。非特异结合被确定下来，通过在250-500nM未标记趋化因子存在下，细胞和标记趋化因子温育来实现。室温下培养60分钟后，用含有0.5M的NaCl结合缓冲液洗涤细胞三次。进行细胞计数。
竞争表示为特异结合的百分比，按100(S-B)/(T-B)计算，S是样品的放射性，B是背景结合，T是没有竞争剂的总结合。通过细胞和放射标记趋化因子以及至少400倍过量的未放射标记趋化因子温育，获得背景结合。趋红素和E5细胞的总结合是11611±119cpm，背景结合是2248±745cpm。趋红素和嗜伊红粒细胞的总结合是7866±353cpm，而背景结合是1148±518cpm。实验中都进行双份，而且标准偏差都低于平均值的10％。用KaleidaGraph software计算曲线。
实施例6中的E5细胞株，用来检测其结合放射标记趋红素的能力。细胞与0.6nM125Ⅰ-标记的趋红素和不同浓度的冷竞争剂温育。图11A显示转染细胞特异结合125Ⅰ-标记的趋红素并具有高亲和性。对结合数据用Scatchard分析表明分离系数(Kd)为1.5nM(图11C)，类似于用纯化人嗜伊红粒细胞活动的数据0.5nM(图11D)。此外，RANTES and MCP-3能够竞争结合。没有任何其他趋化因子包括MIP-1α、MIP-1β、和IL-8可以特异性竞争放射标记的配体(图12)。趋化性实验用改良的透内皮实验评价人嗜红细胞的趋化性[Carr,M.W.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3652-3656(1994)]。实验用内皮细胞是欧洲保藏物中心(European Collection of Animal CellCultures,Porton Down,U.K.)的ECV304细胞株，在6.5mm直径BiocoatTranswell组织培养器(Costar Corp.,Cambridge MA)上培养内皮细胞，3.0μM的孔径。ECV304的培养基由M199+10％小牛血清，L-谷氨酸和抗生素组成。
检测培养基包括等量RPMI1640和M199，以及0.5％BSA。实验前24小时，每个24孔趋化反应板上装2×105ECV304细胞，37℃温育。向24孔组织培养板加入趋化因子(以检测基质稀释)，终体积为600μl。内皮覆盖的组织培养物插入每个孔，并向上室加106细胞，终体积为100μl。平板在37℃,5％二氧化碳/95％空气中温育4小时。
用细胞流计来计算迁向下室的细胞，将500μl下室细胞悬液装入试管，每30秒一个时间段计数细胞，本方法具有可重复性，并且只让白细胞通过而排除碎片或其他细胞。本方法的计数结果和显微镜计数结果相吻合。
相同的方法还可用来评价L1.2细胞或L1.2受体转染细胞的趋化性，不同的是Biocoat Transwell组织培养装填子不外被内皮细胞。带有趋红素RANTES和MCP-3应激趋化性L1.2细胞的CKR-3表达在一系列浓度下检测L1.2受体转染子对一组趋化因子作出应激性迁移的能力。CKR-3表达细胞E5对趋红素，RANTES和MCP-3表现出趋化反应，且对趋红素的峰值为100ng/ml，尽管在低至10ng/ml的浓度下都能够检测到特异性迁移(图13A)。虽然对RANTES的应答在10ng/ml和100ng/ml都是明显的，但是应答强度低于趋红素。MCP-3对E5细胞的趋化吸引能力低于嗜伊红粒细胞，在低于100ng/ml检测不到迁移。本细胞株对其他供试趋化因子无显著应答。在其他对照实验中，向上孔加入趋化因子细胞并不迁向下室，证实了细胞迁移是趋化性的而不是化学促进性的(未示出)。
未转染L1.2细胞对任何供试趋化因子无应激性迁移(图13B)。的确，L1.2细胞的一个显著特征就是对非特异性配体仅有微弱背景趋化性。作为特异性对照，被IL-8RB转染的L1.2细胞不仅对NAP-2和ENA-78应答(未示出)，而且对IL-8和GROα(图17C)应答并有特异性迁移，但是不应答其他CXC或CC趋化因子。其他转染入L1.2细胞的趋化因子受体对其特异配体也有趋化能力，包括CKR-2转染子(应答MCP-1和MCP-3),CKR-1转染子(应答MIP-1α)和IL-8RA转染子(应答IL-8)(未示出)。百日咳毒素完全抑制了嗜红细胞和CKR-3转染子对趋红素的趋化应答，标志着在普通细胞和转染细胞中，受体都是通过Gα亚族传递信号[Simon,M.I.,et al.,Science,252:802-808(1991)](未示出)。嗜伊红粒细胞的趋化特性类似于CKR-3转染子为评价普通嗜伊红粒细胞的功能是否类似于CKR-3 L1.2转染子，用嗜伊红粒细胞进行趋化实验，由富含嗜伊红粒细胞(6-8％of WBC)的数个正常个体(人)获得这些细胞(纯化按照实施例5进行)。图14A-14B显示在两个不同个体上发现的嗜伊红粒细胞趋化性两种特征模式，一种模式是对趋红素有强烈的迁移，对RANTES和MCP-3只有弱的应答(图14A)，另一种模式是对趋红素，RANTES和MCP-3都有相同的应答。这些模式并非实验差异所致，因为对于每一个对象，在很长的一段时间结果都可重复。在第二类个体，MIP-1α对嗜伊红粒细胞只表现微弱趋化活性。
实施例8编码Eos L2 cDNA的克隆嗜伊红粒细胞cDNA文库的构建嗜伊红粒细胞是从一名被诊断患有自发性嗜伊红粒细胞增多症的病人(M.V.)身上获得[Costa,J.J.et al.,J.Clin.Invest.,91:2673(1993)]。因标准的胍基异硫氰酸/氯化铯法分离RNA[In:Current Protocols In Molecular Biology,Vol.1,Ausubel,F.M.et al.,Eds.,(John Wiley&Sons:New York,NY)page4.2.2-4.2.3(1991)]。用Dynabeads获得mRNA(Dynal Inc.)，用对于cDNA合成和λ克隆的SuperScriptTMLambda系统构建噬菌体文库，它们带由λgt22A、NotⅠ-SalⅠ臂。文库筛查我们双份筛查人嗜伊红粒细胞cDNA文库的约750,000个噬菌斑，所用探针是编码MIP-1α/RANTES受体(CKR-1)的全长放射标记cDNA探针(P4cDNA)[Gao et al.,J.Exp.Med.,177:1421(1993)]。p4cDNA被克隆到pcDNAⅠ的BamHⅠ(5＇)和XhoⅠ(3＇)位点(Invitrogen)。通过限制性酶切获得该克隆的BamHⅠ-Xhol片段(即，p4cDNA在pcDNAI中)，用Gene Clean分离。用随机引物标记试剂盒将该片段标记上32P。
42℃温育两小时使滤膜预杂交，溶液是50％甲酰胺，5×SSC,1×Denhardt’s,10％Dextran Sulfate,20mM TRIS,pH7.5,0.1％SDS。杂交是用相同溶液在42℃过夜进行。嗜伊红粒细胞cDNA文库滤膜的洗涤是用2×SSC/0.1％SDS室温下两次，2×SSC/0.1％SDS 42℃两次。每次洗30分钟，滤膜暴露过夜，选择阳性斑点两次。在低严紧洗涤后，如果双份为阳性，再进一步检测克隆。cDNA克隆的鉴定斑点是纯化的斑点，用少量噬菌体裂解方案分离DNA[In:Current Protocols In Molecular Biology,Vol.1,Suppl.10,Ausubel,F.M.et al.,Eds.,(John Wiley&Sons:New York,NY),page1.13.7(1991)]。用EcoRⅠ(载体臂中位点)和NotⅠ降解噬菌体DNA。降解所释放的插入子在胶上可视化，约1.6kb长。用GeneClean(Bio101)分离斑点中称为Mip-16或M-16中的约1.6kb的插入子，克隆到Bluescript载体KS(Stratagene)的EcoRⅠ和NotⅠ位点，事先用EcoRⅠ和NotⅠ降解以产生非对称末端。连结的质粒导入XL1-Blue大肠杆菌细胞(Stratagene)具体操作见Hanahan所述[Hanahan,D.,(1985),In:DNA Cloning,Volume 1,D.M.Glover,Ed.(IRL Press:Washington,D.C.),pp.109-135]。
用双去氧核苷酸测序试剂盒测序M-16/Bluescript结构体(得自于USB,United States Biochemical,Cleveland,OH)。该克隆的核苷酸序列被确定编码一种高度类似于MIP-1α/RANTES受体的新型蛋白；但是从测序数据看，克隆不是完整长度的。
