专利名称：：用于在植物中调节基因表达的组合物和方法本申请是下列申请的部分继续申请1)Edington的发明名称为＂用于产生淀粉颗粒结合葡萄糖糖转移酶活性缺陷的转基因植物的方法＂的非临时申请U.S.S.N.08/300,726(申请日是1994年9月2日)；和2)Zwick等的发明名称为“在植物中修饰脂肪酸饱和度的组合体和方法”的临时申请U.S.S.N60/001,135(申请日是1995年7月13日)。这两份申请以其整体(包括附图)一并被本文参考。
背景技术：
：本发明涉及用于在植物中调节基因表达的组合物和方法，更具体地说是利用酶促核酸分子在植物中调节基因表达的组合物和方法。以下是在植物中调节基因表达的简要描述。这些讨论不意味着是完全的，仅仅提供来帮助理解随后的本发明。这一概要不是承认以下所描述的任一工作是所要求保护的发明的现有技术。有各种在植物中调节基因表达的策略。反义RNA(Bourque，1995植物科学105，125-149中综述)和共抑制(Jorgensen，1995科学268，686-691中综述)传统地已用于调节基因表达。基因的插入诱变也已用来沉默基因表达。然而，这一方法不能用来特异性地灭活兴趣基因。申请人相信核酶技术可以提供一种在植物中改变基因表达的具有吸引力的新方法。十多年以前首先在细菌中发现了天然存在的反义RNA(Simons和Kleckner，1983细胞34，683-691)。它被认为是一种细菌能够调节它们的基因表达的方式(Green等，1986生物化学年评.55567-597；Simons1988基因7235-44)。基因表达的反义介导抑制作用的首次显示被报道在哺乳动物细胞中(Izant和Weintraub1984细胞361007-1015)。在文献中有许多利用反义RNA在植物中调节基因表达的例子。以下是一些例子Shewmaker等美国专利5,107,065和5,153,566公开了采用反义RNA在植物中调节基因表达的方法。有人指出，在植物中表达的反义基因能够充当显性抑制基因。已产生转基因土豆植物，这些植物表达对土豆或木薯颗粒结合淀粉酶合酶(GBSS)反义的RNA。在这两种情况下，都已构建出具有降低的或者没有GBSS活性或蛋白质的转基因植物。这些转基因植物产生含有具有明显降低的直链淀粉水平的淀粉的土豆(Visser等1991，Mol.Gen.Genet.2252889-296；Salehuzzaman等1993，植物分子生物学23947-962)。Kull等1995，J.Genet.&Breed.49，69-76报道了由颗粒结合淀粉合酶(GBSS)基因反义序列表达所介导的转基因土豆系球根中直链淀粉生物合成的抑制作用。然而，作者指出未能够发现核酶针对GBSSRNA的任何体内活性。已证明在canola中的针对Δ9去饱和酶的反义RNA构建体将硬脂酸(C180)水平从2％增加至40％(Knutzon等，1992Proc.Natl.Acad.Sci.89，2624)。在一个高硬脂酸系中没有总油含量或发芽率的降低。最近有几个说明具有修饰的油组成的植物的实用性的综述(Ohlrogge，J.B.1994植物生理学.104，821；Kinney，A.J.1994Curr.Opin.CellBiol.5，144；Gibson等1994PlantCellEnvir.17，627)。文献首先记载了在植物中的同源的转基因灭活，其是作为一种以有义方向插入转基因并发现基因和转基因两者被下调的出乎意料的结果(Napoli等，1990，PlantCell2279-289)。似乎存在灭活同源遗传序列至少两种机制。一种似乎是经甲基化作用的转录灭活(基因沉默的复制DNA区信号内源机制)。这一基因调节方法涉及引入转基因多拷贝或者用具有与兴趣基因同源性的转基因转化植物(Ronchi等1995EMBOJ.145318-5328)。另一种共抑制机制是转录后的，其中从基因和转基因两者表达的总水平被认为产生高水平的转录本，它引发两种信号的阈值诱导降级(vanBokland等，1994植物学杂志，6861-877)。共抑制的准确分子基础是未知的。遗憾地是，反义和共抑制技术两者在所需性状的遗传率上存在问题(Finnegan和McElroy1994生物技术，12883-888)。当前，没有在植物DNA水平上特异性灭活兴趣基因的容易的方法(Pazkowski等，1988，EMBO，J.74021-4026)。转座子突变是低效的并且是不稳定的事件，而化学诱变是高度非特异性的。申请人相信核酶具有有吸引力的可替性，并且由于其催化作用机制而具有超过竞争技术的优点。然而，在植物系统中证明核酶调节基因表达的有效性有困难(Mazzolini等，1992植物分子生物学.20715-731；Kull等，1995J.Genet.&Breed.4969-76)。虽然有文献报道了核酶在植物细胞中的活性，但它们几乎都牵涉到下调外源引入的基因，例如在瞬时测定中的报道基因(Steinecke等，1992EMBOJ.111525-1530；Perriman等，1993AntisenseRes.Dev.3253-263；Perriman等，1995，美国科学院学报，92，6165)。也有几种出版物[例如，Lamb和Hay，1990，J.Gen.Virol.71，2257-2264；Gerlach等，国际PCT出版物No.WO91/13994；Xu等，1992，中国科学(Ser.B)35，1434-1443；Edington和Nelson，1992，基因调节反义RNA和DNA生物学，编者R.P.Erickson和J.G.Izant，pp209-221，Raven出版社，NY.；Atkins等，国际PCT出版物No.WO94/00012；Lenee等，国际PCT出版物No.WO94/19476和WO95/03404，Atkins等，1995，J.Gen.Virol.76，1781-1790；Gruber等，1994，细胞生物化学杂志增刊18A，110(X1-406)和Feyter等，1996，Mol.Gen.Genet.250，329-338]提出利用锤头核酶调节病毒复制、病毒基因和/或报道基因的表达。这些出版物没有报告利用核酶调节植物基因的表达。Mazzolini等，1992，植物分子生物学20，715-731；Steinecke等，1992，EMBO.J.11，1525-1530；Perriman等，1995，美国科学院学报，92，6175-6179；Wegener等，1994，Mol.Gen.Genet.245，465-470；和Steinecke等，1994，基因，149，47-54描述了利用锤头核酶在植物细胞中抑制报道基因的表达。Bennett和Cullimore.1992核酸研究20，831～837阐述了锤头核酶介导的glna，glnb，glng和glndRNA(在Phaseolusvulgaris中编码谷氨酰胺合成酶)的体外切割。Hitz等(WO91/18985)描述了采用大豆Δ-9去饱和酶修饰植物油组成的方法。该申请描述了用大豆Δ-9去饱和酶序列从其它物种分离Δ-9去饱和酶基因。以上所引用的参考文献明显不同于本发明，因为它们没有公开和/或不涉及在玉米中使用核酶。此外，申请人相信这些文献没有公开用核酶下调植物细胞中的基因，和/或不能够用核酶下调植物细胞中的基因，更不要说植物本身了。发明概要本发明的特征在于利用酶促核酸分子在植物中特异性地调节基因表达。优选地，所说的基因是内源基因。具有RNA切割活性的酶促核酸分子可以以锤头、发夹、肝炎Δ病毒、I组内含子、II组内含子、RNA酶PRNA、脉孢菌属VSRNA等形式，但不限于这些形式。具有RNA切割活性的酶促核酸分子可以作为单体或多体(优选地是多体)被编码。编码具有RNA切割活性的酶促核酸分子的核酸可以可操作地连接到开放读框上。可以通过用编码具有RNA切割活性的酶促核酸分子的核酸转化植物来修饰任何植物中的基因表达。也有许多转化植物的技术这些技术包括但不限于用土壤杆菌属、DNA包被微粒(coatedmicroprojectiles)轰击、噬菌体颈须(whiskers)或电穿孔转化。可以用编码具有RNA切割活性的酶促核酸分子的核酸修饰任何靶基因。这里两种例证性的靶是Δ9去饱和酶和颗粒结合淀粉合酶(GBSS)。直到本发明的发现才阐明了基于核酸的试剂(如酶促核酸(核酶))在植物(例如单子叶植物(如玉米))中调节和/或抑制基因表达。核酶能够用来调节植物细胞一个特定的性状，例如，通过调节生物化学途径中涉及的酶活性。在某些情况下，降低特定基因的表达水平而不是完全消除其表达可能是合乎需要的，核酶能够用来达到这一目的。本发明开发了以酶促核酸为基础的技术使得可以指导性调节基因表达，以产生具有改变的表型的植物细胞、植物组织或植物。核酶(即酶促核酸)是具有能够以核苷酸碱基序列特异性方式重复切割其它不同的RNA分子的酶促活性的核酸分子。这样的酶促RNA分子可被导向几乎任何RNA转录物，并且在体内和体外已获得了有效的切割(Zaug等，1986，自然324，429；Kim等，1987，美国科学院学报84，8788；Dreyfus，1988，EinsteinQuarrerlyJ.Bio.Med..6，92；Hascloff和Gerlach，1988，自然334585；Cech，1988，JAMA260，3030；Murphy和Cech，1989，美国科学院学报，86，9218；Jefferies等，1989，核酸研究17，1371)。由于它们的序列特异性，反式切割核酶可以用作在各种有机体(包括植物，动物以及人类)中调节基因表达的有效工具(Bennett等，同上；Edington等，同上；Usman&McSwiggen，1995Ann.Rep.Med.Chem.30，285-294；Christoffersen和Marr；1995J.Med.Chem.38，2023-2037)。核酶能够设计成在细胞RNA背景内切割特定的RNA靶。这样一种切割事件使得mRNA无功能，并且抑制了蛋白质从RNA表达。按这种方式，与特殊的表型和/或疾病状态相联系的蛋白质的合成能够选择性地被抑制。本发明的其它特征与优点从以下描述的其优选的实施方案以及权利要求可以看出。附图简要描述图1是现有技术中已知的锤头核酶区的图示。干II可以是≥2碱基对长。每个N是任何核苷酸，每个·代表一个碱基对。图2a是现有技术中已知的锤头核酶区的图示；图2b是如Uhlenbeck(1987，自然，327，596-600)划分成底物和酶部分的锤头核酶的图示；图2c是显示由Haseloff和Gerlach(1988，自然，334，585-591)划分成两部分的锤头的类似图；图2d是显示由Jeffries和Symons(1989，核酸研究，17，1371-1371)划分成两部分的锤头的类似图。图3是发夹核酶的一般结构的图示。螺旋2(H2)具有至少4个碱基对(即n是1、2、3或4)，螺旋5可以可有可无地具有2个或多个碱基(优选地是3-20个碱基，即m是1-20或更多)。螺旋2和5可以经一个或多个碱基(即r是≥1个碱基)共价连接。螺旋1、4或5也可以由2个或多个碱基对(如4-20个碱基对)延伸，以稳定核酶结构，并且优选地是蛋白质结合位点。在每一个实例中，各N和N’分别是任何正常的或修饰的碱基，各破折号代表潜在碱基配对相互作用。这些核苷酸可以在糖基、碱基以及磷酸基上被修饰。在螺旋中完全的碱基配对不是必需的，但是是优选的。螺旋1和4可以是任何大小(即o和p各自分别是0到任何数，例如20)，只要某些碱基配对被保持。必需碱基作为结构中特定碱基显示，但本领域技术人员会认识到一个或多个碱基可以经化学修饰(脱碱基、碱基、糖基和/或磷酸基修饰)或用没有明显影响的另一种碱基取代。螺旋4可以从两个单独分子形成，即没有连接环。连接环在存在时可以是有或没有碱基、糖基或磷酸基修饰的核糖核苷酸。“q”是≥2个碱基。连接环也可以被非核苷酸接头分子替代。H指碱基A、U、或C。Y指嘧啶碱基。“—”指共价键。图4是现有技术中已知的肝炎Δ病毒核酶区的一般结构的图示。图5是自切割VSRNA核酶区的一般结构的图示。图6是RNA酶H可及性测定的示意图。具体地说，图6的左侧是结合到靶RNA的易接近位点上的互补DNA寡核苷酸的图。互补DNA寡核苷酸由标记有A、B和C的宽线表示。靶RNA由细的扭曲线表示。图6的右侧是来自切割的靶RNA的未切割靶RNA的凝胶分离示意图。靶RNA的检测通过体标记的T7转录物的放射自显影进行。各道共同的带代表未切割的靶RNA；各道特有的带代表切割产物。图7是GBSSRNA的RNA酶H可及性的图示。图8是在不同的温度下由核酶进行的GBSSRNA切割的图示。图9是由多核酶进行的GBSSRNA切割的图示。图10列出了从玉米分离的Δ9去饱和酶cDNA的核苷酸序列。图11和12是在植物中脂肪酸生物合成的图示。图11从Gibson等1994，PlantCellEnvir.17，627改编。图13和14是Δ-9去饱和酶RNA的RNA酶H可及性的图示。图15显示经核酶进行的体外Δ-9去饱和酶RNA的切割。10/10代表锤头(HH)核酶的结合臂的长度。10/10指螺旋1和螺旋3各与靶RNA形成10个碱基对(图1)。4/6和6/6代表发夹核酶和其靶之间的螺旋2/螺旋I相互作用。4/6指发夹(HP)核酶与靶形成4个碱基配对的螺旋2和6个碱基配对的螺旋1复合物(参见图3)。6/6指发夹核酶与靶形成6个碱基配对的螺旋2和6个碱基配对的螺旋1复合物。切割反应在26℃下进行120分钟。图16显示臂长度变化对HH和HP核酶体外活性的影响。7/7、10/10和12/12实质上如以上对HH核酶的描述。6/6，6/8，6/12代表发夹核酶的变化的螺旋1长度和恒定的(6bp)螺旋2。切割反应实质上如以上的描述进行。图17、18、19和23是构建包含多核酶基元(相同或不相同，导向Δ-9去饱和酶RNA内的各种位点)的转录物的非限制策略的图示。图20和21显示由采用噬菌体T7RNA聚合酶从DNA模板转录的核酶进行的Δ9去饱和酶RNA的体外切割。图22是构建包含多核酶基元(相同或不相同，导向GBSSRNA内的各种位点)的转录物的非限制策略的图示。