嗜碱和嗜热微生物及由其所获得的酶的制作方法

专利名称：：嗜碱和嗜热微生物及由其所获得的酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的嗜碱和嗜热微生物和由其所获得的新的酶。
背景技术：
：嗜碱微生物是分布于许多分类群中的复杂的微生物种群，它们在碱性pH环境，通常大于pH8中显示最佳生长(Jones，B.E.等(1994)嗜碱微生物多样性和鉴定，“微生物多样性和鉴定”(F.G.Priest等编)PlenumPress，NewYork和London，P.195-230)。专性嗜碱微生物通常具有pH9至pH10之间的生长最佳pH，并且在中性pH下不能生长。耐碱性(或兼性嗜碱)微生物不那么严格，虽然它们能在碱性pH值下生长，它们的最佳pH位于中性至酸性pH范围。嗜热微生物也是定义为具有超过50℃的最佳生长温度的非常复杂的微生物群。对于中等嗜热微生物，最大生长温度通常低于70℃。在高于40℃具有最小生长，高于65℃具有最佳生长，并且高于70℃具有最大生长的生物被定义为极端嗜热(Cowan，D.A.(1992)极端嗜热古细菌的生物化学和分子生物学，“极端嗜热细菌的分子生物学和生物技术”(R.A.Herbert和R.J.Sharp编)，Blackie和sonsLtd.，GlasgowandLondon，P1-43)。结合表型，嗜碱和嗜热看来具有仅仅很少的发生率。均从污水消化植物分离的仅仅两种这类微生物被得到了很好的描述，并且两种均被确定为属于革兰氏阳性菌的梭菌属。一种微生物，争论梭菌(Clostridiumparadoxum)在pH7.33与pH11.0之间专性嗜碱性生长，最佳pH位于pH10左右。然而，由于它具有55℃的最佳生长温度和63℃的最大生长温度，它仅能被划分为中等嗜热性(YouhongLi等(1992)Int.J.Syst.Bacteriol.43，450-460)。第二种微生物，嗜热碱梭菌(Clostridiumthermoalcaliphilum)是生长于pH7与pH11之间的兼性嗜碱或耐碱生物，最佳pH位于pH9.5和pH10之间。具有50℃的最佳生长温度和57℃的最大生长温度，该细菌仅可被划分为非常适中的嗜热或耐热菌(YouhongLi等(1994)Int.J.Syst.Bacteriol.44，111-118)。在已知的嗜热细菌类型中，一些种类属于栖热袍菌目(Thermotogales)。通过序列测定核糖体RNA基因为与所有其它细菌在系统发生上不同，并代表最深分枝的一员以及在主干(Domain)细菌中进化最缓慢的谱系已表明了主要极端嗜热细菌的独特的类型。栖热袍菌目的细菌为特征性的革兰氏阴性、棒状、厌氧、发酵细菌，具有类似于鞘的外膜(“toga”)；它们的生长被分子氢所抑制(Huber，R.和Stetter，K.O.(1992)栖热袍菌目，“原核生物”(A.Balows等编)，Springer-Verlag，NewYork，P.3809-3815)。目前，栖热袍菌目由五个属所代表。栖热袍菌属，栖热腔菌属和闪烁杆菌属包括已知的极端嗜热的种类，而相距较远的相关(根据16SrRNA分析)的属Geotoga和Petrotoga代表更中温的种类。在自然界已知种类中没有明显嗜碱性的。已从活跃地热水生环境，例如浅滩和深海热液体系或从低盐大陆性硫磺温泉中分离出大多数现存的极端嗜热栖热袍菌目的种类。近期已从深的表面下油田中分离出不甚嗜热的菌株，尤其是Geotoga属和Petrotoga属的那些(Huber，R.和Stetter，K.O.(1992)，出处同上；Davey，M.E.等(1993)系统应用微生物学16，191-200；Ravot，G.等(1995)Int.J.Syst.Bacteriol.45，308-314)。虽然栖热袍菌目的不同成员可能在表型特征，如温度，pH和允许生长的NaCl范围方面有部分不同(表1，Ravot，G.等(1995)Int.J.Syst.Bacteriol.45,308-314)，但它们的分类主要基于16SrRNA基因的核苷酸序列之间相似性的比较和DNA-DNA杂交研究。Stackebrandt和Goebel(Int.J.Syst.Bacteriol.44，846-849，1994)认为只要还满足其它标准，具有大于97％16SrRNA序列同一性的微生物菌株可被认为是相同种的成员。已表明海岛闪烁杆菌(Fervidobacteriumislandicum)与多节闪烁杆菌(Fervidobacteriumnodosum)的16SrRNA序列的相似性为95.3％，这是相同属中不同种的一个典型(Huber，R.等(1990)古微生物学154，105-111)，但在栖热袍菌属菌株与栖热腔菌属菌株之间有10-15％的不同。在栖热袍菌目中，高达约8％的序列不同通常已能将菌株归于相同属中。大于约10％的16SrRNA序列的不同和表型差异一起常常被用作令人信服的理由来将栖热袍菌目不同的分离菌株归入不同的属中(Huber，R.等(1989)，系统应用微生物学12，32-37；Davey，M.E.等(1993)系统应用微生物学16，191-200；Ravot，G.等(1995)Int.J.Syst.BacterioL.45，308-314)。