为鉴定全长克隆，再分离纯化15-20个斑点，用限制性酶分析和/或测序鉴定噬菌体中的插入子。另一个λ克隆M31含有一个1.8kb插入子。插入子克隆到Bluescript载体KS的EcoRⅠ和NotⅠ位点，如上述再导入XL1-Blue大肠杆菌细胞。DNA测序该克隆(M31/Bluescript结构体)，发现它编码一个全长受体。
用EcoRⅠ和NotⅠ降解M31/Bluescript结构体，释放M31插入子，用Gene Clean分离出得到的片段，并插入到载体AprM9的EcoRⅠ和NotⅠ位点，事先用EcoRⅠ和NotⅠ降解生成非对称末端。载体AprM9[de Fougerolles,A.R.et al.,J.Exp.Med.,177:1187-1192(1993)]是CDM8的衍生物，包含pBluescript的β-内酰胺酶和psP64的多聚连接子。得到的结构体A31导入适宜的XL1-Blue细胞。
图2A-2B所示全长cDNA的核苷酸序列和所编码蛋白质的氨基酸序列(还可参见SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)。图2A-2B中所示的cDNA序列确定于克隆A31[碱基15-365(该数字如图2A-2B中所示)]，和M-16/Bluescript结构体[碱基366-1152(该数字如图2A-2B中所示)]。与其它蛋白质比较新受体的氨基酸序列，发现新受体和MIP-1α/RANTES受体之间有62％序列同源，和MCP-1受体之间有50.57％序列同源。用Wisconsin UWGCG包装确定系列同源，并使用了Needleman和Wunsch算法[Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)]。Northern杂交分析用于Northern分析的RNA来自于一名嗜伊红粒细胞增多症病人。分离出嗜伊红粒细胞[Costa,J.J.,et al.,J.Clin.Invest.,91:2673(1993)]。用标准程序分离嗜伊红粒细胞总RNA[In:CurrentProtocols In Molecular Biology,Vol.I.Ausubel.F.M.et al.,Eds.,(John Wiley&Sons:New York,NY)page 4.2.2-4.2.3(1991)]。全RNA在1％琼脂糖胶上分级，在Gene Screen滤膜(New EnglandNuclear)上印迹。根据实验手册上关于高严紧洗涤Gene Screen印迹(New England Nuclear)的方法，在高严紧条件标记滤膜。
准备多个Northern分析，其中一个用M16/Bluescript结构体的EcoRⅠ-NotⅠ片段做探针，其他的用克隆A31的EcoRⅠ-NotⅠ片段做探针，两种片段都包括3＇端未翻译区。用随机引物标记试剂盒(Boehringer Mannheim Biochemicals)将探针标记上32P。
每个Northern印迹都检测到在全部人嗜伊红粒细胞RNA中一长约1.8kb强烈信号的存在，结果指出该病人的嗜伊红粒细胞有高水平的A31 RNA表达。
实施例9编码Eos L2受体cDNA的表达及其配体结构研究构建载体A31和A31-pcDNA3被用在表达和结合分析。为构建A31-pcDNA3，用EcoRⅠ和NotⅠ降解载体A31，用Gene Clean(Bio101)分离1.8kb的插入子，然后再插入载体pcDNA3的EcoRⅠ和NotⅠ位点，事先已经被EcoRⅠ和NotⅠ降解。连结的结构体称为A31-pcDNA3，再导入适宜的XL1-Blue细胞。瞬间转染用肾细胞293中的A31进行瞬间转染最初说明A31和放射活性RANTES之间有高亲合力。这些最初结构研究很难重复。因此随后产生了稳定的细胞株，A31/pcDNA3稳定整合到RBL(鼠嗜碱性白血病细胞)和293细胞。RBL细胞(保藏号，ATCCCRL1378)来自于美国培养物保藏中心[American Type CultureCollection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD20852]，而293细胞(保藏号ATCC CRL1573)是I.Charo,GladstoneCardiovascular Institute馈赠的。稳定的细胞株如下述构建稳定的细胞株。通过NotⅠ降解线性化A31-pcDNA3，用电渗透将之导入RBL和293细胞，再放到胰蛋白酶处理过的100×20mm平板上培养，重溶于1cc磷酸缓冲液(PBS)，在0.4cm管中960微法250伏特电渗透。在含有基因霉素的培养基中阳性筛选，分离出稳定的转染子。细胞先在DMEM中培养，10％小牛血清，几天后转入DMEM,10％小牛血清和0.9mg/cc的基因霉素，3周后，用克隆柱筛选存活集落，一个克隆一个孔在DMEM上培养，10％小牛血清和0.9mg/cc基因霉素。
通过Northern分析检测高水平表达A31 RNA的存活克隆，筛查了120个RBL稳定转染子和38个293细胞稳定转染子。用酸酚法[Chomczynski,P.and N.Sacchi,Anal.Biochem.,162:156-159(1987)]分离个别克隆的RNA,RNA用电渗透进行分级，在Gene Screen上印迹，按实验手册上关于高严紧洗涤提供印迹探针。分离质粒A31的EcoRⅠ-NotⅠ插入子，利用随机引物标记试剂盒标记上32P放射性标记，并作为探针。凝胶溴乙锭染色定量RNA，未转染293或RBL细胞作为相应的转染物的阴性对照。
标为A31-293-#8,A31-293-#9,A31-293-#7和A31-293-#20的稳定细胞株，相继被发现能够表达高水平的A31 RNA。Northern分析所发现高度表达A31的克隆A31-293-#20被选为进一步研究对象。
一种RBL细胞株被发现表达低-中量的RNA，但是在所用条件下不结合RANTES。配体结合稳定的克隆A31-293-#20足量生长来用于结合分析。细胞生长在100mm平板DMEM中，10％小牛血清，0.9mg/cc基因霉素，平板生长丰富，制备膜按下述进行。移去培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，通过TEN(40mM TRIS,pH7.5,1mMEDTA，和150mM NaCl)洗涤收获细胞。在液氮中冷冻细胞，室温下解冻，在锥形管18,000rpm离心10分钟收集膜片段。由生产至富足的单一100mm盘收获的膜的一半来确定每个结合点。
125Ⅰ-标记的RANTES购自于New England Nuclear，冷RANTES购自于Peprotech(Princeton,N.J.)。125Ⅰ-标记的MCP-3是New England Nuclear馈赠的，冷MCP-3馈赠自J.Van Damme,Rega Institute for Medical Research,University of Leuven,B-3000Leuven,Belgium[还可参见，Opdenakker,G.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,191(2):535-542(1993)]。结合实验是根据Van Riper的方法加以改良，0.125nM的125Ⅰ-RANTES与膜的结合，有不同浓度的未标记配体的存在。结合缓冲液是50mMHepes,1mM CaCl2,5mM MgCl2,0.5％BSA,pH7.2。放射性标记和冷配体同时加到膜上，室温下保存1.5小时。结合反应被加到2cc洗涤缓冲液中(0.5M NaCl,50mM Hepes,1mM CaCl2,5mM MgCl2,0.5％BSA,pH7.2)，搅拌混合，再置于被聚乙烯亚胺处理的Whatman GFC滤膜上。用2cc洗涤缓冲液洗涤滤膜，通过液闪计数确定保留在膜上的活性。滤膜置于5cc闪烁液体中，然而在一台miniaxi-beta液闪计数仪上计数(UnitedTechnologies,Packard,Downers Grove,IL)。每个点测三次，除2nM的点只测两次。
结果显示RANTE和A31克隆编码的受体之间有高亲合力结合(图15)，数据的Scatchard分析显示RANTES的Kd值为约2.5nM，与普通细胞一样。
利用上述的用于RANTES结合A31-293-#20膜的配体结合检测来评价MCP-3与A31-293-#20膜的结合(图16)，结合实验包含0.125nM的125Ⅰ-标记的MCP-3。
另外，通过确定标记MCP-3的程度来评价结合特异性(在没有冷MCP-3存在下可以结合)，能够被冷MCP-3代替(图17)，所有点都重复两次。