图24显示由核酶进行的Δ9去饱和酶RNA的切割。453多体代表针对锤头核酶位点453、464、475和484的多体核酶构建体。252多体代表针对锤头核酶位点252、271、313和326的多体核酶构建体。238多体代表针对三个锤头核酶位点252、259和271以及一个发夹核酶位点238(HP)的多体核酶构建体。259多体代表针对两个锤头核酶位点271和313以及一个发夹核酶位点259(HP)的多体核酶构建体。图25说明在核酶阴性对照(C、F、I、J、N、P、Q)和活性核酶RPA63转化体(AA、DD、EE、FF、GG、HH、JJ、KK)中GBSSmRNA的水平。图26说明在未转化的植物(NT)、85-06高硬脂酸植物(1、3、5、8、12、14)以及转化的(不相干核酶)对照植物(RPA63-33、RPA63-51、RPA63-65)中的Δ9去饱和酶mRNA水平。图27说明未转化的植物(NTO)、85-15高硬脂酸植物(01、06、07、10、11、12)和85-15正常硬脂酸植物(02、05、09、14)中Δ9去饱和酶mRNA的水平。图28说明未转化的植物(NTY)、113-06无活性核酶植物(02、04、07、10、11)中Δ9去饱和酶mRNA的水平。图29a和29b说明在玉米叶片(R0)中Δ9去饱和酶蛋白质的水平。(a)未转化的HiII系植物a-e和核酶失活的RPA113-17系植物1-6。(b)核酶活性的RPA85-15系植物1-15。图30说明在RPA85-06植物叶片中的硬脂酸。图31说明在RPA85-15植物叶片中的硬脂酸，三种试验的结果。图32说明在RPA113-06植物叶片中的硬脂酸。图33说明在RPA113-17植物叶片中的硬脂酸。图34说明在对照植物中的叶片中的硬脂酸。图35说明R1植物(来源于高硬脂酸植物杂交)(RPA85-15.07自交)中的叶片硬脂酸。图36说明在下一代玉米叶片(R1)中Δ9去饱和酶的水平。*表示显示出高硬脂酸含量的那些植物。图37说明用反义Δ9去饱和酶转化的培养物(308/430-012)的个体体胚中的硬脂酸。图38说明用反义Δ9去饱和酶转化的培养物(308/430-015)的个体体胚中的硬脂酸。图39说明从用反义Δ9去饱和酶转化的培养物(308/430-012)再生的植物的个体叶片中的硬脂酸。图40说明在未转化的对照系(Q806)和反义系308/425-12.2.1的单个谷粒中的直链淀粉含量。图41说明在Southern阴性系(RPA63-0306)和Southern阳性系(RPA63-0218)的单个谷粒中的GBSS活性。图42说明能够用来表达本发明的酶促核酸的转化载体。发明详述本发明涉及用于用于在植物中调节基因表达的组合物和方法，更具体地说是利用酶促核酸分子在植物中调节基因表达的组合物和方法。以下短语和术语定义如下＂抑制＂或＂调节＂意指酶(如GBSS和Δ9去饱和酶)活性或由这些基因编码的mRNA水平降低到低于在不存在酶促核酸时观察到的水平，并且优选地是低于在存在无活性RNA分子(能够结合到mRNA上的相同位点上，但不能够切割该RNA)时观察到的水平。“酶促核酸分子”意指在底物结合区中具有对指定基因靶的互补性，并且也具有特异性切割该靶的酶活性的核酸分子。即，该酶促核酸分子能够分子间切割RNA(或DNA)并且由此使靶RNA分子失活。这一互补性能够使得酶促核酸分子充分杂交到靶RNA上，使切割发生。百分之百的互补性是优选的，但是在本发明中低至50-75％的互补性也是有用的。核酸可以在碱基、糖基和/或磷酸基上被修饰。术语酶促核酸与以下词组可替换使用，例如核酶、催化RNA、酶促RNA、催化DNA、核苷酶(nucleozyme)、DNA酶(DNAzyme)、RNA酶、多核酶、分子剪、自接合RNA、自切割RNA、顺式切割RNA、自溶RNA、内切核糖核酸酶、小型酶、先导酶(leadzyme)。所有这些术语都描述具有酶促活性的核酸分子。该术语包括酶促RNA分子，包括一种或多种核糖核苷酸，并且可以包括大多数其它类型的核苷酸或脱碱基部分，如以下描述。＂互补性＂意指核酸能够经传统的Watson-Crick或其它非传统的类型(例如Hoogsteen类型)的碱基配对相互作用与其它RNA序列形成氢键。＂载体＂意指用于传送和/或表达所需核酸的任何基于核酸和/或病毒的技术。＂基因＂意指编码RNA的核酸。＂植物基因＂意指植物所编码的基因。＂内源＂基因意指通常在植物细胞基因组的天然位置发现的基因。＂外源＂或＂异源＂基因意指通常宿主植物细胞中不能发现的，但由标准的基因转移技术引入的基因。“核酸”意指这样一种分子，它可以是单链或双链，由含有糖基、磷酸基和嘌呤或嘧啶碱基(可以相同或不同)的核苷酸组成，并且可以是修饰的或未修饰的。＂基因组＂意指包含在各有机体和/或病毒细胞中的遗传物质。＂mRNA＂意指能够由细胞翻译成为蛋白质的RNA。＂cDNA＂意指互补于和来源于mRNA的DNA。＂dsDNA＂意指双链cDNA。＂有义＂RNA意指包含mRNA序列的RNA转录物。＂反义RNA＂意指包含互补于全部或部分靶RNA和/或mRNA的序列，并且通过干扰初级转录物和/或mRNA的加工、运输和/或翻译而阻断靶基因表达的RNA转录物。互补性可以存在于靶RNA的任何部分，即，在5’非编码序列、3’非编码序列、内含子或编码序列上。反义RNA通常是有义RNA的镜象。如本文所使用的＂表达＂意指植物细胞内的酶促核酸分子、mRNA和/或反义RNA的转录和稳定积累。基因的表达包括基因的转录和把mRNA翻译成为前体或成熟蛋白质。＂共抑制＂意指外源基因的表达，该外源基因与某基因具有实质上的同源性，并且在植物细胞中引起外源和/或内源蛋白质产物的活性降低。＂改变的水平＂意指在转基因有机体中基因产物的产生水平与正常或非转基因有机体中的不同。＂启动子＂意指在基因内控制该基因的表达的核苷酸序列元件。启动子序列提供RNA聚合酶和有效转录所需的其它转录因子的识别作用。各种来源的启动子可以有效地用于植物细胞，以表达核酶。例如，细菌来源的启动子，如章鱼碱合成酶启动子、胭脂氨酸合酶启动子、manopine合成酶启动子；病毒来源的启动子，如花椰菜斑纹病毒(35S)；植物启动子，如核酮糖-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚单位(ssu)、β-conglycinin启动子、菜豆球蛋白启动子、ADH启动子、热休克启动子以及组织特异性启动子。启动子也可以包含某些可以改进转录效率的增强子序列元件。＂增强子＂意指可以刺激启动子活性的核苷酸序列元件(Adh)。＂组成型启动子＂意指在所有细胞类型中和在任何时候都指导连续的基因表达的启动子元件(肌动蛋白、遍在蛋白、CaMV35S)。＂组织特异性＂启动子意指在特定细胞或组织类型如叶片或种子中负责基因表达的启动子元件(玉米醇溶蛋白、油质蛋白、napin、ACP)。＂发育特异性＂启动子意指在特定的植物发育阶段(如早期或晚期胚胎发生)负责基因表达的启动子元件。＂诱导型启动子＂意指负责响应特定信号(如物理刺激(热休克基因)；光(RUBP羧化酶)；激素(Em)；代谢物；和逆境)的基因表达的启动子元件。＂植物＂意指真核和原核光合有机体。＂被子植物＂意指其种子包封在子房中的植物(例如咖啡、烟草、大豆、豌豆)。＂裸子植物＂意指其种子暴露而不是包封在子房中的植物(例如，松树、云杉)。＂单子叶植物＂意指以仅存在一片子叶(胚的原始叶片)为特征的植物。例如，玉米、小麦、水稻和其它。＂双子叶植物＂意指产生具有两片子叶(胚的原始叶片)的种子的植物。例如，咖啡、canola、豌豆和其它。＂转基因植物＂意指表达外源基因的植物。＂开放读框＂意指没有内含子、编码氨基酸序列、具有确定的翻译起始和终止区的核苷酸序列。本发明提供了用于产生一类酶促切割剂的方法，所述切割剂对所需靶的RNA具有高度的特异性。所述酶促核酸分子可被导向靶的高度特异性的序列区，以便可以获得特异性的基因抑制。此外酶促核酸可被导向基因家族的高度保守区，以抑制相关酶家族的基因表达。所说的核酶可以在已由载体(表达本发明的核酸)转化的植物中表达。核酶的酶促性质比其它技术有利，因为影响治疗必需的核酶浓度更低。这一优点反映了核酶起酶促作用的能力。这样，一个单一的核酶分子能够切割许多靶RNA的分子。此外，核酶是高度特异性的抑制剂，其抑制特异性不仅取决于结合到靶RNA上的碱基配对机制，而且取决于靶RNA切割机制。邻近切割位点的单一错配或碱基取代能够完全消除核酶的催化活性。天然存在的酶促RNA的6个基本变体目前是已知的。各变体在生理条件下能催化RNA反式磷酸二酯键的水解(并且由此可以切割其它RNA分子)。表I总结这些核酶的一些特征。一般来说，酶促核酸通过首先结合到靶RNA上起作用。通过酶促核酸的靶结合部分发生这样的结合，该部分很接近该分子起切割靶RNA作用的的酶促部分。这样，酶促核酸首先通过互补碱基配对识别靶RNA，然后结合它，一旦结合到正确的位点，就发挥酶促作用切割靶RNA。这样一种靶RNA的策略性切割将破坏其指导编码的蛋白质合成的能力。在酶促核酸结合和切割它的RNA靶后，它从该RNA释放，寻找另一个靶，并且能够重复结合和切割新的靶。在本发明的一个优选实施方案中，酶促核酸分子以锤头或发夹基元形成，但也可以以肝炎Δ病毒、I组内含子、II组内含子、RNA酶PRNA(与RNA指导序列相关)或脉孢菌属VSRNA形成。这样的锤头基元的例子由Dreyfus，同上，Rossi等，1992，AIDS研究和人类逆转录病毒8，183描述；发夹基元的例子由Hampel等，EP0360257，Hampel和Tritz，1989生物化学28，4929，Feldstein等1989，基因82，53，Haseloff和Gerlach，1989，基因，82，43，和Hampel等，1990核酸研究，18，299描述；肝炎Δ病毒基元的例子由Perrotta和Been，1992，生物化学，31，16描述；RNA酶P基元的例子由Guerrier-Takada等，1983细胞35，849；Forster和Altman，1990，科学249，783；Li和Altman，1996，核酸研究24，835描述；脉孢菌属VSRNA核酶基元的例子由Collins(Saville和Collins，1990细胞，61，685-696；Saville和Collins，1991美国科学院学报88，8826-8830；Collins和Olive，1993生物化学32，2795-2799；Guo和Collins，1995，EMBO.J.14，363)描述；II组内含子的例子由Griffin等1995，Chem.Biol.2，761；Michels和Pyle，1995，生物化学34，2965描述；I组内含子的例子由Cech等，美国专利4,987,071描述。在本发明中这些特异性基元不是限制性的，本领域技术人员会认识到，在本发明的酶促核酸分子中重要的只是它要具有互补于一个或多个靶基因RNA区的特异性底物结合位点，并在底物结合位点内或者其周围具有赋予分子RNA切割活性的核苷酸序列。本发明的酶促核酸分子从真核启动子在细胞内表达[例如Gerlach等，国际PCT出版物WO91/13994；Edington和Nelson，1992，基因调节作用反义RNA和DNA生物学，编者R.P.Erickson和J.G.Izant，pp209-221，Raven出版社，NY.；Atkins等，国际PCT出版物WO94/00012；Lenee等，国际PCT出版物WO94/19476和WO9503404，Atkins等，1995，J.Gen.Virol.76，1781-1790；McElroy和Brettell，1994，TIBTECH12，62；Gruber等，1994，细胞生物化学杂志增刊18A，110(X1-406)和Feyter等，1996，Mol.Gen.Genet.250，329-338；所有这些文献本文一并参考]。由本文的教导，本领域技术人员会认识到任何核酶都能够在真核植物细胞中从适当的启动子表达。核酶表达在组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子的控制下。为了获得核酶介导的调节，将核酶RNA引入植物。虽然以下提供了构建用于本文说明的转化实验的质粒的例子，但设计许多不同类型的可以用于植物转化中的质粒完全在技术人员的知识范围内。参见Bevan，1984，核酸研究12，8711-8721(本文一并参考)。也有许多转化植物的方式。在以下例子中胚胎发生玉米培养物用氦处理。除了利用基因枪(Cornell的美国专利4,945,050和DowElanco的美国专利5,141,131)外，植物可以用以下技术转化土壤杆菌技术，参见Toledo大学的美国专利5,177,010，TexasA&M的美国专利5,104,310、欧洲专利申请0131624B1、Schilperoot的欧洲专利申请120516、159418B1和176,112、Schilperoot的美国专利5,149,645、5,469,976、5,464,763、4,940,838和4,693,976、MaxPlanck的欧洲专利申请116718、290799、320500、JapanTobacco的欧洲专利申请604662和627752、CibaGeigy的欧洲专利申请0267159和0292435和美国专利5,231,019，Calgene的美国专利5,463,174和4,762,785、和Agracetus的美国专利5,004,863和5,159,135；噬菌体颈须技术，参见Zeneca的美国专利5,302,523和5,464,765；电穿孔技术，参见BoyceThompsonInstitute的WO87/06614、Dekalb的5,472,869和5,384,253、PGS的WO9209696和WO9311335；所有这些文献本文一并参考。除用以转化植物的许多技术之外，与外源物质(典型地是包含RNA或DNA的质粒)接触的组织的类型也可以变化。这样的组织包括但不限于胚胎发生组织、愈伤组织I型和II型以及对转化和尔后再生转基因植物可接受的任何组织。