表1区别栖热袍菌目成员的一些特征1.Huber，R.等(1986)古微生物学144，324-333。2.Jannasch，H.等(1988)古微生物学150，103-104。3.Windburger，E.等(1989)古微生物学151，506-512。4.Ravot，G.等(1995)Int.J.Syst.Bacteriol.45，308-314。5.Huser，B.A.等(1986)FEMSMicrobiol.Letts.37，121-127；Janssen，P.H.andMorgan，H.W.(1992)FEMSMicrobiol.Letts.96，213-218。6.Huber，R.等(1989)系统应用微生物学.12，32-37。7.Patel，B.K.等(1985)古微生物学141，63-69。8.Huber，R.等(1990)古微生物学154，105-111。9.WO93/18134。10.Davey，M.E.等(1993)系统应用微生物学16，191-200。11.本发明的微生物。发明概述本发明提供新属Thermopallium的新的嗜热嗜碱细菌，具体地是新的种Thermopalliumnatronophilum，以及可从这些细菌获得的新的多肽。在一个更具体的方面，本发明提供新的来自这些新细菌的碱性支链淀粉酶和淀粉酶制剂。在第三个方面，本发明提供包含根据本发明的一种新的多肽的组合物。在第四个方面，本发明提供编码根据本发明的多肽的分离DNA片段，包含该DNA片段的重组DNA，用该重组DNA转化的宿主细胞和该宿主细胞的培养物。在另一个方面，本发明提供一种制备根据本发明的多肽，优选酶的方法。附图简要说明图1显示说明新细菌Thermopalliumnatronophilum与其它细菌，包括栖热袍菌目的成员之间的关系的基于16SrDNA序列的系统树，图2显示在pH8.5下20分钟后测定的从ThermopalliumnatronophilumTg9A获得的未纯化的淀粉酶的温度与酶活性(相对％)之间的相互关系。图3显示在80℃下20分钟后测定的从ThermopalliumnatronophilumTg9A获得的未纯化的淀粉酶的pH与酶活性(相对％)之间的相互关系。图4显示在pH8.5下20分钟后测定的淀粉酶A-1的温度与酶活性(相对％)之间的相互关系。图5显示在80℃下20分钟后测定的淀粉酶A-1的pH与酶活性(相对％)之间的相互关系。图6显示在pH8.5下20分钟后测定的淀粉酶A-II的温度与酶活性(相对％)之间的相互关系。图7显示在80℃下20分钟后测定的淀粉酶II的pH与酶活性(相对％)之间的相互关系。本发明的详细公开微生物本发明的新的微生物从温泉和它们产生的汽流中分离，由于溶解的碳酸根离子(和有关阴离子)，温泉具有碱性pH，但如通过电导率所测定的，它们具有低浓度的浓解的盐(表2)。温泉位于东非大陆的裂谷(RiftValley)的火山活跃地区。它们具有大于1g/l的典型的碳酸根阴离子浓度，因而不是典型的通常的硫磺温泉类型。根据关于用于专利程序中的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约，命名为ThermopalliumnatronophilumTg9A的分离微生物的纯培养物已于1994年9月21日保藏在DSM-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，MascheroderWeg1b，D-38124Braunschweig，Germany，保藏号为DSM9460。表2包含Thermopallium属的碱性温泉的特性</tables>本发明的微生物是不形成内生孢子的严格厌氧，棒状细菌。细菌细胞被在细胞两极膨起的特征性的类似于鞘的外层结构或“toga”所包围。细胞通常单个产生或为多达3个细胞长的短链。在生长阶段，细胞形状可变为弯曲或不规则，并且有时形成聚集物。在稳定生长期，细胞变为球形，一个或多个细胞在一个大的球状体内。在含碳酸盐的碱性营养琼脂或Gelrite中，微生物形成圆形，有光泽的，稍白，半透明的菌落。根据这些特征，微生物Thermopalliumnatronophilum的菌株可因此被归入细菌“栖热袍菌”目(Huber，R.和Stetter，K.O.(1992)“栖热袍菌”目原核生物(A.Barlows等，编)Springer-Verlag，NewYork，PP.3809-3815)。本发明微生物的天然分离物可进一步通过下面特征来描述。生长温度它们生长于52℃-78℃之间，在50℃或79℃下不生长。在约70℃下观察到最大生长速率，然而在约63℃-约64℃下获得最大细胞产率。生长pHpH在7.2至＞10.5的范围时，支持生长。最佳pH约8.8-约9.5。NaCl的影响生长的最佳NaCl浓度为1％(w/v)，大于4-5％(w/v)不能生长。革兰氏反应阴性。KOH反应阴性。氨肽酶反应阴性。SDS的作用在存在1％(w/v)十二烷基硫酸钠时，在数秒钟内，在显微镜下细胞和类似鞘的结构均消失。溶菌酶的作用在显微镜下，当溶菌酶(10mg/ml)被加入到细胞悬液中时，观察到极小的作用。加入20mg/ml溶菌酶时，一些棒状细胞变为球状。