MCP-3与未转染细胞的膜的结合不能够被125Ⅰ标记MCP-3代替，说明非特异性结合。相比之下，MCP-3与A31-293-#20细胞膜的结合能够被热MCP-3代替，说明特异结合。
这些实验结果说明A31 cDNA编码的受体特异结合人MCP-3
实施例10人嗜伊红粒细胞通过一个主要受体对大量cc趋化因子作出应答细胞，细胞株和组织培养。用CD16微珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)从肝素处理过的血中分离嗜伊红粒细胞，具体见Ponath,P.D.et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)，并且细胞学显示纯度≥99％。根据Ponath的方法[Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)]分离中性细胞和PBMC。为生成CD3胚经胞，2×106PBMC/ml于RPMI-1640加上10％FCS被加到组织培养板中，事先外被抗-CD3抗体TR66。4-6天后将胚细胞转入新鲜培养基，补充IL-2到50units/ml(由Antonio Lanzavecchia,Basel提供)。所用其他细胞株包括L1.2鼠前B细胞的转染子，能高水平表达CCR3[见下面；Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]、IL-8RA[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]、IL-8RB[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]、CCR2b,CCR4,CCR5,CCR1[Campbell,J.J.,et al.,J.Cell Biol.,134:255-266(1996)]中任何一个。在补充有10％牛血清和800μg/ml G418的RPMI-1640中培养转染子。用特异于CCR3[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]、,IL-8RA,IL-8RB或CCR2的mAb[Qin,S.,et al.,Eur.J.Immunol.26:640-647(1996)；Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)]，检测不同转染中相关受体的表达。对于CCR4和CCR5，用抗-flag mAb M2检测表达，因为这些受体在N端有此表位。
人嗜伊红粒细胞培养于RPMI1640，带有10％FCS和5ng/ml重组人IL-5,5-7天。用带有亚丰富单层ECV304细胞的组织培养瓶进行培养。
对IL-8RA、IL-8RB、和CCR2(MCR-IR)的Mab都已经被描述[Qin,S.,et al.,Eur.J.Immunol.26:640-647(1996)]。用标准方法对细胞进行mAb染色，具体如前所述[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]。为计数每个细胞的抗体结合位，用Simply细胞微珠(Flow Cytometry Standards Corp.,SanJuan,PR)确定7B11-FITC的F/P比率，用Quantum26微珠校正FACScan。100μl供体全血和超饱和量(400ng)带有0.5％叠氮化物PBS中的7B11-FITC反应。用氯化铵裂解红细胞，通过细胞流计确定7B11染色细胞的平均区带荧光强度。表达载体构建和CCR3稳定转染子的产生1.8kb CKR-3(CCR3)基因组片段连接于pBluescriptⅡKS+载体的HindⅢ位点(见实施例2)，为便于表达对其改良，加入一个HindⅢ限制性位点，在紧靠起始密码子5＇端处添加Kozak序列，具体的四步过程如实施例3所述[Construction of FLAG-tagged Eos L2(CKR-3)Receptor Construct]。
鼠前-β淋巴细胞L1.2培养于补有10％牛血清的RPMI-1640。通过ScaⅠ酶切线性化20μg FLAG-标记的CKR-3/pc DNA3结构体(见实施例3)，用于转染L1.2细胞。L1.2细胞用HBSS洗涤两次，再溶于0.8ml的同样的HBSS中，质粒DNA与细胞混合，室温下温育10分钟，转入0.4cm电渗透管，250V,960μF的单一脉冲，然后室温保持10分钟。转染后48小时加入G418成终浓度0.8mg/ml。将细胞放入96孔板，25,000细胞/孔。药物筛选2-3周后，以5H12抗受体单克隆抗体染色G418抗性细胞，用FACScan(Becton Dickinson&Co.,Mountain View,CA)分析。为mAb染色，细胞用PBS洗涤一次，重溶于100ul的PBS中，其中含有2％FCS、0.1％叠氮化钠、(FACS缓冲液)、5μg/ml亲合纯化抗体或5μg/ml MOPC-21IgG同型匹配对照mAb(SigmaChemical Co.,St.Louis,MO)，或100μl杂交培养上清液。4℃下30分钟，细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重溶于100μl的FITC-连结的亲合纯化F(ab＇)2山羊抗-鼠IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories)。4℃下温育30分钟后，用FACS缓冲液洗涤两次，用FACScan分析。用Propidium iodide排除死亡细胞。在分析或免疫前24小时，用5nM丁酸(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,Catalog No.B 5887)处理转染子(FACS染色或结合)。所有的稳定转染子，包括如图18A和18C描述的L1.2转染子都用丁酸处理。带有可检测表面染色的细胞株进行扩展，并通过限制稀释度克隆几倍。作为一个阴性对照，用相关的对照IgG1mAb(MOPC-21)和相同的第二抗体染色CKR-3转染细胞。另外，同时进行用IL-8RB转染对照L1.2细胞，用5H12和第二抗体染色。荧光密度检测到有最亮表面染色的CKR-3转染克隆，被用作免疫原。总的来说，5H12染色细胞制备物有高于对照2-3logs的平均区带荧光密度。免疫实验所用产生单克隆抗体7B11的转染子，显示出高于MOPC-21和IL-8RB对照2logs的荧光密度。
用Northern杂交进一步分析最亮表面染色的克隆，以确定转染受体的表达，也可以用RT-PCR，互补于pcDNA3载体的T7引物作为5＇引物，CKR-3特异引物作为3＇引物。不加逆转录酶，没有扩增现象。单克隆抗体制备和细胞流计L1.2 CCR3转染细胞按照上述制备，用PBS洗涤三次，重溶于200μl的PBS/107细胞。用107L1.2 CCR3转染细胞免疫C57BL6老鼠，在两周的时间里腹膜内5-6次，最后的免疫是静脉内注射，产生可与CCR3反应的单克隆抗体。四天后，取脾脏，细胞与SPI/O细胞进行融合[见Coligan,J.E.et al.,1992,In:CurrentProtocols In Immunology(John Wiley&Sons,New York),Unit2.5.4]。
用未转染和CCR3转染的L1.2细胞，鉴定CCR3反应活性的单克隆抗体，用FACScan进行免疫荧光染色分析(BectonDickinison&Co.,Mountain View,CA)。杂交培养上清液被用于抗鼠Ig-FITC96孔模式的非直接免疫荧光检测。用PBS洗涤未转染的和CCR3转染的L1.2细胞，重溶于50μl的FACS缓冲液，其含有2％的FCS、0.1％叠氮化钠。加入50μl杂交培养上清液，4℃下培养30分钟，FACS缓冲液洗涤两次，重溶于100μl的FITC-连结的亲合纯化F(ab＇)2山羊抗-鼠IgG。4℃下培养30分钟，用FACS缓冲液洗涤两次，用FACScan分析。筛选染色CCR-3转染子而不染未转染L1.2细胞的抗体。从两个不同的融合，获得两个CCR3反应活性的单克隆抗体。其中之一由7B11杂合子产生，称为7B11。趋化因子，趋化性检测和配体结合分析重组人趋化因子来自Peprotech(Rocky Hill,NJ)，趋红素(Ponath,P.D.,et al.,J.clin.Invest.,97:604-612(1996))由Dr.IanClark-Lewis惠赠。用改良的透内皮实验评价人嗜伊红粒细胞的趋化性[Carr,M.W.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3652-36561(1994)]，利用了ECV304细胞株[Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)]。将迁入下室的细胞置于一个试管中，用FACScan细胞计数。