另一个可变因素是选择选择性标记。优选的特殊标记是专业人员可以判断的，但是任何以下的选择性标记都可以与本文未列出的可以作为选择性标记起作用的任何其它基因一同被使用。这样的选择性标记包括但不限于chlorosulfuron、潮霉素、PAT和/或bar、溴草腈、卡那霉素等。bar基因可以从链霉菌属分离，特别是从吸水链霉菌或绿色产色链霉菌种分离。bar基因编码phosphinothricin乙酰转移酶(PAT)，该酶灭活除草剂bialaphosphosphinothricin(PPT)中的活性成分。这样，许多技术的组合可以用于采用核酶介导的调节。核酶可以作为单体个别地被表达，即，针对一个位点的一种核酶作为一种转录物被表达。此外，针对一个以上靶位点的两种或多种核酶作为单一RNA转录物的一部分被表达。包含针对一个以上切割位点的一种以上的核酶的单一RNA转录物容易产生以获得基因表达的有效调节。在这些多体构建体内的核酶是相同的或不同的。例如，多体构建体可以包含许多锤头核酶或发夹核酶或其它核酶基元。此外，多体构建体可以设计成包含许多不同的核酶基元，例如锤头和发夹核酶。更具体地说，设计这样的多体核酶构建体，其中一系列核酶基元在单一RNA转录物中串联在一起。核酶靠核苷酸接头序列相互连接，其中所说的接头序列可以也可以不互补于靶RNA。多体核酶构建体(多核酶)很可能改善核酶介导的基因表达调节的有效性。核酶的活性也可以由于第二核酶将它们从初级转录物释而得到增强(Draper等，PCTWO93/23569，和Sullivan等，PCTWO94/02595，两者以其整体被本文一并参考；Ohkawa，J.等，1992，NucleicAcidsSymp.Ser.，27，15-6；Taira.K.等，1991，核酸研究，19，5125-30；Ventura，M.等，1993，核酸研究，21，3249-55；Chowrira等，1994生物化学杂志.269，25856)。核酶介导的基因表达的调节能够在多种植物(包括被子植物、裸子植物、单子叶植物以及双子叶植物)中实施。兴趣植物包括但不限于谷类，如水稻、小麦、大麦、玉米；产油农作物，如大豆、canola、向日葵、棉花、玉米、可可、红花、油棕榈、椰子棕榈、亚麻、蓖麻、花生；植物园农作物，如咖啡和茶；水果，如凤梨、番瓜、芒果、香蕉、葡萄、桔子、苹果；蔬菜，如花椰菜、甘蓝、瓜、绿胡椒、番茄、胡萝卜、莴苣、芹菜、土豆、椰菜；豆科植物，如大豆、菜豆、豌豆；鲜花，如康乃馨、菊花、雏菊、郁金香、丝石竹、alstromeria、金盏花、矮牵牛属、玫瑰；树，如橄榄、软木树、杨树、松树；坚果，如胡桃、阿月浑子树果等。以下是描述在基因表达的调节中核酶的一般用途的一些非限制例子。核酶介导的在咖啡因合成中所涉及的基因表达的下调节能够用来在咖啡豆中明显改变咖啡因浓度。基因(如咖啡植物中的7-甲基黄嘌呤核苷和/或3-甲基转移酶)表达能够用核酶容易地调节，以减少咖啡因合成(Adams和Zarowitz，美国专利5,334,529；本文一并参考)。表达针对在尼古丁产生中涉及的基因(如N-甲基腐胺氧化酶或腐胺N-甲基转移酶基因(Shewmaker等，同上))的核酶的转基因烟草植物，将产生具有改变的尼古丁浓度的叶片。表达针对水果成熟中涉及的基因的核酶的转基因植物将延迟水果(如番茄和苹果)的成熟，所述基因如乙烯形成酶、果胶甲基转移酶、果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、1-氨基环丙烷羧酸(ACC)合酶、ACC氧化酶基因(Smith等，1988，自然，334，724；Gray等，1992，Pl.Mol.Biol.，19，69；Tieman等，1992，植物细胞，4，667；Picton等，1993，植物杂志3，469；Shewmaker等.同上；James等，1996，生物技术，14，56)。表达针对鲜花色素沉着中涉及的基因的核酶的转基因植物将产生具有改变的颜色的鲜花(如玫瑰、矮牵牛)，所说基因如查耳酮合酶(CHS)、查耳酮黄烷酮异构酶(CHI)、苯丙氨酸氨裂合酶、或脱氢黄酮醇(DF)羟化酶、DF还原酶基因(Krolvander等，1988，自然，333，866；Krolvander等，1990，Pl.Mol.Biol.14，457；Shewmaker等，同上；Jorgensen，1996，科学，268，686)。木素是对于在植物中保持细胞壁的机械强度必需的有机化合物。虽然是必需的，但木素有一些缺点。它们使青贮饲料作物难消化，并且对从木浆和其他物质生产纸而言是不受欢迎的。表达针对木素产生中涉及的基因的核酶的转基因植物将具有改变的木素水平，所说基因如O-甲基转移酶、肉桂酰辅酶ANADPH还原酶或肉桂酰乙醇脱氢酶(Doorsselaere等，1995，植物杂志，8，855；Atanassova等，1995，植物杂志，8，465；Shewmaker等，同上；Dwivedi等，1994，Pl.Mol.Biol.26，61)。在以下文献中公开了有用的核酶的其他有用的靶Draper等，国际PCT出版物WO93/23569，Sullivan等，国际PCT出版物WO94/02595，以及Stinchcomb等，国际PCT出版物WO95/31541，这些文献以其整体一并被本文参考。在植物中的颗粒结合淀粉合酶基因表达的调节在植物中，淀粉生物合成在叶绿体(短期淀粉存储)和淀粉体(长期淀粉存储)中发生。淀粉颗粒通常由直链α(1-4)连接的α-D-葡萄糖单位(直链淀粉)和支链形式的由α(1-6)键交联的直链淀粉(支链淀粉)组成。在植物中的淀粉合成中涉及的酶是淀粉合酶，该酶利用ADP-葡萄糖产生线性链的α(1-4)-葡萄糖。在植物中发现两种主要形式的淀粉合酶颗粒结合淀粉合酶(GBSS)和一种位于叶绿体基质中的和淀粉形成体中的一种可溶形式(可溶性淀粉合酶)。两种形式的这种酶利用ADP-D-葡萄糖，而颗粒结合形式也利用UDP-D-葡萄糖，前者优先。称作蜡质蛋白质的GBSS在各种已确定特征的植物中具有在55到约70kDa的分子量。在几种植物品种中影响GBSS基因的突变曾导致直链淀粉损失，而淀粉的总量保持相对不变。除GBSS活性的损失之外，这些突变种也含有改变的、降低的水平的、或没有GBSS蛋白质(MacDonald和Preiss，植物生理学，78849-852(1985)，Sano，Theor.Appl.Genet.68467-473(1984)，Hovenkamp-Hermelink等Theor.Appl.Genet.75217-22191987)，Shure等，细胞35，225-233(1983)，Echt和Schwartz，遗传学，99275-284(1981))。在GBSS突变体植物和野生型植物两者中支链酶以及可溶性ADP-葡萄糖淀粉糖基转移酶的存在表明存在形成支链聚合物支链淀粉和直链聚合物直链淀粉的彼此独立的途径。Wx(蜡质)基因座编码淀粉生物合成中涉及的颗粒结合葡糖基转移酶。这种酶的表达在玉米中被限制在胚乳、花粉以及胚囊中。由于突变谷粒的外观(谷粒中直链淀粉组成降低所致的表型)，在这一基因座中的突变被称为蜡质。在玉米中，这种酶被转运至发育的胚乳的淀粉体之中，在那里它催化直链淀粉的产生。玉米粒约70％是淀粉，其中27％是线性直链淀粉，73％是支链淀粉。蜡质是在编码颗粒结合淀粉合酶(GBSS)基因中的一种隐性突变。这种隐性突变的纯合植物产生含有100％支链淀粉形式的淀粉。具有催化活性和增加的位点特异性(如下所述)的核酶是比反义寡核苷酸更有效的、也许更特异性的抑制分子。此外，这些核酶能够抑制GBSS活性，并且核酶的催化活性对抑制作用是必需的。对本领域技术人员而言，从实施例可以明显看出，可以设计在玉米以外的植物品种中切割GBSS活性所需的靶mRNA的其他核酶。这样，在一个优选的实施方案中，本发明的特征是抑制直链淀粉产生(例如通过降低GBSS活性)中所涉及的核酶。这些内源表达的RNA分子包含底物结合区，它结合靶mRNA的可及区。该RNA分子也含有催化RNA切割的区。所说的RNA分子优选地是锤头或发夹基元的核酶。一旦结合，核酶就切割靶mRNA，阻止翻译与蛋白质积累。在缺少靶基因表达的情况下，直链淀粉产生被降低或被抑制。后面提供了具体的实施例。优选的实施方案包括具有互补于表IIIA、VA和VB中的结合序列的结合臂的核酶。这样的核酶的例子在表IIIB-V中显示。本领域技术人员会认识到，虽然这种例子是针对一种植物(例如玉米)的mRNA设计的，但是可以制备互补于其它植物品种的mRNA的类似核酶。这样互补意指结合臂使核酶能够以序列特异性方式与靶RNA相互作用，从而导致植物mRNA靶的切割。这样的核酶的例子基本上由表III-V中所显示的序列组成。优选的实施方案是核酶和将它们用于在植物中抑制淀粉颗粒结合ADP(尿苷二磷酸)-葡萄糖α-1，4-D-葡聚糖4-α-葡糖基转移酶(即颗粒结合淀粉合酶(GBSS))活性的方法。这是通过用核酶抑制基因表达完成的，这种抑制导致在植物中降低或除去GBSS活性。在本发明的另一个方面，切割靶分子并且抑制直链淀粉产生的核酶从插入到植物基因组中的转录单位表达。优选地，能够稳定整合进植物基因组和选择表达核酶的转化植物系的重组载体在植物细胞中由组成型或诱导型启动子表达。一旦被表达，核酶就切割它们的靶mRNA，并且使它们的宿主细胞减少产生直链淀粉。在植物细胞中所表达的核酶在组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子控制下。玉米淀粉的修饰是核酶技术的重要应用，它能够减少特异性基因表达。高水平的支链淀粉对玉米湿磨工艺是合乎需要的，也有高支链淀粉玉米导致增加的可消化性从而增加食物的能量可利用度的某些证据。约10％的湿磨淀粉具有蜡质表型，但是由于其隐性性质，传统的蜡质品种很难由栽培者处理。用于切割GBSSmRNA并由此降低植物特别是玉米胚乳中GBSS活性的核酶将表现为显性特性，并产生具有较易于为栽培者处理的蜡质表型的玉米植物。植物中脂肪酸饱和分布的修饰植物组织中脂肪酸的生物合成起始于叶绿体。脂肪酸由脂肪酸合酶复合物(FAS)作为酰基载体蛋白质(ACP)的硫酯被合成。链长为16个碳原子的脂肪酸遵循以下三种途径之一1)它们紧接在合成之后被释放，并通过叶绿体酰基转移酶转变成甘油3-磷酸(G3P)，供在叶绿体内进一步修饰；2)从质体输出后，它们被释放并被硫酯酶转变成辅酶A(CoA)；或3)它们进一步延长至C18链长。C18链由硬脂酰-ACP去饱和酶在C9位迅速脱饱和，接着油酸(18∶1)基在叶绿体内立即被转变成G3P，或从叶绿体输出并由硫酯酶转变成油酰辅酶A(Somerville和Browse，1991，科学，25280-87)。C16脂肪酸的大多数遵循第三途径。在玉米种子油中，有优势的甘油三酯在内质网中产生。大多数油酸(18∶1)和一些棕榈酸(16∶0)从磷脂酸转变成G3P，然后转变成二酰基甘油酯和磷脂酰胆碱。由膜结合去饱和酶产生的磷脂酰胆碱上的酰基链的进一步去饱和作用发生在内质网中。然后在甘油三酯的产生中，二和三不饱和的链被释放到酰基辅酶A集合中，并转移到二酰基甘油中的甘油骨架上的C3位(Frentzen，1993植物中的脂质代谢，p.195-230，(编者Moore，T.S.)CRC出版社，BocaRaton，FA.)。植物脂肪酸的生物合成途径的示意图在图11和12中显示。在玉米种子油中有优势的三种脂肪酸是亚油酸(18∶2，约59％)、油酸(18∶1，约26％)以及棕榈酸(16∶0，约11％)。这些是平均值，依据基因型的不同可以有些不同。然而，过去十年所分析的USCornBelt生产的油的混合样品一直具有这种组成(Glover和Mertz，1987谷粒的营养质量遗传和农艺学改良，p183-336，(编者Olson，R.A.和FreyK.J.)，美国农艺学会公司，Madison，WI.；Fitch-Haumann，1985美国油料化学会杂志621524-1531；Strecker等，1990，可食用的脂肪和油加工基本原理和现代实践(编者Erickson，D.R.)，美国油料化学家学会，Champaign，II)。C18链长的这种优势可以反映几种关键酶的丰度和活性，如负责C18碳链产生的脂肪酸合酶、负责18∶1产生的硬脂酰-ACP去饱和酶(Δ9去饱和酶)和负责18∶1转变成18∶2的微粒体Δ-12去饱和酶。植物的Δ9去饱和酶(也称为硬脂酰-ACP去饱和酶)是一种可溶性叶绿体酶，它以与酰基载体蛋白(ACP)连接的C18(偶尔也采用C16)-酰基链为底物(McKeon，T.A.和Stumpf，P.K.，1982生物化学杂志25712141-12147)。这与哺乳动物、低等真核以及蓝细菌Δ9去饱和酶相反。大鼠和酵母Δ9去饱和酶是膜结合微粒体酶，它以酰基辅酶A链为底物，而蓝细菌Δ9去饱和酶以二酰基甘油上的酰基链为底物。迄今已分离了几种来源于双子叶植物的Δ9去饱和酶cDNA克隆并确定了特征(Shanklin和Somerville，1991美国科学院学报882510-2514；Knutzon等，1991植物生理学96344-345；Sato等，1992植物生理学99362-363；Shanklin等，1991植物生理学97467-468；Slocombe等，1992植物分子生物学20151-155；Taylor等，1992植物生理学100533-534；Thompson等，1991美国科学院学报882578-2582)。不同植物的Δ9去饱和酶序列的比较显示它是一种高度保守的酶。在氨基酸水平(约90％)和在核苷酸水平(约80％)两者上具有高水平的等同性。然而，如从其不同的物理和酶学特征可以预料的，在植物和其他Δ9去饱和酶之间不存在序列类似性(Shanklin和Somerville，同上)。蓖麻子去饱和酶(和其他酶)的纯化和特征鉴定表明Δ9去饱和酶作为同源双体是有活性的、亚单位分子量约为41kDa。对其体外活性，该酶需要分子氧、NADPH、NADPH铁氧还蛋白氧化还原酶以及铁氧还蛋白。