生长于葡萄糖阳性半乳糖阳性麦芽糖阳性木糖弱核糖阴性甲酸盐阴性乙酸盐阳性乳酸盐阴性丙酸盐阴性丙酮酸盐弱谷氨酸盐阴性甘氨酸阳性甘油阳性乙醇阴性纤维素阳性酪蛋白阳性明胶阳性木聚糖阳性淀粉阳性橄榄油阳性胰化蛋白胨阳性硫和氢对生长的影响分子氢H2抑制生长。可通过向培养基中加入硫将这种抑制解除。G+C含量36.3±0.9Mol％(n＝2)(HPLC方法)。微生物的分类和鉴定本发明的菌株根据系谱关系，通过对PCR扩增的16SrRNA基因进行直接测序来进行分类。将序列与从GenBank和EMBL数据库得到的已知细菌的序列进行比较。将序列进行排序并使用计算机程序进行系谱分析(pHYLIPpackage的版本3.4和3.5c(Felsenstein，J.(1989)Cladistics5，164-166))。计算相似值(表3)并构建系统树(图1)。结果表明这些菌株具有98.7％的16SrRNA序列相似性，并由此可被认为是相同种的分离菌。这些结果进一步说明新微生物的菌株与闪烁杆菌属比与任何其它属的细菌更为密切相关。然而，新微生物的菌株具有一个通常称为“toga”的类似于鞘的外层结构，该结构沿棒状细胞的两极扩展。这种“toga”是栖热袍菌属，栖热腔菌属，Geotoga和Petrotoga属成员的一个共同特征(Balows等编，Springer-Verlag，NewYork，P.3809-3815；Ravot，G.等(1995)国际系统细胞学杂志45,308-314)。相反，闪烁杆菌属具有一个末端“球状体”(Huber，R.和Stetter，K.O.出处同上；Huber，R.等(1990)微生物学档案154，105-111；Patel，B.K.C.等(1985)微生物学档案141，63-69)。仅仅这一证据说明新微生物的菌株代表一个新的种。然而，由于代表主干细菌最深分枝之一的这些谱系(Winkler，S.和Woese，C.R.(1991)系统和应用微生物学13，161-165)相对于其它细菌谱系(Huber，R.等，系统和应用微生物学12，32-37)正缓慢地进化，所以与闪烁杆菌属具有差不多10％的序列同源性的差异是相当显著的。这说明该新细菌是一个独立并且至今未知的属。基于这些，该微生物被归于新的属，Thermopallium；该微生物的菌株被归于种，Thermopalliumnatronophilum。通过16SrRNA基因的核苷酸序列(所附序列表中的SEQIDNO.1)及通过本文描述的表型特征来定义Thermopallium属和Thermopalliumnatronophilum种。与已知种类相比的G+C值的不同(表4)进一步支持了微生物的这些新菌株为一个新的种的划分。本发明的微生物的表型特征清楚地将它们从栖热袍菌目的已知种分开(表1)。该新的微生物为明显的极端嗜热，并且具有从大陆性温泉(即非海洋来源)中分离的栖热袍菌目种类的典型的温度图谱。然而，栖热袍菌目的已知种均具有位于中性周围的生长最佳pH。相反，本发明的新的微生物清楚地为专性嗜碱性，并且不能在中性pH(表1)或在没有含碳酸根阴离子的培养基的情况下生长。表316SrDNA相似性值12345678910</tables>表4.G+C值(Mol％)1.Thermopalliumnatronophilum36.32.海岛闪烁杆菌403.Fervidobacteriumpennavorens40.04.多节闪烁杆菌33.75.非洲栖热腔菌306.海栖热袍菌467.温泉栖热袍菌408.Geotogapetraea29.59.Petrotogamiotherma39.8微生物的培养仅仅可以在严格缺氧的条件下，例如在Freter型厌氧室或Balch等(微生物学综述(1979)，43，260-296)描述的使用严格厌氧技术密封的瓶子中培养本发明的微生物。需要适宜的营养培养基，通常，该培养基包括可同化的碳和氮源及其它必需营养物。优选地，培养基的总的溶解盐的浓度不超过约15mS/cm的电导值，并且在上面说明的严格厌氧条件下来制备。优选地，加入还原剂以产生足够低的起始氧化还原值。可通过本领域已知的方法制备适宜的培养基。由于本发明的Thermopalliumnatronophilum新种的新微生物的天然分离菌为嗜碱性的并且不能在低于pH7.2时生长，优选在碱性pH值下进行培养，该碱性pH值可在灭菌生长培养基后，优选在液上气相为无O2的N2条件下通过加入适宜的缓冲液，例如碳酸钠，或较优选为碳酸钠和碳酸氢钠的混合物而获得。该培养基为TMZ-培养基，该培养基是使用Castenholtz盐对栖热菌属(Thermus)培养基的改进(Williams，R.A.D.和DaCosta，M.S.(1992)栖热菌属和相关微生物，原核生物(A.Barlows等编)，Springer-Verlag，NewYork，P.3745)以适宜于以纯培养物从其中将微生物分离的温泉水中的最初条件。只要用碳酸盐调节pH，在其它缓冲液混合物，如Tris/HCl或Borax/NaOH中生长是可能的。在用NaOH调至碱性pH值的培养基中获得很少的生长或没有生长。对于大规模培养，通常必需使用无O2的氮气连续喷射培养基。生长的最低温度为约40℃。在一个优选的实施方案中，Thermopalliumnatronophilum新种的分离菌在65℃下生长。