125Ⅰ-标记趋红素来自Amersham(Arlington Heights,IL)，特异活性是2000 Ci/mM。趋化因子与靶细胞结合，具体见以前的描述[Ponath,P.D.et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)；VanRiper,G.,et al.,J.Exp.Med.,177:851-856(1993)]。所有实验都进行双份，标准偏差通常小于平均值的10％。所有实验至少重复三次。用KaleidaGraph软件计算50％特异结合(IC50)的抑制浓度和曲线(Synergy Software,Reading,PA)。胞内钙离子浓度([CA2+])的测定50μg Fura-2AM(Molecular Probes,Eugene OR)溶解于44μl的DMSO中，用加载缓冲液稀释到4.4ml(Hanks Balanced SaltSolution,Gibco/BRL,catalogue#14025-092 containing 2％BSA)。嗜伊红粒细胞重溶于缓冲液成107cells/ml,1.5ml细胞和300μlFura-2溶液在37℃混合30分钟。接下来标记，多余的染色剂离心除去，细胞重溶于125mM NaCl,5mM KCl,1mM CaCl2,0.5mM葡萄糖，0.025％BSA和20mM HEPES,pH7.4，终浓度106/ml。在Hitachi F-2000荧光光谱仪上用340nm和380nm激发来测定[Ca2+]I。用全部释放的1％NP-40校正，25μM EGTA用来鳌合游离Ca2+。结果用mAb,7B11完全抑制趋红素，RANTES和MCP-3对CCR3转染子的结合。用抗CCR3多肽mAb 5H12筛选高水平表达CCR3的L1.2转染子[实施例5，在本文中也称为LS26-5H12；Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)]。MAb 7B11能够与CCR3转染的L1.2细胞反应，但不与CCR1,CCR26,CCR4,CCR5,CXCR1，或CXCR2转染的L1.2细胞反应(图18A)。MAb 7B11显著染色人嗜伊红粒细胞(图18B)。该mAb与淋巴细胞、CD3激活T细胞、单核细胞无反应活性。对中性细胞的染色为阴性，尽管小比例细胞能够表达非常少的受体。可显著被7B11染色的粒细胞小亚族(图18A)是属于粒细胞的嗜伊红粒细胞。
评价mAb 7B11对125Ⅰ-标记的-趋红素，125Ⅰ-RANTES,125Ⅰ-MCP-2,125Ⅰ-MCP-3，结合CCR3转染子的抑制能力。MAb 7B11完全抑制125Ⅰ-标记的趋红素结合转染子(图18C)，这种抑制作用和100nM冷趋红素的一样有效，这说明mAb 7B11能够完全抑制趋红素结合CCR3。该mAb也完全抑制125Ⅰ-标记的RANTES,125Ⅰ-标记的MCP-3和125Ⅰ-标记MCP-2结合CCR3转染子(图18C)，说明7B11识别的表位参与了多种CC趋化因子的结合。相反，mAb 7B11不能抑制RANTES结合CCR1转染子(图18C)。
MAb 7B11阻止放射标记趋红素、RANTES、MCP-3结合嗜伊红粒细胞。为检测趋红素、RANTES、MCP-3是否通过CCR3结合嗜伊红粒细胞，在不同浓度抑制mAb 7B11或者一个对照mAb的存在下，进行放射标记趋化因子和嗜伊红粒细胞的结合(图19)。用适量7B11 mAb可以完全抑制125Ⅰ-标记趋红素和嗜伊红粒细胞的结合，这些实验结果相吻合说明趋红素仅结合嗜伊红粒细胞上的CCR3[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]。除CCR3外，RANTES和MCP-3还结合趋化因子受体[Neote,K.,et al.,Cell72:415-425(1993)；Gao,J.L.,et al.,J.Exp.Med.,177:1421-1427(1993)；Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]。图19显示mAb 7B11也抑制125Ⅰ-标记的RANTES和125Ⅰ-标记的MCP-3结合嗜伊红粒细胞，50ng/mlmAb 7B11足够完全抑制所有趋化因子结合普通嗜伊红粒细胞，相当于2500倍量冷趋化因子的抑制效果。更少量的mAb 7B11就能够抑制RANTES、MCP-3的结合，这与他们与CCR3有更低亲合力相吻合[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]。
用抗CCR3 mAb抑制嗜伊红粒细胞向CC趋化因子的趋化作用。用嗜伊红粒细胞水平中等高的正常个体的嗜伊红粒细胞进行趋化性实验，图20A显示mAb 7B11能够以一种剂量依赖方式完全抑制嗜伊红粒细胞向趋红素趋化，下孔的趋化因子为100ng/ml(12.5nM),5-10μg/ml的7B11就可以达到100％的抑制。图20B显示用5-10μg/ml的mAb 7B11就可以完全抑制嗜伊红粒细胞对RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4的趋化应答。7B11不能抑制嗜伊红粒细胞趋向C5a(图20B)。mAb 7B11还不能抑制PBMC趋向RANTES，该过程通过趋化因子受体而不是CCR3。已经发现嗜伊红粒细胞对趋化因子趋化应答的供体到供体变体方式[Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)]。然而在这些全部供试个体里，mAb 7B11能够抑制嗜伊红粒细胞向趋红素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4迁移作用的95％以上。
MAb 7B11抑制嗜伊红粒细胞应答CC趋化因子的[Ca2+]I的改变。通过人嗜伊红粒细胞趋红素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4能够诱导[Ca2+]i的改变[Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)；Uguccioni,M.,et al.,J.Exp.Med.,183:2379-2384(1996)]。为检查mAb 7B11的支持剂/拮抗剂功能，在注射mAb 7B11或相关对照mAb后检测嗜伊红粒细胞的[Ca2+]I。在注射适量趋红素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4(图21)后嗜伊红粒细胞和相关mAb温育也产生[Ca2+]的一种激动剂，被用作对照。
与6.4μg/ml 7B11 mAb温育40秒的嗜伊红粒细胞，不对趋红素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4作出应答。这种抑制作用不是细胞表面受体调节的后果，因为这种作用是迅速的，对在室温下和mAb 7B11温育的嗜伊红粒细胞的免疫荧光染色表现为一种剧烈染色。另外mAb 7B11是拮抗剂而不是支持剂，因为10μg/ml的mAb不诱导[Ca2+]I的改变，7B11处理过的嗜伊红粒细胞对c5a表现出[Ca2+]i的改变(图21)。MAb 7B11对于丁酸分化HL-60细胞应答MIP-1α或RANTES的[Ca2+]i没有效果，这种应答由某种CCR3以外的受体介导。
IL-5前导的嗜伊红粒细胞通过CCR3应答CC趋化因子但调高IL-8受体。嗜伊红粒细胞性个体的嗜酸绘图仪出体培养IL-5前导的正常嗜伊红粒细胞都在趋化试验中应答IL-8[Schweizer,R.C.,et al.,Blood,83:3697-3704(1994)；Sehmi,R.,et al.,Clin.Exp.Allergy,23:1027-1034(1994)]。说明活化的嗜伊红粒细胞有改变了的趋化因子受体表达。为测试有前导的或活化的嗜伊红粒细胞是否像正常嗜伊红粒细胞那样对CC趋化因子作出应答，类似于图20和21所示进行抑制实验，采用5-7天IL-5激活嗜伊红粒细胞，和嗜伊红粒细胞性个体的嗜伊红粒细胞。对所有正常供试个体(n=12)的嗜伊红粒细胞，用mAb染色检测不到IL-8受体，CXCR1和CXCR2。然而和人IL-5，离体培养5-7天后，CXCR2和(更低程度的)CXCR1，能够在嗜伊红粒细胞表面被检测到，用抗-CXCR2 mAb和细胞流计，表达平行于这些嗜伊红粒细胞迁向IL-8的能力。在一个供体嗜伊红粒细胞里(18-25％WBC是嗜伊红粒细胞，＞1年)CXCR2以较低水平表达于嗜伊红粒细胞(图22C)。