Fox等，1993(美国科学院学报，902486-2490)显示在大肠杆菌中表达的蓖麻子酶每个同源双体包含四个催化活性亚铁原子。氧化的酶包含两个相同的二铁簇，在连二亚硫酸盐存在下它们被还原为二亚铁状态。在硬脂酰辅酶A和氧的存在下，该簇又回到二铁状态。这说明该去饱和酶属于含有二铁-氧簇的氧激活蛋白质组。这一组的其他成员是核糖核苷酸还原酶和甲烷单加氧酶羟化酶。这些催化上有差异的蛋白质的预期一级结构的比较显示它们都含有被约80-100个氨基酸分开的保守的氨基酸序列(Asp/Glu)-Glu-Xaa-Arg-His对。传统植物培育方式显示可以获得对植物没有毒害作用的提高的硬脂酸水平。在红花中(Ladd和Knowles，1970农作物科学，10525-527)和在大豆中(Hammond和Fehr，1984美国油料化学学会杂志611713-1716；Graef等，1985农作物科学251076-1079)硬脂酸水平已明显地增加。这说明在种子油的脂肪酸组成上的可变性。通过用酵母(Polashock等，1992植物生理学100，894)或大鼠(Grayburn等，1992生物技术，10，675)的Δ9去饱和酶基因转化烟草已获得Δ9去饱和酶活性的增加。两组转基因植物在脂肪酸组成上都有明显的改变，然而表型上与对照植物相同。玉米很少用于产生人造黄油产品，因为在传统上它不被用作油料作物，并且与大豆和canola比较具有较低的种子油含量。然而，玉米油具有低水平的亚麻酸(18∶3)和较高水平的棕榈酸(16∶0)(在人造黄油中是合乎需要的)。申请人相信通过下调Δ9去饱和酶活性降低油酸和亚油酸水平将使玉米在饱和油市场有效地替换大豆和canola。人造黄油和糖食脂肪由植物(如大豆)油的化学氢化产生。这一过程增加了生产人造黄油的成本，并且也造成脂肪酸的顺式和反式异构体两者。反式异构体在植物产生的油中不是天然存在的，它增加潜在的健康危害上的担心。申请人相信一种消除对化学氢化的需要的方法是对植物进行遗传工程操作，以下调去饱和酶。Δ9去饱和酶将第一双键引入到18碳脂肪酸中，并且是实现脂肪酸脱饱和程度的关键性步骤。这样，在一个优选的实施方案中，本发明涉及在植物中改变脂肪酸组成的组合物(及其使用方法)。这是通过用核酶、反义核酸、共抑制或三螺旋DNA抑制基因表达导致在植物中降低或消除某些酶(例如Δ9去饱和酶)的活性而完成的。这种活性在单子叶植物(如玉米、小麦、水稻、棕榈、椰子等)中降低。Δ9去饱和酶活性也可以在双子叶植物(如向日葵、红花、棉花、花生、橄榄、芝麻、萼距花属、亚麻、希蒙得木属、葡萄等)中降低。这样，在一方面，本发明的特征是抑制脂肪酸脱饱和(例如通过降低Δ9去饱和酶活性)中所涉及的核酶。这些内源表达的RNA分子包含底物结合区，该结合区结合靶mRNA的可及区。该RNA分子也含有催化RNA切割的区。所说的RNA分子优选地是锤头或发夹基元的核酶。一旦结合，核酶就切割靶mRNA，阻止翻译与蛋白质积累。在缺少靶基因表达的情况下，硬脂酸水平增加，不饱和脂肪酸的产生被降低或被抑制。特定的例子在以下所列的表中给出。在优选的实施方案中，核酶具有互补于表VI和VIII中的序列的结合臂。本领域技术人员会认识到，虽然这种例子是针对一种植物(例如玉米)的mRNA设计的，但是可以制备互补于其它植物的mRNA的类似核酶。这样，互补意指结合臂使核酶能够以序列特异性方式与靶RNA相互作用，从而导致植物mRNA靶的切割。这样的核酶的例子典型地是表VII和表V中限定的序列。活性核酶典型地包含等同于例子中的那些酶促中心以及能够结合植物mRNA(以便切割在靶位点上发生)的结合臂。不干扰这样的结合和/或切割的其它序列可以存在。在这一研究中特别有用的核酶序列在表VII和VIII中显示。本领域技术人员会认识到，在所述表中所列的核酶序列仅仅是许多这类序列的代表，其中核酶的酶促部分(除结合臂外的所有部分)被改变(以影响活性)。例如列于表IV中的锤头核酶的茎环II序列(5’-GGCGAAAGCC-3’)可被改变(取代、缺失和/或插入)，以含有任何序列，优选地是只要最小的两个碱基配对的茎结构可以形成。类似地，列于表V和VIII中的发夹核酶的茎环IV序列(5’-CACGUUGUG-3’)可被改变(取代、缺失和/或插入)，以含有任何序列，优选地只要最小的两个碱基配对的茎结构可以形成。这些核酶等价于在所述表中具体描述的核酶。在本发明的另一方面，在植物中切割靶分子并且减少不饱和脂肪酸含量的核酶从插入到植物基因组中的转录单位表达。优选地，能够稳定整合进植物基因组和选择表达核酶的转化植物系的重组载体在植物细胞中由组成型或诱导型启动子表达。一旦被表达，核酶就切割它们的靶mRNA，并且使它们的宿主细胞减少产生不饱和脂肪酸。在植物细胞中表达的核酶在组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子控制下。脂肪酸组成的改变是能够降低特异性基因表达的基于核酸的技术的重要应用。在产生商业上重要的油的植物中高水平的饱和脂肪酸是合乎需要的。在一个有关的方面，本发明的特征是分离玉米中编码Δ9去饱和酶的cDNA序列的方法。在优选的实施方案中，也描述了切割Δ9去饱和酶mRNA的发夹和锤头核酶。从以下描述的例子本领域技术人员会理解到，现在易于设计切割Δ9去饱和酶活性所需的靶mRNA的其他核酶，这些核酶在本发明的范围内。虽然提供了玉米RNA的具体例子，但是，本领域技术人员会认识到这些教导不限于玉米。此外，相同的靶可以用于其他植物品种中。适于导向特定植物RNA序列的互补臂可以用于针对那种特定RNA的核酶中。本文的实施例和说明无意限制本发明，并且本领域的技术人员应该认识到可以在多种不同的植物上很容易产生相似的实施方案，以便使用本文的描述调节各种不同植物基因的表达，并且这些内容在本发明的范围内。本文的实施例遵循了标准分子生物学技术。其它的信息见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989)，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港冷泉港实验室出版社，其内容本文一并参考。实施例实施例1玉米的Δ9去饱和酶cDNA的分离针对两个与植物Δ9去饱和酶的二铁-氧基团的结合有关的保守肽设计并合成简并PCR引物。由玉米胚cDNAPCR扩增一个276bpDNA片段，并将其克隆到载体中。此片段推测的氨基酸序列与由双子叶植物Δ9去饱和酶蛋白的两个保守肽分离的区的序列相似。这一片段用来筛选玉米胚cDNA文库。总共分离了16个克隆。进一步的限制图谱测定和杂交鉴定了一个克隆，对这个克隆进行了测序。cDNA插入片段的特性为1621ntcDNA、145nt5′和294nt3′非翻译区(包含18nt聚A尾)；编码44.7kD多肽的394氨基酸开放读框；与编码推断的成熟蛋白质的蓖麻子Δ-9去饱和酶基因具有85％氨基酸等同性。图10列出了其全部序列。实施例2鉴定Δ9去饱和酶的潜在核酶切割位点在玉米Δ9去饱和酶mRNA中鉴定了大约250个HH核酶位点和大约43个HP位点。HH位点由尿苷和任何核苷酸(鸟苷(UH)除外)组成。表VI和VIII列出了HH和HP核酶切割位点。编号系统在具有图10所示序列的Δ-9去饱和酶cDNA克隆的5′端由1开始。可以很容易地设计和合成核酶(如表VII和VIII中所列出的那些)，以针对以5-100或更多个碱基作为底物结合臂的切割位点(参见图1-5)。在核酶中这些底物结合臂使得核酶可以与它们的靶以序列特异性方式相互作用。实施例3Δ9去饱和酶核酶切割位点的选择使用算法(如M.Zuker(Zuker.M.，1989科学，244，48-52))通过计算机分析评定Δ9去饱和酶mRNA的二级结构。鉴定了不形成带有8个以上核苷酸的RNA/RNA茎区的二级折叠结构并含有潜在的锤头核酶切割位点的mRNA区。通过RNA酶H测定分析了这些位点的寡核苷酸可及性(参见下面的实施例4)。实施例4Δ9去饱和酶的RNA酶H测定把49个DNA寡核苷酸(每个长21个核苷酸)用于RNA酶H测定中。这些寡核苷酸覆盖了Δ9去饱和酶RNA内的108个位点。利用全长的Δ9去饱和酶cDNA转录物进行RNA酶H测定(图6)。通过上文的Draper一般描述的方法筛选RNA的可及切割位点。简言之，合成了代表核酶切割位点的DNA寡核苷酸。使用聚合酶链反应产生用于从玉米cDNA克隆中产生T7RNA聚合酶转录的底物。在体外由这些模板合成标记的RNA转录物。将寡核苷酸和标记的转录物退火，加入RNA酶H，并将混合物在37℃下温育10分钟。终止反应并且在测序聚丙烯酰胺凝胶上分离RNA。通过放射自显影定量方法使用MolecularDynamics磷光体成像系统测定切割的底物的百分含量(图13和图14)。实施例5用于Δ9去饱和酶的锤头和发夹核酶设计锤头(HH)和发夹(HP)核酶，使之针对在RNA酶H测定中被最充分切割的寡核苷酸所覆盖的位点，然后通过计算机折叠算法分析这些核酶，并且淘汰具有明显二级结构的核酶。通过化学方法合成了核酶。以前曾有人描述了RNA合成的一般过程(Usman等，1987，美国化学协会杂志，109，7845-7854和Scaringe等，1990，核酸研究，18，5433-5341；Wincott等1995，核酸研究，23，2677)，在394型合成仪(应用生物系统公司)上使用改进的2.5μmol规模方案(具有5分钟的用于甲硅烷基保护的核苷酸的偶合步骤和2分钟的用于2′-O-甲基化核苷酸的偶合步骤)进行了小规模的合成。表II概述了用于合成循环的试剂的数量和接触时间。在每一个偶合循环中使用了相对于结合多聚体的5′羟基6.5倍过量(0.1M，163μl＝16.3μmol)的磷酰胺和24倍过量(0.25M，238μl＝59.5μmol)的S-乙基四唑。通过三苯甲基组分比色定量分析方法测定，394型合成仪上的平均偶联产率为97.5-99％。其它的用于394的寡核苷酸合成试剂脱三苯甲基溶液是溶解在二氯甲烷(ABI)中的2％三氯乙酸；使用溶解在THF(ABI)中的16％N-甲基咪唑和溶解在THF(ABI)中的10％醋酸酐/10％2，6-卢剔啶封端；氧化溶液是溶解在THF(Millipore)中的16.9mMI2、49mM吡啶、9％水。直接使用试剂瓶中B和J合成级乙腈。使用从美国国际化学药品公司得到的固体药品配制S-乙基四唑溶液(0.25M乙腈溶液)。按照如下的方法进行RNA的脱保护。把结合多聚体的寡核糖核苷酸(无三苯甲基)从合成柱转移到4mL的螺旋塞玻璃瓶中，并在65℃下于甲胺(MA)溶液中悬浮10分钟。冷却至-20℃后，从多聚体载体中除去上清液。把载体用1.0mlEtOH∶MeCN∶H2O/3∶1∶1洗涤三次，涡旋搅拌后再把上清液加到第一份上清液中。把含有寡核糖核苷酸的结合上清液干燥成白色粉末。把碱基脱保护的寡核糖核苷酸重新悬浮在无水的TEA·HF/NMP溶液(250μl的1.5mLN-甲基吡咯烷酮溶液、750μl的TEA和1.0mLTEA·3HF(提供1.4MHF浓度))中，并且加热到65℃保持1.5小时。在阴离子交换脱盐之前用50mMTEAB(9ml)处理生成的全部脱保护的寡聚物。在脱保护寡聚物的阴离子交换脱盐中，将TEAB溶液装载到预先用50mMTEAB(10ml)洗涤的Qiagen500阴离子交换柱体(Qiagen公司)上。在用50mMTEAB(10ml)洗涤装载的柱体后，用2MTEAB(10ml)洗脱RNA，并将其干燥成白色粉末。通过用U取代G5和U取代A14(编号源于Hertel，K.J.等(1992，核酸研究20，3252))合成无活性的锤头核酶。如上述对锤头RNA描述的方法合成发夹核酶。利用噬菌体T7RNA聚合酶由DNA模板也合成了核酶(Milligan和Uhlenbeck，1989，酶学方法180，51)。使用普通的方法通过凝胶电泳纯化核酶或者通过高压液相层析法(HPLC；参见上文的Wincott等，1996，其全文本文一并参考)纯化核酶，并且将核酶重新悬浮在水中。在下面的表VII和VIII中显示了用于此研究的化学方法合成的核酶的序列。实施例6Δ9去饱和酶核酶的长底物测试用于本研究的靶RNA长1621nt，并且含有针对Δ9去饱和酶RNA的所有HH和HP核酶的切割位点。含有Δ9去饱和酶靶序列的T7RNA聚合酶启动子上游的模板由cDNA克隆通过PCR扩增。使用T7RNA聚合酶从此PCR扩增模板转录靶RNA。在转录过程中通过加入[α-32P]CTP作为4种三磷酸核糖核苷酸之一将转录物进行内部标记。在37℃下转录2小时后，用DNA酶-I处理转录混合物以便消化用于转录的DNA模板。把转录混合物在变性聚丙烯酰胺凝胶中分离。在凝胶片中分离出对应于全长RNA的带，并且用异丙醇沉淀出RNA，把沉淀物储存在4℃。在核酶过量(kcat/KM)的条件下进行核酶切割反应(Herschlag和Cech，1990，生物化学29，10159-10171)。简言之，在50mMTris-HCl(pH7.5)和10mMMgCl2存在下，通过加热至65℃并保持2分钟分别将1mM核酶和＜10nM的内部标记的靶RNA变性。通过冷却到反应温度(37℃、26℃或20℃)10-20分钟将RNA复性。在合适的反应温度下通过把核酶与靶RNA混合开始切割反应。在一定的时间间隔内取出等分试样，并且通过加入等体积的停止缓冲液使反应停止。将样品在4％的测序凝胶上分离。表IX、图15和16中总结了在26℃或20℃下的核酶切割反应结果。在所有测试的核酶中，7个锤头和2个发夹表现出Δ9去饱和酶RNA的明显切割(图15和16)。核酶对其它位点表现出变化的活性水平。实施例7用Δ9去饱和酶的多核酶组合切割靶RNA把上述的几种核酶结合成一个含有两个或更多的嵌入到邻接的互补RNA区段中的核酶的多聚体核酶构建体。图17、18、19和23显示了多聚体核酶的非限制性例子。通过将互补寡核苷酸退火并克隆到含有花椰菜花叶病毒35S增强启动子(Franck等，1985细胞21，285)、玉米Adh1内含子(Dennis等，1984，核酸研究12，3983)、Nos多腺苷酸化信号(DePicker等，1982分子应用遗传学杂志1，561)的表达载体中而产生所说的核酶。