发酵后，可通过使用本领域已知的方法，从培养肉汤中分离细胞并浓缩肉汤来获得液体酶浓缩物。另外，可使用适当方法将细胞悬浮于适宜的液体中并将其破碎，分解或溶解，或用其它方法处理而在可溶的级分中释放酶。可纯化溶解的酶，任选在浓缩和/或以固体形式沉淀后，方法是使用盐或水可溶混溶剂或除去水。纯化的酶可最终以晶体形式获得。得自微生物的酶本发明的酶可在通过加入碳酸盐，或碳酸盐和碳酸氢盐的混合物而维持在碱性pH，如pH7.5-12.0，或较优选pH8.5-9的含有碳和氮源及无机盐的适宜营养培养基中培养本发明的微生物，优选ThermopalliumnatronophilumTg9A，DSM9460，或其变体或突变体来获得。Thermopalliumnatronophilum的突变体或变体菌株可通过遗传操作技术或其它技术自发或化学法获得，包括通过核酸转移，环境选择压力，UV照射和通过使用本领域技术人员已知的诱变化学物质而获得的突变体。还可通过在适宜宿主生物中克隆适合的基因的重组DNA技术来获得该酶。这可通过任何适宜方法，如通过用一种或多种限制酶消化染色体DNA以产生基因组文库或一种大小的随机DNA片段来完成。可将来自随机片段文库的DNA片段插入到重组核酸中。该重组核酸通常为载体，例如它可为质粒，噬菌体或任何适宜于核酸序列的转移或适宜于转移和表达的其它任何构建物。本领域技术人员能从广泛可获得的载体开始来制备适宜载体，所述广泛可获得的载体将通过例如Sambrook等(分子克隆实验室手册；1989)描述的那些的本领域已知的基因工程方法而被修饰。本发明的载体一般包括一个或多个复制起点，这样它可在宿主细胞中，例如细菌细胞或酵母细胞中被复制(这使得构建物能在例如大肠杆菌中，通过分子生物学标准方法被复制和操作)。载体还通常至少包括下面的元件，通常按5′-3′排列指导编码本发明酶的核酸序列表达的启动子；任选启动子的调节子，转录起始位点，翻译起始密码子；和编码本发明的酶的核酸序列。载体还可含有一或多个选择性标记基因，例如一或多个抗生素抗性基因。该标记基团使得能够鉴别转化体。任选地，载体还可包含启动子用的增强子。载体还可在通常是编码本发明酶的核酸的3′端包含一个加A信号。载体还可在编码本发明酶的序列的3′端包含一个转录终止子。载体还可在例如编码感兴趣多肽的序列的3′端包含一或多个内含子或其它非编码序列。在典型的载体中，编码本发明酶的核酸序列可操作性地与能表达该序列的启动子相连。“可操作性地相连”指邻近(juxtaposition)，其中启动子和编码本发明酶的核酸序列处于一种允许编码序列在启动子的控制下表达的关系。因此，在启动子和编码序列之间可具有例如5′非编码序列的元件。如果这些序列增强或不损害启动子对编码序列的正确控制，那么这些序列可包含在载体中。任何能指导编码治疗肽或蛋白的核酸表达的适宜启动子可包含在载体中。例如，该启动子可为细菌，真核生物或病毒启动子。启动子可为组成型或诱导型。因此，本发明提供包含一或多种本发明重组核酸的宿主细胞。这些细胞一般被用重组核酸转化或转染。可通过任何适宜方法将重组核酸导入宿主细胞中。例如，为了转染细胞，可将编码本发明酶的序列包裹至感染性的病毒颗粒中。还可通过电穿孔，脂转染，biolistic转化或通过简单地在溶液中将核酸序列与细胞接触来导入编码本发明酶的核酸序列。如在质粒情况下，该载体可在整合到宿主细胞基因组之后或保持在染色体外而进行复制。可采用任何适宜的宿主细胞，包括原核和真核微生物和植物细胞。可使用通常可得到的方法，例如筛选标记的存在来选择重组克隆。一种适宜的筛选方法包括核酸杂交，抗体分析和检测蛋白质活性的平板分析。如果感兴趣的酶被分泌，可通过常规方法从生长培养基中回收。另外，可通过破碎宿主细胞并接着使用本领域已知的回收方法来回收。已发现本发明的具体的新的微生物Thermopalliumnatronophilum产生有价值的新的酶，尤其是淀粉酶，纤维素酶，脂肪酶，蛋白酶，支链淀粉酶和木聚糖酶。作为说明，将描述本发明淀粉酶的性质。微生物产生的淀粉酶的性质通过与蛋白标记比较，通过凝胶过滤层析从生长培养基分离的可溶性淀粉酶级分的分子量为90kDa。该淀粉酶级分的淀粉酶活性的最佳温度为95℃和最佳pH为8.8(图2和图3)。两种淀粉酶可通过离子交换层析分离，并且当用SDS-聚丙烯酰胺凝电泳测定时，得到下面的分子量淀粉酶A-1亚基分子量＝87kDa淀粉酶A-II亚基分子量＝83kDa。淀粉酶A-I的最佳温度为95℃，最佳pH为10.2(图4和图5)。96℃下测得它活性的半衰期为11分钟。淀粉酶A-II的最佳温度为80℃，最佳pH为9.6(图6和图7)。在80℃保温120分钟期间没有酶活性丧失。该淀粉酶具有下面其它的特性。淀粉酶A-I-对可溶性淀粉的水解活性主要产生麦芽糖和其它糊精。-对支链淀粉的水解活性。-NaCl(0.0067M)增强其活性。淀粉酶A-II-对可溶性淀粉的水解活性产生糊精(G1-G9)。-EDTA和EGTA降低其活性。-发挥活性需要Ca2+。淀粉酶A-1具有N-末端氨基酸序列Xaa-Xaa-Glu-Ile-Ile-Tyr-Val/Asp-Gly-Phe(其中Xaa代表任何氨基酸)；并包含(内部)部分氨基酸序列Tyr-Ile-Gly-Asp-Gly-Ala-(Trp)-Glu-Ala-Val-Leu-Glu-Gly-(Asp)-(Asp)-Glu-(Gly/Glu)-Phe-Tyr-Arg(其中括号说明对氨基酸同一性的不确定性)。