MAb 7B11仍然能够以类似于抑制正常嗜伊红粒细胞的方式，完全抑制IL-5前导嗜伊红粒细胞和嗜伊红粒细胞性供体的嗜伊红粒细胞对MCP-2、MCP-3、MCP-4之外的趋红素和RANTES所作出的钙离子应答。实验里缺乏MIP-1α应答的证据，在IL-5前导嗜伊红粒细胞，大量健康个体的嗜伊红粒细胞上检测CCR3表达。经计算每个健康个体嗜伊红粒细胞的7B11结合位点数目为17,400±1600(n=12),IL-5激活后无显著差异，然而在一个供试个体，7B11结合位点数目高达26,000。讨论嗜伊红粒细胞特有趋化因子的功能效果，包括能够被抗-CCR3 mAb以强烈的拮抗剂活性完全抑制趋红素、RANTES、MCP-2、MCP-3、MCP-4。MAb特异于CCR3，对其他趋化吸引受体无抑制作用，这些结果进一步确立CCR3是嗜伊红粒细胞应答CC趋化因子的主要受体，并质疑CCR1、CCR2、CCR4、CCR5的关键作用。
嗜伊红粒细胞的主要CC趋化因子受体是CCR3。通过配体结合研究和mAb染色显示受体以高水平表达。最近的研究说明人嗜伊红粒细胞以约CCR3 1-5％的水平表达MIP-1α受体，CCR1、CCR4或CCR5[Daugherty,B.L.,et al.,J.Exp.Med.,183:2349-2354(1996)]，在一些个体发现对MIP-1α的中度趋化应答[见上面；Ponath,P.D.,et al.,J.Exp.Med.,183:2437-2448(1996)；Ponath,P.D.,et al.,J.Clin.Invest.,97:604-612(1996)]。然而使用mAb 7B11的实验结果说明MIP-1α对于嗜伊红粒细胞功能性应答RANTES或MCP-3过程贡献很小。在嗜伊红粒细胞对CC趋化因子的应答中见到了供体变化的作用。然而，用mAb7B11完全封闭所有个体的这些反应就表明，如果有其它的趋化因子受体存在的话，它们也仅仅起很微小的作用。此外，IL-5-刺激的嗜伊红粒细胞对CC趋化因子的应答也可以被mAb 7B11封闭就说明，在细胞因子主宰的嗜伊红粒细胞中没有新的受体被上调[Loetscher,P.,et al.,J.Exp.Med.,184:569-577(1996)]。IL-8受体在IL-5主宰的或活化的嗜伊红粒细胞上的相关性还不明确。本文中所描述的表型或功能分析与以前报道的IL-5刺激的嗜伊红粒细胞、或从嗜伊红粒细胞性供体来的嗜伊红粒细胞、在趋化反应中对IL-8的应答都是相吻合的[Schweizer,R.C.,et al.,Blood,83:3697-3704(1994)；Sehmi,R.,et al.,Clin.Exp.Allergy,23:1027-1034(1994)]。
因此，如本文所述，对CC趋化因子受体全面拮抗的mAb已经被鉴定出来了。CCR3拮抗剂可以应用于治疗疾病，例如，哮喘等，即抑制嗜伊红粒细胞迁移到呼吸道能够带来有意效果的疾病都可被治疗。因为在哮喘这类疾病中经常发生选择性的嗜伊红粒细胞的聚集，所以，就建议了在嗜伊红粒细胞迁移到哮喘患者的呼吸道的过程中的趋红素-CCR3所扮演的角色。然而，趋红素和其它的趋化因子在哮喘患者的呼吸道中都是被升高很多的[J.Rottmann and D.Ringler]，而且在过敏性呼吸道疾病的动物模型中也是如此[Jose,P.J.,et al.,J.Exp.Med.,179:881-887(1994)；Gonzalo,J.-A.,et al.,Immunity,4:1-14(1996)]。
实施例11用抗-CCR3单克隆抗体7B11封闭由趋红素、RANTES和MCP-3诱导的嗜伊红粒细胞的去粒作用由趋红素、RANTES和MCP-3或C5a诱导的嗜伊红粒细胞的去粒作用，以趋红素、RANTES、MCP-3或C5a刺激后嗜伊红粒细胞释放到培养基中的嗜伊红粒细胞过氧化物酶(EPO)的数量来测定的。EPO是在嗜伊红粒细胞特异性颗粒中的一种嗜伊红粒细胞酶。
本研究显示抗-CCR3单克隆抗体7B11抑制由趋红素、RANTES和MCP-3诱导的嗜伊红粒细胞的去粒作用，而对C5a刺激的嗜伊红粒细胞的去粒作用无效。C5a结合不同的受体，因此用其作为阴性对照。材料和方法Hank＇s平衡的盐溶液(HBSS,Cat.No.14025-092)和Dulbecco＇s磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS,Cat.No.14190-144)来自Gibco BRL。细胞松弛素B(C-6762)、过氧化氢(H2O2,3％溶液，H-6520)、DMSO(D-5879)、Tris(羟基甲基)氨基甲烷(T-1503)和o-亚苯基胺(P2903)都来自于Sigma ChemicalCo.,(St.Louis,MO)。聚苯烯V或圆底盘来自Costar公司。纯化的人嗜伊红粒细胞按照前述制备。嗜伊红粒细胞的去颗粒检测和单克隆抗体7B11的封闭在PBS中制备浓度为1mg/ml和0.1mg/ml的7B11抗体溶液(100x检测终浓度)。趋化因子或C5a溶解于HBSS、25mMHepes、0.25％BSA缓冲液(检测缓冲液)，是检测终浓度的2倍浓度。
嗜伊红粒细胞重悬浮于检测缓冲液至2.5×106/ml(HBSS,25mM Hepes,0.25％BSA)。将1∶1000体积的5mg/ml细胞松弛素B溶于100％DMSO的溶液加入到嗜伊红粒细胞悬浮液中(5μg/ml终浓度)。将100μl的细胞悬浮液加入到96孔V底盘中(0.25×106细胞/孔)。2μl的PBS的或抗体的溶液(1mg/ml或0.1mg/ml分别对应于10μg/ml和1μg/ml的抗体终浓度)被加入到细胞中，将盘子放在37℃下10分钟。培养后，细胞中加入100μl趋化因子溶液，或仅加入缓冲液，培养30分钟。培养后，以160g在10℃下离心5分钟。离心后，收集上清，按照下述检测是否存在嗜伊红粒细胞过氧化物酶。检测一般都进行双份。嗜伊红粒细胞过氧化物酶检测对EPO浓度的分析按照White,S.R.等人在J.Immunol.Meth.,44:257-263(1991)中所述方案进行，稍有修改。该检测的基础是，在有过氧化氢存在时，EPO氧化o-亚苯基亚胺。检测的终浓度对底物和过氧化氢分别为16mM和0.01％。使用前才临时制备底物母液(27mM底物，0.016％过氧化氢)，在0.1M TrispH8.0,0.1％Triton X-100中制备。简言之，75μl的底物溶液于50μl样品合并于平底96孔培养盘中，然后立即在492nm读数，每15秒一次，共5分钟。分光光度计读数在微滴盘吸收分光光度计上进行(Dynatech MR4000,Dynatech Laboratories,Inc.,Chantilly,Virginia)。收集数据并用检测管理软件Biolinx TM的2.1版分析。反应速度从接连的3-4点内推计算。用过氧化物酶(HRP)作为对照。将动力学数据外推得到标准曲线，由2、5、10和20ng的HRP对以每百万个细胞为单位的EPO活性制作，每单位活性相对于1ng的HRP的活性。因此，每单位EPO定义为给予相等于1ng的HRP产生的活性蛋白质的数量。结果在两个分开的实验中，mAb 7B11封闭趋红素-诱导的从嗜伊红粒细胞中释放过氧化物酶。图23A显示浓度为10μg/ml的7B11明显地一直由10nM或100nM的RANTES或MCP-3诱导的去颗粒化。由100nM的趋红素、RANTES或MCP-3诱导的去颗粒化分别被抑制了99％、77％和72％。由10nM的趋红素诱导的去颗粒化被1μg/ml和10μg/ml的7B11分别抑制了65％和85％。重要的是，如图23B所示，mAb 7B11没有抑制由C5a诱导的去颗粒化。