在图20和21中显示了用从这些含有多聚体的转录单元得到的T7转录物进行的切割分析。实施例8表达核酶的Δ9去饱和酶转录单元的构建用来切割Δ9去饱和酶mRNA的核酶在植物体中内源表达。或者由插入到植物基因组上的基因来表达(稳定转化)，或者由属于质粒载体或病毒序列一部分的游离基因转录单元表达(瞬时表达)。这些核酶可以通过RNA聚合酶I、II或III、植物或植物病毒启动子(如CaMV)表达。启动子或者是组成型的、组织特异性的，或者是发育过程中表达的。Δ9259单体核酶构建体(RPA114,115)这些是Δ9去饱和酶259单体锤头核酶克隆。设计这些核酶，使之具有3bp长的茎干II区和20bp(全部)长的针对位点259的底物结合臂。活性形式是RPA114，无活性的形式是RPA115。用NotI消化亲本质粒pDAB367，并用Klenow补平以便产生平端受体位点。然后用HindIII限制酶消化此载体。用EcoRI切割含有核酶的质粒，用Klenow补平此质粒并且用HindIII重新切割。用凝胶纯化含有整个核酶转录单元的插入片段，并且将它连接到pDAB367载体中。通过用SgfI/HindIII和XbaI/SstI消化来检查此构建体，并且通过测序加以确认。Δ9453多聚体核酶构建体(RPA118,119)这些是Δ9去饱和酶453多聚体锤头核酶克隆(参见图17)。设计这些核酶，使之具有3bp长的茎干II区。多聚体构建体的底物结合臂的全长是42bp。活性形式是RPA118，无活性的形式是RPA119。按照上述259单体的方法产生构建体。设计了多聚体构建体，使之具有针对Δ9去饱和酶RNA中的位点453、464、475、484的4个锤头核酶。Δ9252多聚体核酶构建体(RPA85,113)这些是位于bar(phosphoinothricin乙酰转移酶，Thompson等，1987EMBOJ.62519-2523)开放读框的3′端的Δ9去饱和酶252多聚体核酶克隆。设计这些多聚体构建体，使之具有3bp长的茎干II区。多聚体构建体的底物结合臂的全长是91bp。活性核酶是RPA85，RPA113是无活性的。按照如下的方法构建载体用BglII部分地消化亲本质粒pDAB367，并用凝胶纯化单切割质粒。用EcoRI重新切割此质粒，并且重新用凝胶纯化以分离出正确的BglII/EcoRI切割片段。从核酶构建体中用凝胶分离出BamHI/EcoRI插入片段(含有核酶和NOS多聚A区)，并且连接到367载体中。通过NcoI/SstI消化和测序鉴定阳性质粒。通过标准的测定能够鉴定出有用的转基因植物。可以通过下面的实施例中讨论的方法来评价转基因植物Δ9去饱和酶表达和Δ9去饱和酶活性的减少。实施例9GBSSRNA中潜在的核酶切割位点的鉴定鉴定了在玉米GBSSmRNA多肽编码区中的241个锤头核酶位点(参见表IIIA)。一个锤头核酶位点由尿苷与任何核苷酸(鸟嘌呤(UH)除外)组成。以下是玉米的GBSS编码区的序列(SEQ.I.D.No25)。编号系统开始于具有以下序列(5′-3′)的GBSScDNA克隆的5′端的1位GACCGATCGATCGCCACAGCCAACACCACCCGCCGAGGCGACGCGACAGCCGCCAGGAGGAAGGAATAAACT73144CACTGCCAGCCAGTGAAGGGGGAGAAGTGTACTGCTCCGTCCACCAGTGCGCGCACCGCCCGGCAGGGCTGC145216TCATCTCGTCGACGACCAGTGGATTAATCGGCATGGCGGCTCTAGCCACGTCGCAGCTCGTCGCAACGCGCG217288CCGGCCTGGGCGTCCCGGACGCGTCCACGTTCCGCCGCGGCGCCGCGCAGGGCCTGAGGGGGGGCCGGACGG289360CGTCGGCGGCGGACACGCTCAGCATTCGGACCAGCGCGCGCGCGGCGCCCAGGCTCCAGCACCAGCAGCAGC361432AGCAGGCGCGCCGCGGGGCCAGGTTCCCGTCGCTCGTCGTGTGCGCCAGCGCCGGCATGAACGTCGTCTTCG433504TCGGCGCCGAGATGGCGCCGTGGAGCAAGACCGGCGGCCTCGGCGACGTCCTCGGCGGCCTGCCGCCGGCCA505576TGGCCGCGAATGGGCACCGTGTCATGGTCGTCTCTCCCCGCTACGACCAGTACAAGGACGCCTGGGACACCA577648GCGTCGTGTCCGAGATCAAGATGGGAGACAGGTACGAGACGGTCAGGTTCTTCCACTGCTACAAGCGCGGAG649720TGGACCGCGTGTTCGTTGACCACCCACTGTTCCTGGAGAGGGTTTGGGGAAAGACCGAGGAGAAGATCTACG721792GGCCTGACGCTGGAACGGACTACAGGGACAACCAGCTGCGGTTCAGCCTGCTATGCCAGGCAGCACTTGAAG793864CTCCAAGGATCCTGAGCCTCAACAACAACCCATACTTCTCCGGACCATACGGGGAGGACGTCGTGTTCGTCT865936GCAACGACTGGCACACCGGCCCTCTCTCGTGCTACCTCAAGAGCAACTACCAGTCCCACGGCATCTACAGGG9371008ACGCAAAGACCGCTTTCTGCATCCACAACATCTCCTACCAGGGCCGGTTCGCCTTCTCCGACTACCCGGAGC10091080TGAACCTCCCGGAGAGATTCAAGTCGTCCTTCGATTTCATCGACGGCTACGAGAAGCCCGTGGAAGGCCGGA10811152AGATCAACTGGATGAAGGCCGGGATCCTCGAGGCCGACAGGGTCCTCACCGTCAGCCCCTACTACGCCGAGG11531224AGCTCATCTCCGGCATCGCCAGGGGCTGCGAGCTCGACAACATCATGCGCCTCACCGGCATCACCGGCATCG12251296TCAACGGCATGGACGTCAGCGAGTGGGACCCCAGCAGGGACAAGTACATCGCCGTGAAGTACGACGTGTCGA12971368CGGCCGTGGAGGCCAAGGCGCTGAACAAGGAGGCGCTGCAGGCGGAGGTCGGGCTCCCGGTGGACCGGAACA13691440TCCCGCTGGTGGCGTTCATCGGCAGGCTGGAAGAGCAGAAGGGACCCGACGTCATGGCGGCCGCCATCCCGC14411512AGCTCATGGAGATGGTGGAGGACGTGCAGATCGTTCTGCTGGGCACGGGCAAGAAGAAGTTCGAGCGCATGC15131584TCATGAGCGCCGAGGAGAAGTTCCCAGGCAAGGTGCGCGCCGTGGTCAAGTTCAACGCGGCGCTGGCGCACC15851656ACATCATGGCCGGCGCCGACGTGCTCGCCGTCACCAGCCGCTTCGAGCCCTGCGGCCTCATCCAGCTGCAGG16571728GGATGCGATACGGAACGCCCTGCGCCTGCGCGTCCACCGGTGGACTCGTCGACACCATCATCGAAGGCAAGA17291800CCGGGTTCCACATGGGCCGCCTCAGCGTCGACTGCAACGTCGTGGAGCCGGCGGACGTCAAGAAGGTGGCCA18011872CCACCTTGCAGCGCGCCATCAAGGTGGTCGGCACGCCGGCGTACGAGGAGATGGTGAGGAACTGCATGATCC18731944AGGATCTCTCCTGGAAGGGCCCTGCCAAGAACTGGGAGAACGTGCTGCTCAGCCTCGGGGTCGCCGGCGGCG19452016AGCCAGGGGTCGAAGGGGAGGAGATCGCGCCGCTCGCCAAGGAGAACGTGGCCGCGCCCTGAAGAGTTCGGC20172088CTGCAGGCCGCCTGATCTCGCGGGTGGTGCAAACATGTTGGGACATCTTCTTATATATGCTGTTTCGTTTAT20892160GTGATATGGACAAGTATGTGTAGCTGCTTGCTTGTGCTAGTGTAATATAGTGTAGTGGTGGCCAGTGGCACA21612232ACCTAATAAGCGCATGAACTAATTGCTTGCGTGTGTAGTTAAGTACCGATCGGTAATTTTATATTGCGAGTA2233AATAAATGGACCTGTAGTGGTGGAAAAAAAAAAAA(SEQI.D.NO.25).在GBSSmRNA中大约有53个潜在的发夹核酶位点。在表V中列出了核酶和靶序列。按照以上所述，针对这些位点很容易设计和合成核酶，以5至100个或者更多碱基作为底物结合臂(参见图1-5)。实施例10GBSS核酶切割位点的选择通过计算机分析利用折叠算法(如M.Zuker发展的算法(Zuker，M.，1989科学，244，48-52)评估了GBSSmRNA的二级结构。鉴定了不形成具有超过8个核苷酸的RNA/RNA茎干的二级折叠结构且含有潜在的锤头核酶切割位点的mRNA区。然后利用RNA酶H测定方法评估了这些位点的寡核苷酸可及性(参见图6)。在这些测定分析中使用了58个DNA寡核苷酸(每个长21个核苷酸)。这些寡核苷酸覆盖了85个位点。这些寡核苷酸的位置和命名是195、205、240、307、390、424、472、481、539、592、625、636、678、725、741、811、859、891、897、912、918、928、951、958、969、993、999、1015、1027、1032、1056、1084、1105、1156、1168、1186、1195、1204、1213、1222、1240、1269、1284、1293、1345、1351、1420、1471、1533、1563、1714、1750、1786、1806、1819、1921、1954、和1978。也覆盖并包括了二级位点，为202、394、384、385、484、624、627、628、679、862、901、930、950、952、967、990、991、1026、1035、1108、1159、1225、1273、1534、1564、1558、和1717。实施例11GBSS的RNA酶H测定使用GBSS编码区、3′非编码区和部分5′非编码区的全长转录物进行RNA酶H测定(图7)。通过上文Draper等描述的一般方法(本文一并参考)筛选了GBSSRNA可及切割位点。简言之，合成了代表锤头核酶切割位点的DNA寡核苷酸。使用聚合酶链反应从玉米cDNA克隆产生T7RNA聚合酶转录底物。由这些模板在体外合成标记的RNA转录物。将寡核苷酸和标记的转录物退火，加入RNA酶H并且在37℃下将混合物温育10分钟。终止反应并且在在测序聚丙烯酰胺凝胶上分离RNA。通过放射自显影定量分析方法使用磷光体成像系统测定了切割的底物的百分比(图7)。实施例12GBSS的锤头核酶设计了针对在RNA酶H测定中最充分切割的寡核苷酸所覆盖的位点的具有10/10(即在核酶的每个臂上能够形成10个碱基对)核苷酸结合臂的锤头核酶。然后通过计算机折叠算法分析这些核酶，并且淘汰具有明显二级结构的核酶。筛选过程的结果是设计了针对GBSSmRNA中最开放区域的23个核酶，表IV中显示了这些核酶的序列。使用化学方法合成核酶。使用的合成方法采用上述(Usman等，上文；Scaringe等；Wincott等，上文，本文一并参考)的标准RNA合成方法，并且使用了普通的核酸保护和偶联基团(如5′端的二甲氧基三甲苯基和3′端的磷酰胺)。平均的分步偶联产率＞98％。通过用U取代G5和U取代A14(编号源于上文所述的Hertel等)合成无活性的核酶。分两部分合成了发夹核酶，并且退火以重新构建活性的核酶(Chowira和Burke，1992，核酸研究，20，2835-)。通过用2′-O-甲基基团修饰5′末端和3′末端的5个核糖核苷酸改进了所有核酶以增加稳定性。使用普通的方法通过凝胶电泳(Ausubel等，1990分子生物学目前的方案Wiley&Sons，NY)纯化核酶，或者通过以上所述的高压液相层析法纯化核酶，并且将核酶重悬浮在水中。实施例13GBSS的长底物测试用于本研究的靶RNA长900nt，并且包含针对GBSSRNA的全部23个HH核酶的切割位点。由cDNA克隆通过PCR扩增含有GBSS靶序列上游的T7RNA聚合酶启动子的模板。使用T7RNA聚合酶由PCR扩增的模板转录靶RNA。在转录过程中通过加入[c-32P]CTP作为4种三磷酸核糖核苷酸之一将转录物进行内部标记。在37℃下转录2小时后，用DNA酶-1处理转录混合物以消化用于转录的DNA模板。把转录混合物在变性聚丙烯酰胺凝胶中分离。在凝胶切片中分离出对应于全长RNA的带，并且用异丙醇沉淀出RNA，把沉淀物储存在4℃的条件下。在核酶过量(kcat/KM)条件下进行核酶切割反应(上述的Herschlag和Cech)。简言之，在50mMTris-HCl(pH7.5)和10mMMgCl2存在下通过加热至90℃并保持2分钟分别将1000nM核酶和＜10nM的内部标记的靶RNA变性。通过冷却到反应温度(37℃、26℃和20℃)并持续10-20分钟将RNA复性。在合适的反应温度下通过把核酶与靶RNA混合开始切割反应。在一定的时间间隔内取出等分试样，并且通过加入等体积的停止缓冲液使反应停止。将样品在4％的测序凝胶上分离。图8总结了在三种不同温度下的核酶切割反应结果。选出7个领头(lead)核酶(425、892、919、959、968、1241和1787)。活性核酶之一(811)产生了异常的切割产物模式，结果它没有被选为一种领头核酶。