淀粉酶A-II全部包含(内部)部分氨基酸序列Ile-Gly-Leu-Pro-Ser-Val-Met-Thr-Glu-Pro-Trp-Asn-Pro-Ile-Gly-Gly-Ser-Asn-(Trp)-Ile-Phe-Asp-Met-Met-Leu-Ile-(Arg).淀粉酶A-I和A-II是本发明优选的淀粉酶，但本发明不局限于这些淀粉酶。而且，本发明还提供这些淀粉酶的具有稍微不同氨基酸序列的变体，以及编码这些变体的核酸序列。本发明的变体淀粉酶一般与淀粉酶A-I或淀粉酶A-II具有高度的序列同源性，例如高达70％，高达80％，高达90％，高达95％或高达99％的序列同源性。变体可能具有与淀粉酶A-I或淀粉酶A-II序列的不同之处在于一个或多个缺失、置换或插入的序列，只要该变体具有或基本上具有淀粉酶A-I或淀粉酶A-II的淀粉酶活性。例如，变体一般对淀粉酶A-I和/或A-II对其具有水解活性的一些或所有底物具有水解活性。发明的实用性从该新生物获得的酶可用于洗涤剂工业中的洗衣洗涤剂和自动洗涤器皿洗涤剂。由于它们的热稳定性和碱性特征，这些酶极其适宜于用在高温高pH下。换句话说，它们极其适宜于用在对洗涤，尤其是洗涤器皿来说最理想的环境中。可以粉状和液体洗涤剂形式用于污点和脏物降解的酶的实例为用于降解碳水化合物的淀粉酶，降解蛋白质的蛋白酶和降解脂质的脂肪酶。如果酶以组合物形式使用，如以洗涤剂组合物形式，它们可与本领域已知的许多其它洗涤剂成分，例如助洗剂，漂白剂，漂白活化剂，软化剂，香料，其它酶等结合使用。洗涤剂工业不是对热稳定碱性酶感兴趣的唯一工业。在造纸和纸浆工业以及纺织工业也发现了这些酶的许多有用的用途。例如，尤其与碱性洗涤方法结合，热稳定碱性淀粉酶可用于洗衣洗涤剂和自动洗涤器皿的洗涤剂，而且可用于造纸，尤其是脱浆，和织物的脱浆。正是热稳定碱性酶的多功能性解释了对这些酶的日益增加的需要。实施例实施例1.微生物的培养培养基在具有下面组成的培养基中培养Thermopalliumnatronophilum(每升)100ml溶液A10ml溶液B10ml溶液C5ml维生素溶液(Raven等(1992)应用微生物学生物技术38，263-267或DSM141)。1ml刃天青(Resazurin)溶液(1g/L)(Sigma)2g胰化蛋白胨(DifcoBacto)1g酵母提取物(DifcoBacto)2.5g可溶淀粉(BDH/Merck)2g氯化钠5g碳酸氢钠0.5g硫化钠.xH2O用1MHCl或20％v/vH2SO4将pH调至pH8.5。在严格厌氧条件下制备该培养基。大规模生长条件65℃下，在用P160玻璃分配管(最大孔隙性为160μm)连续喷射无氧的氮气(0.1vvm)且不控制pH的条件下，将培养物培养在20升体积的玻璃储存瓶中。用1％预生长的培养物接种灭菌的培养基。让细胞生长18-21小时，达到光密度(A600)为0.7-0.8。在SorvallRC3-B离心机中通过连续离心(5000rpm，20分钟，4℃)收集细胞。通常的生物量产率为3.2-3.9g/L(湿重)。将细胞膏贮存于-20℃。实施例2酶的提取将细胞膏(来自实施例1)在缓冲液(0.05MTris，0.005MEDTA，pH8.5)中稀释至0.2g/ml。0℃下，使用UltrasonicsLtd.，型号SP-598设备的3mm探针，采用50W下3×10秒将混合物超声处理。5℃下，将破碎的细胞悬液以20,000rpm离心20分钟(Sorvall，转子SM-24)。将细胞沉淀重新悬浮于缓冲液中，混合并再离心。混合两个上清级分。另外，将细胞的浓缩悬液解冻并加入6NNaOH使pH升至12。室温下将混合物保温过夜。用酸再将pH调至pH8-10，将混合物以20,000rpm离心40分钟，并收集上清。实施例3.淀粉酶的纯化通过在Cenfriprep-30装置(Amicon)中，使用具有10kDa分子量截断值的膜超滤，将上清(来自实施例2)浓缩至1.5-2ml。将浓缩蛋白在用0.02MTris缓冲液(pH8.5)以1ml/分钟流速洗脱的HR16/60Superdex-200柱上进行凝胶过滤。混合含有淀粉酶活性的级分并在HR5/5MonoQ柱上进行离子交换层析。将蛋白用盐梯度为0-2MNaCl的0.02MTris缓冲液(pH8.5)以0.75ml/分钟的流速洗脱。获得混合的并对0.02MTris缓冲液pH8.5透析的单独的淀粉酶活性的两级分。通过进一步使用离子交换层析完成对各淀粉酶蛋白的进一步纯化。获得淀粉酶活性的两个级分，淀粉酶A-I和淀粉酶A-II。将两个淀粉酶成分用SDS-PAGE检测，显示A-I和A-II的亚基分子量分别为87kDa和83kDa。实施例4.淀粉酶活性分析方法1.采用改进的Bernfeld分析(Bernfeld，P.(1955).见酶学方法VOL.1(S.P.Colowick和N.O.Kaplan，编)AcademicPress，NewYork，PP149-158)。