以前的研究显示，由趋红素刺激的EPO释放平行于其它的嗜伊红粒细胞性颗粒酶和蛋白质的释放，例如，嗜伊红粒细胞阳离子蛋白质(ECP)(图24A)，葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶B(图25-27)。EPO、ECP和葡糖苷酸酶存在于嗜伊红粒细胞特异性颗粒中，而芳基硫酸酯酶存在于小颗粒中。因此，趋红素诱导特异性颗粒和小颗粒的去颗粒化。图25-27显示，对EPO释放的趋红素剂量反应曲线平行于其它的嗜伊红粒细胞性蛋白质释放的剂量反应曲线。这些检测都基本按照前面在嗜伊红粒细胞去颗粒化检测的材料和方法中所描述的进行。然后，用已经建立的程序对上清检测是否存在嗜伊红粒细胞颗粒蛋白。对ECP，使用了市售的放射免疫检测试剂盒(Pharmacia Diagnostics,Cat.No.10-9165-01)。对葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶B的酶检测按照Kroegel,C.，等人在J.of Immunol.,142:3518-3526(1989)中所述进行。
在嗜伊红粒细胞的去颗粒化研究中选择EPO酶的原因是对检测和定量方便。趋红素释放的EPO总体上反应嗜伊红粒细胞的去颗粒化。因为EPO释放平行于其它的嗜伊红粒细胞的蛋白质和酶的释放，相似地，由封闭EPO释放所测定的7B11对由趋红素诱导的去颗粒化的封闭，将也反应对其它的嗜伊红粒细胞蛋白质和酶释放的封闭。
实施例12嗜碱细胞表达CCR3材料和方法细胞流计。用细胞流计检测全血中细胞表达的CCR3。100μl肝素化全血用400ng的7B11(抗-CCR3)-FITC制剂和500ng生物素偶联的抗-人IgE(PharMingen,San Diego,CA)在有100μl的PBS和0.1％叠氮物存在下于室温下20-30分钟染色。细胞在有叠氮物的PBS中洗一次，用5μl的链酶抗生物素蛋白量红染色(Sigma Immuno Chemicals,St.Louis,MO)，室温下15-30分钟。用2ml的氯化铵裂解缓冲液裂解细胞，收集白细胞并重悬浮于PBS中，用于在FACScan细胞流计分析(Becton Dickinson,Mountain View,CA)。将细胞分类后，对染色细胞用眼观察分析，染色如上所述，使用FACSvantage细胞流计(Becton Dickinson)，和制备Diff Quik(Baxter Scientific Products,McGaw Park,Ⅱ)染色的收集的细胞的玻片。
计数位点/细胞。细胞按前述进行用于细胞流计的染色。对样品进行分析后，将含有Quantum26微珠(Flow CytometryStandards Corp.,San Juan,PR)的试管用于荧光校正。对7B11/FITC制剂的MFSF/蛋白质比率用Simply Cellular微珠确定(Flow Cytometry Standards Corp.)。染色细胞的中间道的荧光被用来计算结合抗体/细胞的平均值。结果已经显示了识别CCR3的单克隆抗体7B11，仅仅识别全血制剂中的两个细胞成分(图28)。其中之一可以显示出具有在其表面的高水平的IgE，另一个则没有。分类的细胞缺乏IgE，但用7B11的染色则为97.3％±0.6嗜伊红粒细胞，从分类的细胞的染色玻片中鉴定。在其表面带有高水平IgE的细胞并用7B11染色后，显示为嗜碱性细胞(92％±4.6)，虽然IgE染色、细胞裂解和样品分类的方法都导致绝大多数细胞的去颗粒化。对给定个体，嗜伊红粒细胞一致地具有比嗜碱性细胞稍高数量的每个细胞的受体数量(p＜0.001，成对T检验)。从对30名个体的分析中，得到的7B11结合位点/嗜伊红粒细胞平均值为24,700±5700；而位点/嗜碱性细胞的平均值为19,000±4500。
对全血用7B11-FITC和抗-人IgE-生物素染色，随后是链酶生物素量红，用细胞流计分析。对全血的两种染色的分析表明，这两个种群带有CCR3(图28)，其中一个种群被用抗-人IgE双重染色。比较抗-人CCR3的染色强度表明，对CCR3表达，嗜伊红粒细胞一致地比嗜碱性细胞的染色强度高。这两个细胞种群的身份用常规组织学染色鉴定，IgE(+)CCR3(+)种群被发现为嗜碱性细胞(去颗粒化的)，而IgE(-)CCR3(+)种群被发现为嗜伊红粒细胞。对两个种群的前面和侧面的散射表明，这些细胞的散射性质与其细胞类型的其它的性质相一致。
实施例13嗜碱性细胞对趋红素和MCP-4的趋化性被抗-CCR3 mAb的封闭白细胞从未选择的健康志愿者获得，分离后用不连续密度离心分开个组分，具体见[Kurimoto,Y.,et al.,J.Exp.Med.,170:467(1989)；Bischoff,S.C.,et al.,Blood,79:2662(1990)]。简言之，对静脉血用10mM EDTA抗凝集，与0.25体积的葡聚糖混合(6％在NaCl 0.9％中)，室温下让红细胞沉降。90分钟后，收集白细胞，用HA缓冲液洗3次(20mM Hepes,125mM NaCl,5mM KCl,0.5mM葡萄糖，0.025牛血清白蛋白)。为了丰富嗜碱性细胞颗粒细胞，白细胞用Ficoll Hypaque密度离心分开各组分，严格按照Kurimoto,Y.,et al.,J.Exp.Med.,170:467(1989)进行。对白细胞的各组分用不连续Percoll梯度离心获取纯化的嗜碱性细胞[Bischoff,S.C.,et al.,Blood,79:2662(1990)]。收集被富集的嗜碱性细胞，在HA缓冲液中洗，重悬浮于150μl HA缓冲液，于顺磁微粒培养40分钟，微粒上包被有抗CD3(12μl)、CD4(15μl)、CD8(12μl)、CD14(5μl)、CD16(5μl)、和CD19(5μl)的mAb。磁性染色的细胞悬浮液过处于强磁场种的分离柱，去掉污染细胞(MACS system,Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,FRG)。联合使用Percoll梯度离心以及用免疫磁性微珠进行阴性筛选，得到的嗜碱性细胞的纯度为80-95％(污染物都是小淋巴细胞)，收复率为30-60％(由MayGruenwald/Giemsa染色的细胞离心玻片和对总组胺含量的测定来决定的)。细胞最终在HA缓冲液中洗3次，重悬浮于HACM缓冲液(HA缓冲液补充以1mM MgCl2和1mM CaCl2)。组胺和LTC4释放细胞(80-180×103/ml)在含有125mM葡萄糖和0.025％BSA的20mM Hepes,pH7.4中，加温到37℃，接触IL-3(10ng/ml)，带有或没有抗-CCR3(5μg/ml)，然后对其攻击。20分钟后，将试管放在冰上，测量上清中的组胺和LTC4[Dahinden,C.A.,et al.,J.Exp.Med.,179:751(1994)]。组胺的释放表达为样品总含量的百分数(细胞溶胞后确定)。LTC4的产生表达为LTC4/D4/E4每ng总组胺(其相应于1,000嗜碱性细胞)。
如图29所示，嗜碱性细胞应答趋化因子而释放组胺，而组胺的释放可以被mAb 7B11封闭。趋化反应将趋化因子加入到48孔趋化室的下面的各孔中(NeuroProbe,Cabin John,MD)。细胞悬浮于RPMI1640,20mM Hepes和1％PPL,pH7.4，带有或没有抗-CCR3(5μg/ml)，并放置在上面的孔中(每孔50,000个细胞)。在5％CO2和37℃下50分钟后，由对聚碳酸酯滤膜(不含有聚乙烯吡咯烷酮，5μm孔径，Nucleopore Corp.,Pleasanton,CA)的分析确定发生了迁移。在用May-Gruenwald/Giemsa染色后，显微镜下计数滤膜下表面的迁移的细胞数目。
如图30A和30B所示，嗜碱性细胞趋向于趋红素和MCP-4,这种应答被抗CCR3 mAb 7B11封闭。等同物本领域的技术人员将能够采用不超过常规的实验来认识或确定那些本发明描述的具体实施方案的众多等同物。这些等同物都室包括在本发明的权利要求书中的。
序列清单(1)总体信息(ⅰ)申请人(A)名称LeukoSite,Inc.
(B)街道215 First Street(C)城市Cambridge(D)州/省Massachusetts(E)国家USA(F)邮编/区号02142(G)电话(617)621-9350(I)传真(617)621-9349(ⅱ)发明名称G-蛋白质偶联的受体基因(ⅲ)序列数量18(ⅳ)通讯地址(A)收言人Hamilton,Brook,Smith&Reynolds,P.C.
(B)街道Two Militia Drive(C)城市Lexington(D)州Massachusetts(E)国家USA(F)邮编02173(ⅴ)计算机存储形式(A)存盘形式软盘(B)计算机IBM PC兼容
(C)工作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)本申请数据(A)A申请号PCT/US97/17103(B)申请日24-SEP-1997(C)分类(ⅶ)在先申请数据(A)申请号US08/720,565(B)申请日30-09-1996(ⅶ)在先申请数据(A)申请号US08/375,199(B)申请日19-JAN-1995(ⅷ)律师/代理人信息(A)名称Brook,David E.