实施例14使用多核酶组合切割GBSSRNA将四个领头核酶(892、919、959、1241)在下列组合中与内部标记的靶RNA一起温育892、892+919、892+919+959、892+919+959+1241。RNA切割份额以加性方式随着切割反应中所用核酶的数量增加而增加(图9)。核酶切割反应如上所述在20℃下进行。这些数据表明定靶到同一mRNA上不同位点的多核酶以加性方式加剧靶RNA的减少。实施例15构建表达核酶的GBSS转录单元克隆GBSS多聚体核酶RPA63(活性)和RPA64(无活性)构建含有GBSSmRNA的四个锤头核酶靶位点892、919、959和968的多聚体核酶。购买两个有18个核苷酸重叠的DNA寡核苷酸(MacromolecularResourses，FortCollins，CO)。序列如下寡核苷酸1CGCGGATCCTGGTAGGACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAATGTTGTGCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAATGCAGAAAGCGGTCTTTGCGTCCCTGTAGATGCCGTGGC寡核苷酸2CGCGAGCTCGGCCCTCTCTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGGTGCTACCTCAAGAGCAACTACCAGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGCCACGGCATCTACAGGG通过在每一种酶基元的催化中心用T取代G5和T取代A14得到上述无活性的核酶。90℃下将这些酶在1XKlenow缓冲液(Gibco/BRL)中退火5分钟，然后慢慢冷却到室温(22℃)。加入NTP至浓度为0.2mM，37℃下用Klenow酶以1单位/μl将寡核苷酸延伸1小时。用苯酚/三氯甲烷提取，乙醇沉淀，然后在1XReact3缓冲液(Gibco/BRL)中重悬浮，37℃下用BamHI和SstI消化1小时。使用Qiagen凝胶提取试剂盒在2％琼脂糖凝胶上将所说的DNA进行凝胶纯化。将DNA片段连接到BamHI/SstI消化的pDAB353中。用此连接物转化到感受态DH5αF′细菌(Gibco/BRL)中。通过用BamHI/EcoRI消化筛选潜在的克隆。通过测序确认这些克隆。与靶序列同源的总长度为96个核苷酸。919单体核酶(RPA66)如下所述使用10/10臂构建针对GBSSmRNA的919位点的单核酶。购买下列两个DNA寡核苷酸寡核苷酸1GATCCGATGCCGTGGCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTGGTAGTT寡核苷酸2AACTACCAGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGCCACGGCATCG将这两个寡核苷酸在1X激酶缓冲液(Gibco/BRL)中分别进行磷酸化，热变性，90℃下混合10分钟使之退火，然后慢慢冷却到室温(22℃)。通过用SstI消化pDAB353并用T4DNA聚合酶将末端补齐而制备载体。将此载体用BamHI再消化，并如上所述进行凝胶纯化。16℃下在1X连接缓冲液(Gibco/BRL)中将退火的寡核苷酸过夜连接到载体中。使用BamHI/EcoRI消化潜在的克隆，并通过测序确认。实施例16用于Δ9核酶实验的植物转化质粒pDAB367和用于GBSS核酶实验的pDAB353部分ApDAB367质粒pDAB367具有以下的DNA结构以位于pUC19(441碱基，参考文献1)的SphI位点的最后一个C残基后的碱基开始，并在与LacZ基因编码链邻近的链上阅读，接头序列CTGCAGGCCGGCCTTAATTAAGCGGCCGCGTTTAAACGCCCGGGCATTTAAATGGCGCGCCGCGATCGCTTGCAGATCTGCATGGGTG，CaMVDNA的7093-7344核苷酸(2)，接头序列CATCGATG，CaMV的7093-7439核苷酸，接头序列GGGGACTCTAGAGGATCCAG，MSV的167-186核苷酸(3)，MSV的188-277核苷酸(3)，C残基，之后是含有外显子1和内含子1部分的玉米Adh1S的核苷酸119-209(4)，含有Adh1S内含子1和外显子2部分的核苷酸555-672(4)，接头序列GACGGATCTG，MSV的核苷酸278-317。之后是修饰的pIJ4104BAR编码区(5)，其中用GCC丙氨酸密码子代替第二位置上的AGC丝氨酸密码子，编码区的546核苷酸由G改变成A，以便除去BglII位点。接下来是接头序列TGAGATCTGAGCTCGAATTTCCCC，Nos的1298-1554核苷酸(6)，G残基，之后是pUC19序列的其它部分(包括EcoRI位点)。部分BpDAB353质粒pDAB353具有以下的DNA结构以位于pUC19(441碱基，参考文献1)的SphI位点的最后一个C残基后的碱基开始，并在与LacZ基因编码链邻近的链上阅读，接头序列CTGCAGATCTGCATGGGTG，CaMVDNA的7093-7344核苷酸(2)，接头序列CATCGATG，CaMV的7093-7439核苷酸，接头序列GGGGACTCTAGAG，含有外显子1和内含子1部分的玉米Adb1S的核苷酸119-209(4)，含有Adh1S内含子1和外显子2部分的核苷酸555-672(4)，接头序列GACGGATCCGTCGACC，其中的GGATCC代表BamHI限制酶的识别序列。之后是pRAJ275的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因(7)(作为NcoI/SacI片段克隆)，接头序列GAATTTCCCC，Nos核苷酸1298-1554的多聚A区(6)，G残基，之后是pUC19序列的其它部分(包括EcoRI位点)。以下参考文献本文一并参考1.Messing，J.(1983)“酶学方法”(Wu.，R.等编辑)10120-78。2.Franck，A.，H.Guilley，G.Jonard，K.Richards，和L.Hirth(1980)花椰菜花叶病毒DNA的核苷酸序列，细胞21285-294。3.Mullineaux，P.M.，J.Donson，B.A.M.Morris-Krsinich，M.I.Boulton和J.W.Davies(1984)玉米线条病毒DNA的核苷酸序列，EMBOJ.33063-3068。4.Dennis，E.S.，W.L.Gerlach，A.J.Pryor，J.L.Bennetzen，A.Inglis，D.Llewellyn，M.M.Sachs，R.J.Ferl，和W.J.Peacock(1984)玉米乙醇脱氢酶(Adhl)基因的分子分析，核酸研究123983-4000。5.White，J.，S-YChang，M.J.Bibb，和M.J.Bibb(1990)含有吸水链霉菌bar基因的盒用于植物转化的选择标记，核酸研究181062。6.Depicker，A.，S.Stachel，P.Dhaese，P.Zambryski，和H.M.Goodman(1982)胭脂氨酸合成酶转录物图谱测定和DNA序列，分子应用遗传学杂志1561-573。7.Jefferson，R.A.(1987)分析植物中的嵌合基因GUS基因融合系统，植物分子生物学通报5387-405。实施例17质粒pDAB359含有γ-玉米醇溶蛋白启动子、反义GBSS和Nos多聚腺苷酸序列的植物转化质粒质粒pDAB359是一个6702bp的双链环状DNA，此质粒含有下面的序列成分pUC18的核苷酸1-404，其中含有从第238至404碱基的乳糖操纵子序列，并且以M13mp18多接头的HindIII位点结束(1，2)；核苷酸412至668的Nos多聚腺苷酸序列(3)；核苷酸的679-690的合成的衔接头序列，此序列通过把GAGCTC变为GAGCTT并加入CTCGAG而使SacI位点转变为XhoI位点；从691至2953碱基的玉米颗粒结合淀粉合酶cDNA，对应于SEQ.I.D.NO.25的核苷酸1-2255。由原来的cDNA通过增加5′的XhoI和3′的NcoI位点并且通过使用Klenow填充酶识别序列使内部的NcoI和XhoI位点缺失而修饰质粒pDAB359中的GBSS序列。碱基2971至4453是玉米的27kDγ-玉米醇溶蛋白基因的5′非翻译序列，对应于公开的序列(4)的1078至2565核苷酸。修饰了γ-玉米醇溶蛋白序列使之含有5′KpnI位点和3′BamH/SalI/NcoI位点。相对于公开的序列，在γ-玉米醇溶蛋白序列中另外的改变包括在核苷酸104的T缺失、在核苷酸613的TACA缺失、在核苷酸812的C至T的改变、在核苷酸1165的A缺失和在核苷酸1353的A插入。最后，pDAB359的核苷酸4454至6720与pUC18的碱基456至2686(其中包含从4454至4471的M13/mp18多接头的KpnI/EcoRI/SacI位点、从4471至4697的lac操纵子片段和从5642至6433的β-内酰胺酶基因(1，2))相同。下面的参考文献本文一并参考pUCI8-Norrander，J.，Kempe，T.，Messing，基因杂志(1983)26101-106；Pouwels，P.H.，Enger-Valk，B.E.，Brammar，W.J.克隆载体，Elsevier1985和增刊。NosA-Depicker，A.，Staehel，S.，Dhaese，P.，Zambryski.P.，和Goodman，H.M.(1982)胭脂氨酸合酶转录物图谱测定和DNA序列，分子应用遗传学杂志1561-573。玉米27kDγ-玉米醇溶蛋白-Das，O.P.，Poliak，E.L.，Ward，K.，Messing，核酸研究杂志19，3325-3330(1991)。实施例18构建含有由遍在蛋白启动子/内含子(Ubil)表达的反义Δ9去饱和酶的质粒pDAB430部分A质粒pDAB421的构建质粒pDAB421含有唯一的由玉米遍在蛋白启动子/内含子侧接的平端SrfI克隆位点和胭脂氨酸合酶多聚腺苷酸化序列。通过如下方法制备pDAB421用限制酶KpnI和BamHI消化pDAB355以切下2.2kB片段上的R编码区。凝胶纯化后，将此载体连接到由两个退火的寡核苷酸OF235和OF236组成的衔接头上。OF235具有5′-GATCCGCCCGGGGCCCGGGCGGTAC-3′的序列，OF236具有5′-CGCCCGGGCCCCGGGCG-3′的序列。通过使用在衔接头中而不在质粒的其他位点切割的酶SrfI和SmaI消化和线性化质粒DNA来鉴定含有衔接头的克隆。测序了一个代表性的克隆以验证只有一个衔接头插入到质粒中。在随后的Δ9去饱和酶反义质粒pDAB430的构建中使用生成的质粒pDAB421。部分B构建质粒pDAB430(反义Δ9去饱和酶)通过克隆在质粒pDAB421的平端克隆位点的扩增产物产生存在于质粒pDAB430中的反义Δ9去饱和酶构建体。由同一个实验同时产生两个构建体。第一个构建体在有义方向的遍在蛋白启动子后面含有Δ9去饱和酶基因，并含有用于转基因系中过量产生的蛋白质的免疫学检测的与Δ9去饱和酶开放读框的C末端融合的c-myctag。这种构建体用于在不能表达玉米Δ9去饱和酶的系统中检测核酶。从来没有使用过这种构建体，但是用于扩增和构建Δ9去饱和酶反义基因的引物是相同的。使用两种引物扩增了本文描述的Δ9去饱和酶cDNA序列。N末端引物OF279具有如下序列5′-GTGCCCACAATGGCGCTCCGCCTCAACGAC-3′。具有下划线的碱基和cDNA序列的核苷酸146-166相对应。C末端引物OF280具有以下序列5′-TCATCACAGGTCCTCCTCGCTGATCAGCTTCTCCTCCAGTTGGACCTGCCTACCGTA-3′，并且是序列5′-TACGGTAGGGACGTCCAACTGGAGGAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGTGATGA-3′的反向互补序列。在此序列中具有下划线的碱基和cDNA序列的核苷酸1304-1324相对应，斜体的碱基和c-myc抗原决定基序列相对应。通过使用1.0％琼脂糖凝胶纯化1179bp的扩增产物，并且将它连接到用限制酶SrfI线性化的质粒pDAB421上。使用集落杂交选择含有pDAB421质粒(带有插入片段)的克隆。通过用诊断酶KpnI和BamHI进行质粒DNA的限制性消化测定插入片段的方向。回收了含有相对于遍在蛋白启动子/内含子为有义取向的Δ9去饱和酶编码序列的克隆，并将其命名为pDAB429。把含有相对于启动子为反义取向的Δ9去饱和酶编码序列的另一个克隆命名为pDAB430。对质粒pDAB430进行序列分析，确定了此序列含有三个PCR引起的错误(和所期望的序列相比较)。在和引物OF280相应的序列中发现了一个错误，在编码序列内部发现了两个核苷酸改变。没有校正这些错误，因为反义负调节不需要在反义转录物和负调节靶之间100％的序列同一性。实施例19胚胎发生的玉米培养物的氦轰击和转基因子代的后续再生部分A胚胎发生的玉米培养物的建立转化实验使用的组织培养物来自基因型＂Hi-II＂的未成熟的合子胚。Hi-II是来源于B73xA188杂交的2个R3系互交所得的杂种(Armstrong等1990)。当培养时，这种基因型产生称为类型II的愈伤组织。类型II愈伤组织较脆弱，生长较快，并且显示出长时间保持高水平胚胎发生活性的能力。类型II培养物来自1.5-3.0mm未成熟的胚，这些胚是通过对温室培育的Hi-II植物进行控制授粉而得到的。所用的起始培养基是含有1.0mg/l2，4-D、25mML-脯氨酸、100mg/l酪蛋白水解物、10mg/lAgNO3、2.5g/Lgelrite和2％蔗糖的N6培养基(Chu，1978)，pH调节到5.8。