80℃下，将100μl酶样品与425μl缓冲液(0.05MTris，0.005MEDTA，0.0067MNaCl[pH8.5，20℃，pH8，80℃])，150μl底物(0.05MTris，0.005MEDTA，0.0067MNaCl，1％(w/v)可溶性马铃薯淀粉(Sigma)，pH8.5，20℃)和75μl0.002MCaCl2一起保温20分钟。将反应用显影溶液(1％w/v3，5-二硝基水杨酸的0.4MNaOH溶液)终止并煮沸5分钟。冰上冷却分析混合物，在550mm处测定并用使用麦芽糖代替该酶制成的校准曲线读出吸光率。方法2.70℃下，将100μl酶样品与900μl底物溶液(1％w/v可溶淀粉的0.005MMES/HEPES/甘氨酸缓冲液溶液，pH8.0)一起保温60分钟。加入10μl6NHCl终止反应并向100μl反应混合物中加入1ml碘溶液(Sigma，P700-2；1∶3稀释)来显影。在620nm处测定对水的吸光率并与使用α-淀粉酶活性为82650TAU/g的标准α-淀粉酶(MaxamyLS3)制成的标准校准曲线比较。方法3(用于淀粉酶A-I).除了将酶样品与650μl底物(0.05MTris，1％w/v可溶性马铃薯淀粉，0.0067MNaCl，pH8.5，20℃)一起保温外，条件与方法1相同。方法4(用于淀粉酶A-II)除了将酶样品与650μl底物溶液(0.05MTris，1％w/v可溶性马铃薯淀粉，0.002MCaCl2，pH8.5，20℃)一起保温外，条件与方法1相同。实施例5.温度对酶活性的影响在第一个试验中，在60℃-105℃范围内分析按实施例2得自生长细胞并用凝胶过滤层析分离(实施例3)的未纯化酶的酶的淀粉酶活性。根据实施例4的分析方法l，在0.05MTris缓冲液中测定酶活性。结果表明活性的最佳温度为95℃，如图2所示。在第二个试验中，在65℃-100℃范围内分析根据实施例3获得的纯化的淀粉酶A-I。根据实施例4的分析方法3测定酶活性。结果表明活性的最佳温度为95℃，在88℃-99℃范围内显示50％的最大活性，如图4所示。在第三个试验中，在65℃-100℃范围内分析根据实施例3获得的纯化的淀粉酶A-II。根据实施例4的分析方法4测定酶活性。结果表明活性的最佳温度为80℃的宽图谱，在小于65℃-96℃范围内具有50％的最大活性，如图6所示。实施例6.pH对酶活性的影响。在第一个试验中，在pH6.0-10.8范围内，分析根据实施例2得自生长细胞并用凝胶过滤层析分离(实施例3)的未纯化的酶的淀粉酶活性。80℃下，根据实施例4的分析方法1，并且用用于所需pH范围的适宜缓冲液(MES，HEPES或甘氨酸)代替Tris缓冲液来测定酶活。结果表明pH7.5-pH9.5之间的宽的最佳pH，最大活性的pH为8.8，如图3所示。在第二个试验中，在pH4.1-11.4范围内，通过采用适宜缓冲液(乙酸盐，MOPS，MES，Tris，HEPES，二乙醇胺或甘氨酸)来分析根据实施例3获得的纯化的淀粉酶A-I。80℃下，根据实施例4的分析方法3测定酶活性。结果表明淀粉酶A-I活性的最佳pH为pH10.2，如图5所示。在第三个试验中，在pH4.1-11.4范围内，通过采用适宜缓冲液(乙酸盐，MOPS，MES，Tris，HEPES，二乙醇胺或甘氨酸)来分析根据实施例3获得的纯化的淀粉酶A-II。80℃下，根据实施例4的分析方法3测定酶活性。结果表明淀粉酶A-II活性的最佳pH为pH9.6，在pH8.1-大于pH11.5范围内具有50％的最大活性，如图7所示。实施例7.淀粉酶的氨基酸序列分析。根据实施例3获得的具有87kDa分子量的淀粉酶A-I的N-末端氨基酸序列通过EUROSEQUENCE(Groningen，TheNetherlands)来确定。N-末端氨基酸序列(所附序列表中的SEQIDNO.2)被确定为Xaa-Xaa-Glu-Ile-Ile-Tyr-Val/Asp-Gly-Phe(其中Xaa代表任何氨基酸)。淀粉酶A-I蛋白的又一片段产生一个氨基酸序列(所附序列表中的SEQIDNO.3)如下Tyr-Ile-Gly-Asp-Gly-Ala-(Trp)-Glu-Ala-Val-Leu-Glu-Gly-(Asp)-(Asp)-Glu-(Glu/Gly)-Phe-Tyr-Arg(其中括号说明氨基酸同一性不确定)。类似地，根据实施例3获得的作为83kDa蛋白的淀粉酶A-II提供部分氨基酸序列(所附序列表中的SEQIDNO.4)如下Ile-Gly-Leu-Pro-Ser-Val-Met-Thr-Glu-Pro-Trp-Asn-Pro-Ile-Gly-Gly-Ser-Asn-(Trp)-lle-Phe-Asp-Met-Met-Leu-Ile-(Arg).实施例8.淀粉酶基因的分离在质粒pTZ18R(Mead，D.A.等(1986)蛋白质工程1，67)中构建菌株Tg9a的基因组文库。将ThermopalliumnatronophilumTg9A的染色体DNA用HindIII和EcoRI消化。用琼脂糖凝胶电泳按大小分离限制片段，并从凝胶中分离出1kb和更大的片段。将这一级分连接到来自载体pTZ18R的HindIII/EcoRI消化的DNA上。用电穿孔法将连接物转化到大肠杆菌XL1BlueMRF中。在直链淀粉天青琼脂上筛选重组克隆。分离在菌落周围显示清晰区的克隆。