(B)注册号22,592(C)案卷号LKS94-05A3 PCT(ⅸ)通讯信息(A)电话781-861-6240(B)传真781-861-9540(2)关于SEQ ID NO:1(ⅰ)序列特征(A)长度1689碱基对(B)类型核酸
(C)链型双链(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:AATCCTTTTC CTGGCACCTC TGATATCCTT TTGAAATTCA TGTTAAAGAA TCCCTAGGCT 60GCTATCACAT GTGGCATCTT TGTTGAGTAC ATGAATAAAT CAACTGGTGT GTTTTACGAA 120GGATGATTAT GCTTCATTGT GGGATTGTAT TTTTCTTCTT CTATCACAGG GAGAAGTGAA 180ATGACAACCT CACTAGATAC AGTTGAGACC TTTGGTACCA CATCCTACTA TGATGACGTG 240GGCCTGCTCT GTGAAAAAGC TGATACCAGA GCACTGATGG CCCAGTTTGT GCCCCCGCTG 300TACTCCCTGG TGTTCACTGT GGGCCTCTTG GGCAATGTGG TGGTGGTGAT GATCCTCATA 360AAATACAGGA GGCTCCGAAT TATGACCAAC ATCTACCTGC TCAACCTGGC CATTTCGGAC 420CTGCTCTTCC TCGTCACCCT TCCATTCTGG ATCCACTATG TCAGGGGGCA TAACTGGGTT 480TTTGGCCATG GCATGTGTAA GCTCCTCTCA GGGTTTTATC ACACAGGCTT GTACAGCGAG 540ATCTTTTTCA TAATCCTGCT GACAATCGAC AGGTACCTGG CCATTGTCCA TGCTGTGTTT 600GCCCTTCGAG CCCGGACTGT CACTTTTGGT GTCATCACCA GCATCGTCAC CTGGGGCCTG 660GCAGTGCTAG CAGCTCTTCC TGAATTTATC TTCTATGAGA CTGAAGAGTT GTTTGAAGAG 720ACTCTTTGCA GTGCTCTTTA CCCAGAGGAT ACAGTATATA GCTGGAGGCA TTTCCACACT 780CTGAGAATGA CCATCTTCTG TCTCGTTCTC CCTCTGCTCG TTATGGCCAT 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1689(3)关于SEQ ID NO:2(ⅰ)序列特征(A)长度355氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Thr Thr Ser Leu Asp Thr Val Glu Thr Phe Gly Thr Thr Ser Tyr1 5 10 15Tyr Asp Asp Val Gly Leu Leu Cys Glu Lys Ala Asp Thr Arg Ala Leu20 25 30Met Ala Gln Phe Val Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Thr Phe Gly35 40 45Leu Leu Gly Ash Val Val Val Val Met Ile Leu Ile Lys Tyr Arg Arg50 55 60Leu Arg Ile Met Thr Asn Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp65 70 75 80Leu Leu Phe Leu Val Thr Leu Pro Phe Trp Ile His Tyr Val Arg Gly85 90 95His Asn Trp Val Phe Gly His Gly Met Cys Lys Leu Leu Ser Gly Phe100 105 110Tyr His Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr115 120 125Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala130 135 140Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Val Thr Trp Gly Leu145 150 155 160Ala Val Leu Ala Ala Leu Pro Glu Phe Ile Phe Tyr Glu Thr Glu Glu165 170 175Leu Phe Glu Glu Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Pro Glu Asp Thr Val180 185 190Tyr Ser Trp Arg His Phe His Thr 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NO:7(ⅰ)序列特征(A)长度25碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ⅸ)特征(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置19(D)其它信息/修饰的碱基=i
(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置24(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:TACCTGCTSA ACCTGGCCNT GGCNG 25(2)关于SEQ ID NO:8(ⅰ)序列特征(A)长度25碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置9(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置14(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:ACCTGGCCNT GGCNGACCTM CTCTT 25(2)关于SEQ ID NO:9(ⅰ)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置18(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:GACCGYTACC TGGCCATNGT CCAYGCC 27(2)关于SEQ ID NO:10(ⅰ)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置10(D)其它信息/修饰的碱基=i
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:GGCRTGGACN ATGGCCAGGT ARCGGTC 27(2)关于SEQ ID NO:11(ⅰ)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置1(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置6(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置16(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置18(D)其它信息/修饰的碱基=i