大约2-8周后选择类型II愈伤组织，除去非胚胎发生的和/或类型I愈伤组织。一旦选择了类型II愈伤组织，就将其转移到不含AgNO3、L-脯氨酸含量降低到6mM的保持培养基上。继代培养大约3个月后(其中增加了胚胎发生培养物的数量与质量)，这种培养物被视为能够用于转化实验中。部分B质粒DNA的制备在用于转化实验前，将质粒DNA吸附到金颗粒的表面。在GBSS靶实验中使用了金颗粒，这些颗粒为球形，直径在1.5-3.0微米之间(Aldrich化学公司，Milwaukee，WI)。Δ9去饱和酶靶的转化实验使用了1.0微米球形金颗粒(Bio-Rad，Hercules，CA)。使用前，将所有的金颗粒用乙醇进行表面消毒。通过向300μl质粒DNA和无菌水中加入74μl2.5M氯化钙和30μl0.1M亚精胺而完成吸附。质粒DNA的浓度是140μg。立即将涂上DNA的金颗粒涡旋，并令其从悬浮液中沉淀出来。除去所得的澄清的上清液，并将颗粒重新悬浮在1ml100％乙醇中。用于氦轰击的悬浮液的最终稀释浓度为每毫升乙醇中含有7.5mgDNA/金。部分C制备组织靶并对其进行氦轰击将每靶大约600mg胚胎发生愈伤组织平铺在含有类型II愈伤组织保持培养基加0.2M山梨醇和0.2M甘露糖醇(作为渗透剂)的培养皿表面。在大约4小时预处理后，将所有的组织转移到含有2％琼脂轰击培养基(保持培养基+渗透剂+2％琼脂)的培养皿上。氦轰击涉及促进悬浮的涂有DNA的金颗粒导向并进入制备的组织靶中。所用的仪器是DowElanco美国专利(#5,111,131)(本文一并参考)描述的仪器的早期原型，但二者的功能相似。此仪器包括高压氦源、含有DNA/金粉悬浮液的注射器和气动多功能阀门(对氦源和已经装载的DNA/金粉悬浮液回路之间进行连接控制)。轰击前，将组织靶用无菌104微米不锈钢屏覆盖，该屏在轰击过程中可以保证组织位置不变。接下来真空下将靶放置在此仪器的主室中，使用1500psi氦压在组织靶上将涂有DNA的金颗粒加速4次。每次轰击释放20μlDNA/金悬浮液。轰击后，立即将靶放回到添加有渗透剂的保持培养基中培养16至24个小时(恢复期)。部分D筛选转化的组织并由转基因培养物再生植株轰击12-24小时后，将组织分割成小块并转移到选择培养基(保持培养基+30mg/lBastaTM)。每四周将组织块无选择地转移到新鲜的选择培养基中，共3个月。在8周至24周后，除去并分离所发现的任何相对于生长抑制组织正在繁殖的部分。将推定转化的组织继代培养到新鲜的选择培养基中。再继代培养1至3次后建立转基因培养物。一旦BastaTM抗性愈伤组织建成为一个系，通过将愈伤组织转移到含有以细胞分裂素为基础的诱导培养基的培养皿上开始植株再生，然后将其在低光照(125英尺烛光)下放置一周，之后在高光照(325英尺烛光)下放置一周。诱导培养基由MS盐和维生素(Murashige和Skoog，1962)、30g/l蔗糖、100mg/l肌肌醇、5mg/l6-苯甲氨基嘌呤、0.025mg/l2，4-D、2.5mg/lgelrite组成，pH调节到5.7。经过两周诱导后，将组织无选择地转移到无激素的再生培养基中，并保持在高光照下。再生培养基由MS盐和维生素、30g/l蔗糖和2.5mg/lgelrite组成，pH调节到5.7。诱导和再生培养基都包含30mg/lBastaTM。在2-4周后组织开始分化出茎和根。取下小植株(1.5-3cm)并将其放置在含有SH培养基的试管中。SH培养基由SH盐和维生素(Schenk和Hildebrandt，1972)、10g/l蔗糖、100mg/l肌肌醇、5ml/lFeEDTA、以及7g/l琼脂或2.5g/lgelrite组成，pH调节到5.8。一旦小植株开始生长并发育出足够的根系(1-2周)，将其转移到温室中的装有大约0.1kgMetro-Mix360(TheScotts公司，Marysville，OH)的10cm花盆中。在3-5叶期，将植株转移到装有大约4kgMetro-Mix360的5加仑花盆中，培育至成熟。将这些R0植株自交和/或与非转基因近交系杂交，以获得转基因的子代。为GBSS靶产生的转基因植物中，重新种植了由R0授粉产生的R1种子。将R1植物培育至成熟，经授粉产生足够量的分析用R2种子。实施例20Δ9转基因材料的产生和再生部分A转化和分离胚胎发生愈伤组织将上文描述的针对Δ9去饱和酶的六个核酶构建体转化到此处描述的可再生的类型II愈伤组织培养物中。这6个构建体由3个活性/无活性对组成，即RPA85/RPA113、RPA114/RPA115和RPA118/RPA119。总共制备并轰击了1621个组织靶，并将其转移到选择培养基中。在这些轰击实验中，通过选择分离了334个独立的Basta抗性转化组织(“系”)，以DNAPCR或GC/FAME作为检测手段确定哪一个该进行再生和哪一个该弃去，分析了大约50％的系。由于余下的50％不能再生胚胎或者已污染而没有进行分析。部分B由转基因愈伤组织再生Δ9植株分析完转基因愈伤组织后，每个核酶构建体选择十二个系用于再生，这样每个系将产生15个R0植株。这些系一般由10个阳性系+2个阴性对照组成，然而由于一些培养物的再生能力差，构建体RPA113、RPA115、RPA118和RPA119由少于12个系产生植株。从66个独立的系中再生了总共854个R0植株(参见表X)。当植株成熟时，优先进行自花或近缘授粉，然而当不能进行自花或近缘授粉时，使用近交系CQ806、CS716、OQ414或HO1作为花粉供体(有时也作为花粉受体)进行杂交授粉。进行了超过715个控制授粉，其中多数是自花或近缘授粉(55％)，少数是F1杂交。授粉大约45天后收获R1种子。实施例21GBSS转基因玉米的产生和再生部分A胚胎发生的玉米愈伤组织的转化及后续的转基因培养物的选择和建立将针对GBSS的核酶多聚体的活性/无活性对RPA63和RPA64与bar选择质粒pDAB308一起插入到本文描述的类型II愈伤组织中。从590个轰击的组织靶的选择中回收了总共115个BastaTM抗性的独立转化组织。对从所有转化中建立的培养物愈伤组织样品进行了Southern分析以确定兴趣基因的状态。部分B从用针对GBSS的核酶转化的培养物中再生植株和产生R2代从Southern“阳性”转基因培养物起再生植株，并且在温室中培育至成熟。将主要的再生植株授粉以产生R1种子。授粉30至45天后收获种子，将种子干燥至正确含湿量并且将种子种植。将代表16个原始系的总共752个R1植株培育至性成熟并且授粉。大约在授粉19至22天后收获麦穗，随机地从每个穗中摘下30个谷粒，并且冷冻以用于以后的分析。实施例22玉米BlackMexicanSweet(BMS)稳定转化愈伤组织中靶向GBSS的核酶的检测部分A用GBSS稳定转化的BMS愈伤组织和靶向GBSS的核酶的产生BMS不能产生和玉米内源的GBSSmRNA同源的GBSSmRNA。因此研究出了一个双转化系统以产生表达靶和核酶的转化体。在继代培养四天后，通过转移到100×200mm培养皿(FisherScientific，Pittsburgh，PA)并除去部分液体培养基制备了＂ZM＂BMS悬浮液(从JackWidholm(Illinois大学)得到，也参见W.F.Sheridan，“BlackMexicanSweet玉米用于组织培养”(玉米生物学研究，W.F.Sheridan编辑，大学出版社，NorthDakokta大学，GrandForks，ND，1982，pp.385-388))用于进行氦轰击，形成细胞薄糊。靶是由100-125mg(鲜重)生长在置于轰击培养基上的1/2”抗生素盘(Schleicher和Schuell，Keene，NH)上的细胞、DN6[N6盐和维生素(Chu等，1978)、20g/l蔗糖、1.5mg/l2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、25mML-脯氨酸，121℃下高压灭菌20分钟前将pH调节到5.8]组成，用2％TC琼脂(JRH生物科学，Lenexa，Kansas)固化，铺在60X20mm平板上。将DNA沉淀在金颗粒上。在第一次转化中使用pDAB426(Ubi/GBSS)和pDAB308(35T/Bar)。使用DowElanco氦轰击仪器I分别对靶进行轰击。在真空压为650mmHg，靶到仪器喷口的距离为15.5cm下，以500psi用DNA/金混合物轰击每个样品一次。轰击后，立即将抗生素盘转移到由0.8％TC琼脂组成的DN6培养基上，使靶组织恢复一周。恢复后，将每个靶平铺在置于不含脯氨酸而含有3mg/lBasta(Hoechst，法兰克福，德国)的5.5cmWhatman#4滤膜上。两周后，将滤膜转移到含有6mg/lBasta的新鲜选择培养基上。以后每两周进行一次转移。从滤膜上挑取分离物并将其置于用0.8％TC琼脂(含有6mg/lBasta)固化的AMCF-ARM培养基(N6盐和维生素、20g/l蔗糖、30g/l甘露糖醇、100mg/l酸性酪蛋白水解物、1mg/l2，4-D、24mML-脯氨酸；121℃下高压灭菌20分钟前将pH调节到5.8)上。每两周将分离物转移到新鲜的培养基上进行继代培养，从而维持分离物。对表达GBSS的Basta抗性分离物进行第二次转化。如BMS悬液那样，在继代培养4天后，通过将组织平铺在1/2＂滤膜上制备转基因愈伤组织的靶。然而，由于转化体保持在AMCF-ARM选择培养基上，使用含有2％TC琼脂的AMCF-ARM用于轰击。用无菌104μm目的屏覆盖每一个样品，在1500psi下进行轰击。用pDAB319(35S-ALS；35T-GUS)和RPA63(活性的核酶多体)或pDAB319和RPA64(无活性的核酶多体)共轰击或单独使用pDAB319轰击靶组织。轰击后，将所有的靶立即转移到非选择培养基(AMCF-ARM)中，恢复1周。接下来，将所说的靶放置在含有两种选择试剂6mg/LBasta和2μg/L绿黄隆(CSN)的AMCF-ARM培养基中。2周后，CSN的水平增加至4ug/L。按照第一次转化的描述连续转移滤膜并产生分离物，将分离物维持在含有6mg/LBasta和4μg/LCSN的AMCF-ARM培养基中。部分B分析表达GBSS和靶向GBSS的核酶的BMS稳定转化体通过Northern印迹分析方法评价第一次转化的分离物，以检测功能性靶基因(GBSS)，并确定相对表达水平。在25个所分析的分离物中，有12个检测到了GBSS转录物。观察了表达范围，表明转化过程是独立的。通过Northern印迹分析方法评价第二次转化产生的分离物，以检测连续的GBSS表达，通过RT-PCR筛选核酶转录物是否存在。所试验的19个来自一个原先转化系的分离物中，18个表达活性核酶(RPA63)，所有的分离物都表达GBSS。在6个载体对照中都检测到了GBSS；在这些样品中核酶没有表达。如本文所述，在表达核酶的组织和载体对照组织中进行了RNA酶保护测定(RPA)和Northern印迹分析，以便比较在活性核酶存在和不存在情况下GBSS转录物的水平。使GBSS值相对内对照(Δ9去饱和酶)标准化。Northern印迹数据如图(25)所示。Northern印迹结果表明，与载体对照相比，在核酶存在时GBSS的水平明显降低。RPA数据表明一些表达活性核酶的独立样品(＂L＂和＂O＂)与载体对照明显不同，而与非转化对照相似。实施例23植物和愈伤组织材料的分析在愈伤组织水平和R0水平分析用pDAB308和下列含有核酶的载体之一(pRPA63、pRPA64、pRPA85、pRPA113、pRPA114、pRPA115、pRPA118或pRPA119)共转化的植物材料，并在F1水平分析选择系。当小植株达到6-8叶期时，收获叶片材料。如Saghai-Maroof等的描述(见上文)从冻干的组织中制备植物和愈伤组织材料的DNA。使用对每一个构建体特异性的限制性酶在厂商建议的条件(Bethesda研究实验室，Gaithersburg，MD)下消化每一种DNA(8μg)，并通过琼脂糖凝胶电泳分离。如Southern，E.(1975)的＂在通过凝胶电泳分离的DNA片段中检测特异性序列＂(分子生物学杂志98503)和Southern，E.(1980)的＂限制性片段的凝胶电泳＂(酶学方法69152)的描述(本文一并参考)将所说的DNA印迹到尼龙膜上。将核酶编码区特异性探针与所说的膜杂交。在将所说的探针DNA加入到带有50微居α-32P-dCTP(Amersham生命科学，ArlingtonHeights，IL)的Ready-To-GoDNA标记珠(PharmaciaLKB，Piscataway，NJ)之前，通过将50ng的探针DNA煮沸10分钟，然后快速在冰上冷却而制备探针DNA。在尼龙膜上将探针与基因组DNA杂交。60℃下，将此膜在0.25XSSC和0.2％SDS中洗涤45分钟，吸干，并用两个增强屏对XAR-5胶片曝光过夜。用限制性酶HindIII和EcoRI消化RPA63与RPA64的DNA，并将含有这些样品的印迹与RPA63探针杂交。RPA63探针由RPA63核酶多聚体编码区组成，当与RPA63或RPA64物质杂交时将产生单一的1.3kb杂交产物。这一1.3kb杂交产物应含有增强的35S启动子、AdhI内含子、核酶编码区和胭脂氨酸合酶多聚A3′末端。用限制酶HindIII与EcoRI消化RPA85和RPA113的DNA，并将含有这些样品的印迹与RPA122探针杂交。RPA122是在pDAB353中取代GUS报道基因的252多聚体核酶。RPA122探针是由RPA122核酶多聚体编码区和胭脂氨酸合酶的3′末端组成的，当与RPA85或者RPA113物质杂交时应能产生一个单一的2.1kb杂交产物。此2.1kb杂交产物应含有增强的35S启动子、AdhI内含子、bar基因、核酶编码区和胭脂氨酸合酶多聚A3′末端。用限制性酶HindIII和SmaI消化RPA114与RPA115的DNA，并将含有这些样品的印迹与RPA115探针杂交。RPA115探针由RPA115核酶编码区组成，当与RPA114或RPA115物质杂交时应产生单一的1.2kb杂交产物。