37℃下，在LB-培养基(Miller，J.H.(1972)分子遗传学实验，ColdSpringHarborLaboratory，P.433)中生长24小时后，确定重组菌株的淀粉酶活性。可分离重组菌株的质粒DNA，并通过限制性分析来表征插入物。序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称Gist-brocadesB.V.(B)街道Wateringseweg1(C)城市Delft(E)国家TheNetherlands(F)邮编2611XT(ii)发明名称新的嗜碱和嗜热微生物及由其所获得的酶。(iii)序列数目4(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQIDNo.1的信息(i)序列特征(A)长度1437碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(vi)初始来源(A)生物Thermopalliumnatronophilum(B)菌株Tg9A(C)单个分离菌DSM9460(ix)特征(A)名称/关键词misc_RNA(B)位置1..1437(D)其它信息/部分/产物＝“16S核糖体RNA”(xi)序列描述SEQIDNO1CTGNCGGCGTGCCTAACACATNCAAGTCGAGCGGTGCTACGGAGGTCTTCGGACTGAAGT60AGCATAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACACAGGAACGTGCCCCTTGGAGGCGGATAGCTG120TGGGAAACTGCAGGTAATCCGCCGTAAGCTCGGGAGAGGAAAGCCGGAAGGCGCCGAGGG180AGCGGCCTGTGGCCCATCAGGTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGCCGACGACGGGT240AGCCGGTCTGAGAGGATGGACGGCCACAAGGGCACTGAGACACGGGCCCTACTCCTACGG300GAGGCAGCAGTGGGGGATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCGACGCCGCGTGA360GGGACGAAGTCCTTCGGGACGTAAACCTCTGTTGTAGGGGAAGAAGACAGTGACGGTACC420CTACGAGGAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGNCGAGC480GTTACCCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTCTAGCAAGTCTGGCCTTAAA540GACCACGGCTCAACCGTGGGGATGGGCTGGAAACTGTTAGACTTGAGGGCACTAGAGGCA600GACGGAACTGCTGGTGTAGGGGTGAAATCCGTAGATATCAGCAGGAACGCCGGTGGAGAA660GTCGGTCTGCTGGGGTGACCCTGACGCTGAGGCACGAAAGCTAGGGGAGCGAACCGGATT720AGATACCCGGGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGCTCACTAGGTGTGGGGGAGTAAATCCTC780CGTGCTGAAGCTAACGCGATAAGTGAGCCNCCTGGGGAGTACGCCCNCAAGGGTGAAACT840CAAAGGAATTGACGGGGGNCCGCACAANCGGTGGAGCGTGTGGTTTAATTGGAAGCTAAG900CCAAGAACCTTACCAGGGTTTGACATTCTGGTGGTACCGANCCGAAAGGTGAGGGACTCT960TCACTTAGGTGGAGGGAGCCAGCACAGGTGGTGCACGGTCGTCGTCAGCTCGTGCCGTGA1020GGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGCCCTTAGTTGCCAGCACGTAAAG1080GTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCTGCGACGAGCAGGAGGAAGGAGGGGATGACGTCAGAT1140ACTCGTGCCCCTTATGCCCTGGGCGACACACGCGCTACAATGGGCAGGACAAAGGGAAGC1200GAGCCGGCGACGGTGAGCAAATCCCAAAAACCTGCCCCCAGTTCAGATTGTGGGCTGAAA1260CCCGCCCACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCCACGCCACGGTGAATAC1320GTNCCCGGGNCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCACCCGAGTTGGGGGNACCCGAAGATA1380CGTACCCTTAGGGGGCGTATTTAGGGTGAACCTGGTGAGGGGGGGTNGTCGGAAGTC1437(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(v)片段类型N-末端(vi)初始来源(A)生物Thermopalliumnatronophilum(B)菌株Tg9A(C)单个分离菌DSM9460(xi)序列描述SEQIDNO2XaaXaaGluIleIleTyrXaaGlyPhe15(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(v)片段类型内部(vi)初始来源(A)生物Thermopalliumnatronophilum(B)菌株Tg9A(C)单个分离菌DSM9460(xi)序列描述SEQIDNO3TyrIleGlyAspGlyAlaTrpGluAlaValLeuGluGlyAspAspGlu151015XaaPheTyrArg20(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)长度27个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(v)片段类型内部(vi)初始来源(A)生物Thermopalliumnatronophilum(B)菌株Tg9A(C)单个分离菌DSM9460(xi)序列描述SEQIDNO4IleGlyLeuProSerValMetThrGluProTrpAsnProIleGlyGly151015SerAsnTrpIlePheAspMetMetLeuIleArg202权利要求1.一种嗜热嗜碱性细菌的纯培养物，其中该细菌为Thermopallium属的成员。2.根据权利要求1的嗜热嗜碱性细菌的纯培养物，其中该细菌为Thermopalliumnatronophilum种的成员。3.根据权利要求1的嗜热细菌的纯培养物，其中该细菌为保藏号为DSM9460的ThermopalliumNatronophilumTg9a菌株的成员。4.嗜热细菌的纯培养物，其中所述细菌的16SrRNA的核苷酸序列显示与SEQIDNO.1的16SrRNA基因序列92-100％的同一性。5.细菌的纯培养物，其中该细菌的16SrRNA的核苷酸序列显示与SEQIDNO.1的16SrRNA基因序列95-100％的同一性。6.权利要求5的细菌的纯培养物，其中该细菌为嗜碱的或嗜热的。7.可从前述任一项权利要求中定义的细菌获得的多肽，它通过在适宜于产生该多肽的条件下培养能产生该多肽的细菌并回收该多肽而获得。8.根据权利要求7的多肽，其中该多肽为一种酶。9.根据权利要求8的多肽，其中该酶为淀粉酶或支链淀粉酶。10.一种分离的碱性支链淀粉酶，其具有(a)SEQIDNO.2中所示的N-末端氨基酸序列，或如SEQIDNO.3中所示的内部氨基酸序列；或(b)与其不同之处在于一个或多个氨基酸缺失、置换或插入但具有支链淀粉酶活性的变体。11.一种分离的碱性淀粉酶，其具有(a)如SEQIDNO.4所示的内部氨基酸序列；或(b)与其不同之处在于一个或多个氨基酸缺失、置换或插入但具有淀粉酶活性的变体。12.一种组合物，包括权利要求7-9定义的多肽，权利要求10定义的支链淀粉酶或权利要求11定义的淀粉酶。13.权利要求12的组合物，其中该组合物为洗涤剂组合物。14.一种获得权利要求7-9定义的多肽、权利要求10定义的支链淀粉酶或权利要求11定义的淀粉酶的方法，包括(a)培养根据权利要求1-6的细菌，(b)回收包含如权利要求7-9定义的多肽、如权利要求10定义的支链淀粉酶或如权利要求11定义的淀粉酶的级分。15.一种制备根据权利要求11或12的组合物的方法，包括(a)培养权利要求1-6的细菌，(b)回收包含如权利要求7-9定义的多肽、如权利要求10定义的支链淀粉酶或权利要求11定义的淀粉酶的级分。16.一种分离的核酸，其编码根据权利要求7-9的多肽或具有如SEQIDNO.2，3或4所示氨基酸序列的酶。17.一种重组核酸，其包含根据权利要求16的核酸。18.一种宿主细胞，其包含根据权利要求17的重组核酸。19.一种制备根据权利要求7-9的多肽、如权利要求10定义的支链淀粉酶或如权利要求11定义的淀粉酶的方法，包括(a)培养根据权利要求18的宿主细胞，从而它表达所述多肽、支链淀粉酶或淀粉酶，和(b)回收产生的多肽、支链淀粉酶或淀粉酶。20.根据权利要求7-9的多肽、如权利要求9定义的支链淀粉酶或如权利要求11定义的淀粉酶在纸或纸浆生产、织物的生产或配制洗涤剂组合物中的应用。全文摘要本发明提供嗜热嗜碱细菌和从其所获得的热稳定碱性多肽。它还提供一种制备本发明多肽、编码该多肽的核酸及包含该多肽的组合物的方法。它还涉及可从这些新生物中获得的酶在洗涤剂工业,造纸和纸浆工业及纺织工业中的应用。文档编号C12N1/21GK1199424SQ96196945公开日1998年11月18日申请日期1996年9月3日优先权日1995年9月13日发明者B·E·琼斯,M·A·赫维杰,M·J·丹桑,D·W·霍格,C·R·索姆普桑申请人:金克克国际有限公司