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:NACCANRTTG TAGGGNRNCC ARMARAG 27(2)关于SEQ ID NO:12(ⅰ)序列特征(A)长度28碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置8(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置10(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置23(D)其它信息/修饰的碱基=i(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:TGTAGGGNRN CCARMARAGR AGNARGAA 28(2)关于SEQ ID NO:13(ⅰ)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置12(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置15(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置16(D)其它信息/修饰的碱基=i(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:GAAGGCGTAG ANSANNGGGT TGASGCA 27(2)关于SEQ ID NO:14(ⅰ)序列特征(A)长度25碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置4(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置7(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅸ)特点(A)名称/KEY修饰的碱基(B)位置8(D)其它信息/修饰的碱基=I(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:AGANSANNGG GTTGASGCAG CWGTG 25(2)关于SEQ ID NO:15(ⅰ)序列特征(A)长度48碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑线性(ⅸ)特点(A)名称/KEY:CDS(B)位置16..48(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:AAGCTTCCAG CAGCC ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAA GAA TTC48Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Phe360 365(2)关于SEQ ID NO:16(ⅰ)序列特征(A)长度11氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Phe1 5 10(2)关于SEQ ID NO:17(ⅰ)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:TTAAGAATTC ACAACCTCAC TAGATAC 27(2)关于SEQ ID NO:18(ⅰ)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:CATAGTGGAT CCAGAATG 18
权利要求
1．一种对哺乳动物趋化因子受体3蛋白质或其部分具有特异性结合的抗体，其中所述的抗体可以与单克隆抗体7B11竞争对人趋化因子受体3蛋白质或其部分的结合。
2．一种权利要求1所述的抗体的抗原结合片段。
3．根据权利要求1所述的抗体，其中所述的抗体是7B11抗体。
4．一种权利要求3所述的抗体的抗原结合片段。
5．一种产生权利要求1所述的抗体的杂交瘤。
6．根据权利要求5所述的杂交瘤，其中所述的杂交瘤是7B11杂交瘤。
7．一种用于治疗和诊断的抗体或其抗原结合片段，所述的抗体或抗原结合片段具有对哺乳动物趋化因子受体3蛋白质或其部分的特异结合性，其中所述的抗体可以与单克隆抗体7B11竞争与人趋化因子受体3蛋白质或其部分的结合。
8．一种用于治疗和诊断的抗体7B11或其抗原结合片段。
9．具有对哺乳动物趋化因子受体3蛋白质或其部分的特异结合性的抗体或其抗原结合片段在生产治疗发炎疾病或病状的药物中的应用，其中所述的抗体可以与单克隆抗体7B11竞争与人趋化因子受体3蛋白质或其部分的结合。
10．一种抗体7B11或其抗原结合片段在生产治疗发炎疾病或病状的药物中的应用。
11．一种对哺乳动物趋化因子受体3蛋白质的至少一种功能进行抑制的方法，该方法包括将所述的蛋白质接触对哺乳动物趋化因子受体3蛋白质或其部分具有特异结合性的抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或抗原结合片段可以与单克隆抗体7B11竞争与人趋化因子受体3蛋白质或其部分的结合。
12．根据权利要求11所述的方法，其中所述的抗体或其片段是7B11或其抗原结合片段。
13．具有对哺乳动物趋化因子受体3蛋白质或其部分的特异结合性的抗体或其抗原结合片段在抑制哺乳动物受体的至少一种功能中的应用，其中所述的抗体或其片段可以与单克隆抗体7B11竞争对人趋化因子受体3蛋白质或其部分的结合。
14．根据权利要求13所述的应用，其中所述的抗体或其片段是7B11或其抗原结合片段。
15．一种治疗发炎疾病和病状的方法，该方法包括给哺乳动物提供治疗有效剂量的对哺乳动物趋化因子受体3蛋白质或其部分具有特异结合性的抗体或其片段，其中所述的抗体或其片段可以与单克隆抗体7B11竞争同人趋化因子受体3蛋白质或其部分的结合。
16．根据权利要求15所述的方法，其中所述的抗体或其片段是7B11或其抗原结合片段。
17．根据权利要求15所述的方法，其中所述的发炎疾病或病状是例如过敏疾病、哮喘、自体免疫疾病、移植排斥或癌症。
18．一种对哺乳动物趋化因子受体3蛋白质或其部分具有特异结合性的抗体或其片段在治疗发炎疾病或病状中的应用，其中所述的抗体或其片段可以与单克隆抗体7B11竞争同人趋化因子受体3蛋白质或其部分的结合。
19．根据权利要求18所述的应用，其中所述的抗体或其片段是7B11或其抗原结合片段。
20．根据权利要求18所述的应用，其中所述的发炎疾病和病状是例如，过敏疾病、哮喘、自体免疫疾病、移植排斥或癌症。
21．一种检查和测量细胞表面的人趋化因子受体3蛋白质或其部分的方法，该方法包括将所述的细胞与对哺乳动物趋化因子受体3蛋白质或其部分具有特异结合性的抗体或其抗原结合片段相接触，其中所述的抗体或其片段可以与单克隆抗体7B11竞争同人趋化因子受体3蛋白质的结合。
22．根据权利要求21所述的方法，其中所述的细胞是白细胞。
23．根据权利要求21所述的方法，其中所述的抗体或其片段是7B11或其抗原结合片段。
24．具有对哺乳动物趋化因子受体3蛋白质或其部分的特异结合性的抗体或其抗原结合片段在检查和测量细胞表面的人趋化因子受体3蛋白质或其部分中的应用，其中所述的抗体或其片段可以与单克隆抗体7B11竞争对人趋化因子受体3蛋白质的结合。
25．根据权利要求24所述的应用，其中所述的细胞是白细胞。
26．根据权利要求24所述的应用，其中所述的抗体或其片段是7B11或其抗原结合片段。
27．具有对哺乳动物趋化因子受体3蛋白质的特异结合性的抗体或其抗原结合片段在白细胞发炎过程被改变了的疾病或病状的诊断中测量个体白细胞的受体表达水平方面的应用，其中所述的抗体或其片段可以与单克隆抗体7B11竞争对人趋化因子受体3蛋白质或其部分的结合。
28．根据权利要求27所述的应用，其中所述的抗体是7B11或其抗原结合片段。
全文摘要
本发明涉及被分离的和/或重组的核酸,它们编码哺乳动物(例如,人)的称为C－C趋化因子受体3(CKR－3)或Eos L2的受体蛋白,以及蛋白质和多肽,在本文中称为被分离的、重组的哺乳动物CKR－3受体。本发明进一步涉及重组的核酸构建物,其包括对本发明的受体蛋白或其局部编码的核酸;还涉及含有这样的构建物的用于产生重组的CKR－3受体或多肽的宿主细胞;以及涉及对受体有反应的抗体,它们可以用于研究和诊断方面。此外,本发明还提供了使用这些核酸、蛋白质、宿主细胞来鉴定受体功能的配体、抑制剂(如拮抗剂)、促进剂(激动剂)的方法。给需要治疗的个体提供以抑制或促进受体功能的化合物,就提供了选择性调节白细胞功能的方法,其可以用于各种炎症疾病和字体免疫疾病中,或用于对感染的治疗中。作为存在于白细胞如嗜伊红粒细胞和淋巴细胞中的主要白细胞趋化因子受体,这些受体提供了药物筛选和涉及的关键靶标。
文档编号G01N33/566GK1234806SQ97198390
公开日1999年11月10日 申请日期1997年9月24日 优先权日1996年9月30日
发明者查尔斯·R·麦奇, 保罗·D·波纳斯 申请人:罗克塞特有限公司