这一1.2kb杂交产物应含有增强的35S启动子、AdhI内含子、核酶编码区和胭脂氨酸合酶多聚A3′末端。用限制性酶HindIII和SmaI消化RPA118与RPA119的DNA，并将含有这些样品的印迹与RPA118探针杂交。RPA118探针由RPA118核酶编码区组成，当与RPA118或RPA119物质杂交时应产生单一的1.3kb杂交产物。这一1.3kb杂交产物应含有增强的35S启动子、AdhI内含子、核酶编码区和胭脂氨酸合酶多聚A3′末端。实施例24转基因愈伤组织基因组DNA的提取将300mg旺盛生长的愈伤组织在于冰上迅速冷冻。用冷的Bessman组织粉碎器(Spectrum，Houston，TX)将愈伤组织研磨成细粉末，并用400μl2XCTAB缓冲液(2％六癸基三甲基溴化铵、100mMTrispH8.0、20mMEDTA、1.4MNaCl、1％聚乙烯吡咯烷酮)提取。60℃下将悬液溶解25分钟，然后用等体积的三氯甲烷∶异戊醇提取。向水相中加入0.1倍体积的10％CTAB缓冲液(10％六癸基三甲基溴化铵、0.7MNaCl)。用等体积的三氯甲烷∶异戊醇提取后，向水相中加入0.6倍体积的冷异丙醇，并在-20℃下放置30分钟。在14,000rpm下离心5分钟后，将所得的沉淀真空干燥10分钟。65℃下将其重悬浮在200μlTE(10mMTris，1mMEDTA，pH8.0)中20分钟。向DNA中加入20％Chelex(Biorad)使其最终浓度达到5％，56℃下将其温育15-30分钟以便除去杂质。在Hoefer荧光计(Hoefer，SanFrancisco)上测量DNA浓度。实施例25基因组愈伤组织DNA的PCR分析使用聚合酶链反应(PCR)证明核酶基因稳定地插入到转基因玉米愈伤组织的染色体上。部分A用于检测核酶DNA的方法使用AmpliTaqDNA聚合酶(GeneAmpPCR试剂盒，PerkinElmer，Cetus)如厂商方法中的描述进行聚合酶链反应(PCR)。将300ng基因组愈伤组织DNA、1μl50μM下游引物(5′CGCAAGACCGGCAACAGG3′)、1ml上游引物、1μlPerfectMatch(Stratagene，Ca)PCR增强子的等份试样与试剂盒组分混合。使用下列参数进行40个循环的PCR反应94℃下变性1分钟、55℃退火2分钟、72℃下伸长3分钟。在每个PCR反应物中取0.2倍体积的等份试样在2％3∶1琼脂糖(FMC)凝胶上使用标准的TEA琼脂糖凝胶条件进行电泳。部分B用于检测Δ9去饱和酶核酶基因的上游引物融合到BAR3′ORF的RPA85/RPA113251多体RPA114/RPA115258核酶单体RPA118/RPA119452核酶多体5′TGGATTGATGTGATATCTCCAC3′在35S启动子中，此引物用于横跨EcoRV位点的扩增。使用标准的寡核苷酸合成方案在应用生物系统394型DNA/RNA合成仪上制备引物。实施例26从转基因玉米愈伤组织和植物中制备总RNA部分A从转基因不可再生和可再生的愈伤组织中制备总RNA将300mg旺盛生长的愈伤组织在干冰上迅速冷冻。用冷的Bessman组织粉碎器(Spectrum，Houston，TX)将愈伤组织研磨成细粉末，并用RNA提取缓冲液(50mMTris-HClpH8.0、4％对氨基水杨酸、1％三异丙基萘磺酸、10mM二硫苏糖醇和10mM偏酸式亚硫酸钠)通过激烈涡旋提取。然后用等体积的含有0.1％8-羟基喹啉的苯酚提取匀浆。离心后，水层用等体积的含有三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)的苯酚提取，之后用三氯甲烷∶辛醇(24∶1)提取。接下来加入7.5M乙酸铵使其最终浓度为2.5M，4℃下沉淀RNA1-3小时。4℃下以14,000rpm离心后将RNA重悬浮在无菌水中，用2.5MNH4OAc和2倍体积的100％乙醇沉淀，-20℃下过夜温育。用70％乙醇洗涤收集的RNA沉淀，并且在真空下干燥。将RNA重悬浮在无菌水中，并储存在-80℃。部分B从转基因玉米植物制备总RNA切下5cm大小的(大约为150mg)旺盛生长的玉米叶片组织切片，在干冰上迅速冷冻。在冷的研钵中将叶片研磨成细粉末。按照厂商的说明使用QaigenRNeasy植物总RNA试剂盒(Qiagen公司，Chatsworth，CA)从粉末中纯化总RNA。通过预加热(50℃)无菌水(每个30μl)的两次系列洗脱旋转从RNeasy柱上释放总RNA，并保存在-80℃。实施例27使用RT-PCR分析证实核酶RNA在转基因玉米愈伤组织和植物中的表达部分A用于检测核酶RNA的方法使用耐热rTthDNA聚合酶(rTthDNA聚合酶RNAPCR试剂盒，PerkinElmerCetus)如供应商方案的描述进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。将300ng总RNA(叶片或愈伤组织)的等分试样和1μl15μM下游引物(5′CGCAAGACCGGCAACAGG3′)与试剂盒的RT组分混合。分三步分别于60℃、65℃和70℃下温育5分钟进行反转录反应。为了进行PCR反应，将1μl对所分析的RNA具有特异性的上游引物加入到PCR组分的RT反应中。以下列参数进行35个循环的PCR反应96℃下温育1分钟，94℃下变性30秒，50℃下退火30秒，72℃下延伸3分钟。将每一种RT-PCR反应物的0.2倍体积等分试样以标准的TAE琼脂糖凝胶条件在2％3∶1琼脂糖(FMC)凝胶上电泳。部分B用于检测GBSS核酶的特异上游引物GBSS活性和无活性多体5′CAGATCAAGTGCAAAGCTGCGGACGGATCTG3′，此引物覆盖第一个核酶臂的AdhI内含子足迹上游。GBSS918内含子(-)单体5′ATCCGATGCCGTGGCTGATG3′，此引物覆盖10个碱基对的核酶臂和核酶催化域的前6个碱基。由RT-PCR确认了GBSS核酶在转基因愈伤组织和植物中的表达。通过核糖核酸酶保护分析也确认了GBSS多体核酶在稳定转化愈伤组织中的表达。部分C用于检测Δ9去饱和酶核酶的特异上游引物融合到BAR3′ORF中的RPA85/RPA113252多体5′GATGAGATCCGGTGGCATTG3′，此引物跨越BAR基因和RPA85/113核酶的接头。RPA114/RPA115259核酶单体5′ATCCCCTTGGTGGACTGATG3′，此引物覆盖10个碱基对的核酶臂和核酶催化域的前6个碱基。RPA118/RPA119453核酶多体5′CAGATCAAGTGCAAAGCTGCGGACGGATCTG3′。此引物覆盖第一个核酶臂的AdhI内含子足迹上游。由RT-PCR确认了Δ9去饱和酶核酶在转基因植物系85-06、113-06和85-15中的表达。使用标准的寡核苷酸合成方案在应用生物系统394型DNA/RNA合成仪上制备引物。实施例28证明转基因玉米愈伤组织和植株中核酶介导的靶mRNA水平的减少部分A使用Northern分析方法证明靶mRNA水平的减少将5μg的总RNA在真空下干燥，重悬浮在上样缓冲液(20mM磷酸缓冲液pH6.8，5mMEDTA；50％甲酰胺16％甲醛10％甘油)中，并在65℃下变性10分钟。50V下在20mM磷酸缓冲液(pH6.8)(缓冲液再循环)中经1％琼脂糖凝胶进行电泳。在凝胶上用溴化乙锭对BRL0.24-9.5KbRNA系列梯(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)进行染色。通过用无菌水进行毛细管转移将RNA转移到GeneScreen滤膜(DuPontNEN，BostonMA)上。如DeLeon等(1983)的描述在42℃下进行杂交，55℃下洗涤滤膜以便除去没有杂交的探针。依次使用靶基因的cDNA片段和内部RNA对照基因探测印迹。使用RNA内标辨别靶mRNA水平由于上样或操作错误引起的与真正核酶介导的RNA减少的误差。对于每一个样品，将靶mRNA的水平与此样品内的对照mRNA水平比较。通过Qiaex树脂(Qaigen公司，Chatsworth，CA)从1xTAE琼脂糖凝胶上纯化片段。使用含有α-32PdCTP的Amersham缺口翻译试剂盒(Amersham公司，ArlingtonHeights，III.)进行缺口翻译。在-70℃下使用增感屏(DuPont，WilmingtonDE)进行放射自显影1-3大。在曝光24小时后通过密度计检测每一个探针的放射自显影信号，并计算靶/内部对照RNA水平的比值。RNA酶保护测定如下进行使用QiagenRNeasy植物总RNA试剂盒由BMS原生质体或愈伤组织材料制备RNA。使用AmbionMaxiscript试剂盒制备探针，探针一般为108cpm/μg或更高。在使用的当天制备探针。将这些探针进行凝胶纯化，重悬浮在无RNA酶的10mMTris(pH8)中，并保存在冰上。临用前将探针稀释到5×105cpm/μl。将5μg来源于愈伤组织的RNA或者20μg来源于原生质体的RNA在4M胍缓冲液中与5×105cpm探针一起温育。[4M胍缓冲液4M硫氰酸胍/0.5％十二烷基肌氨酸钠/25mM柠檬酸钠(pH7.4)]。将40μlPCR矿物油加入到每一个管中防止蒸发。将样品加热到95℃，保持3分钟，立即放入45℃的水浴中。过夜温育。向每一个样品中加入600μlRNA酶处理混合液，并在37℃下温育30分钟。(RNA酶处理混合液400mMNaCl，40单位/毫升RNA酶A和T1)。每个管中加入12μl20％SDS，之后立即向每个管中加入12μl(20mg/ml)蛋白酶K。将这些管温和地涡旋，37℃下温育30分钟。室温下将750μl无RNA酶的异丙醇加入到每个管中，上下反复颠倒混合，使SDS进入溶液中。然后室温下用小离心机以最高速将这些样品离心20分钟。所得的沉淀在空气中干燥45分钟。将15μl的RNA电泳缓冲液加入到每个管中，激烈涡旋30秒。(RNA电泳缓冲液95％甲酰胺/20mMEDTA/0.1％溴酚蓝/0.1％二甲苯胺)。将样品加热到95℃，保持3分钟，然后将其上样到8％变性丙烯酰胺凝胶上。将此凝胶进行真空干燥，并在磷光成象屏上曝光4-12小时。部分B证明GBSSmRNA水平在表达GBSS和靶向GBSS的核酶RNA的不可再生愈伤组织中减少的结果产生表达GBSS靶基因的RNA和靶定到GBSSmRNA上的活性多体核酶的不可再生愈伤组织。也产生了表达GBSS和核酶(-)对照RNA的转基因体。从转基因系中制备总RNA。对7个核酶(-)对照转化体和8个活性RPA63系进行Northern分析。用于此分析的探针是全长玉米GBSScDNA和玉米Δ9cDNA片段。为了辨别GBSSmRNA水平由于上样或操作错误引起的与真正核酶介导的RNA减少的误差，将GBSSmRNA水平与该样品中的Δ9mRNA水平比较。比较表达核酶和没有核酶的愈伤组织中的全长GBSS转录物水平，以便鉴定具有核酶介导的靶RNA减少的系。通过进行两次平行分析减少印迹间的误差。在核酶(-)的转基因体中观察GBSS/Δ9的比值范围。通过转基因产生靶mRNA，它与内源Δ9mRNA相比在表达上可能会有更多的差异。证明活性系(RPA63)AA、EE、KK和JJ的GBSS/Δ9水平降低最明显，如图25所示与核酶(-)对照转基因体相比减少多达10倍。如本文所述由RT-PCR表明这些活性系表达靶定到GBSS上的核酶。RNA酶保护测定也表明与Δ9mRNA相比，GBSSmRNA减少。部分C在表达靶定到Δ9去饱和酶mRNA上的核酶的转基因植物中Δ9去饱和酶水平降低的证据硬脂酸含量高的转基因体RPA85-06和RPA85-15都含有融合核酶多体基因的完整拷贝。在每个系中，通过RT-PCR筛选植物中核酶RNA的存在。使用实施例27中描述的方案。在叶片中含有高硬脂酸的植物RPA85-06和RPA85-15系中证明了RPA85核酶的表达。对每个系中的6个高硬脂酸植物以及非转化(NT)和转化的对照(TC)植物进行Northern分析。用于此分析的探针是玉米Δ9去饱和酶cDNA的cDNA片段和玉米肌动蛋白cDNA。为了辨别Δ9mRNA水平由于上样或操作错误引起的与真正核酶介导的RNA减少的误差，将Δ9mRNA水平与该样品中的肌动蛋白mRNA水平比较。如上所述使用密度计读数计算每个样品的比值。计算出85-06植物的Δ9/肌动蛋白比值在0.55-0.88之间。非转化的对照Δ9/肌动蛋白的平均值为2.7。在85-06和NT的叶片中的Δ9/肌动蛋比值明显减少了4倍。比较85-06高硬脂酸植株和TC植株之间的Δ9/肌动蛋白比值，发现85-06植株的Δ9/肌动蛋白的值平均减少3倍。这些数据在图26中以图表的形式显示出来。计算了RPA85-15高硬脂酸转基因植株的Δ9/肌动蛋白比值，其范围在0.35至0.53之间，平均值为0.43。在此试验中，NT植株的Δ9/肌动蛋白的平均值为1.7。比较NT对照和85-15高硬脂酸植株的Δ9/肌动蛋白的平均值，发现85-15的Δ9mRNA的减少了3.9倍。比较85-15高硬脂酸植株和正常硬脂酸(TC)植株的Δ9/肌动蛋白值，发现在RPA85-15高硬脂酸转基因植株的Δ9mRNA水平明显减少了3倍。这些数据在图27中以图表的形式显示出来。这些数据表明在表达RPA85核酶并在叶片中产生更高水平硬脂酸的转基因植株中Δ9去饱和酶mRNA的核酶介导的减少。实施例29玉米叶片中由于活性核酶的活性而存在Δ9去饱和酶负调节的证据产生了以无活性形式的Δ9去饱和酶核酶基因转化的植株。给出在无活性Δ9核酶转基因系RPA113-06和113-17叶片中硬脂酸的对照水平的数据。对RPA113-06系进行了核酶表达和Northern分析。测定了RPA113-17系植株中的Δ9去饱和酶蛋白质水平。如本文的描述测定了核酶的表达。植株113-06-04、113-06-07和113-06-10表达了可检测水平的RPA113无活性Δ9核酶。对RPA113-06系的5个植株进行了Northern分析，其叶片中的硬脂酸都在对照的范围内，均在1.8-3.9％之间。如图28所示，和对照相比，在RPA113-06植株中没有发现与核酶表达相关的Δ9去饱和酶mRNA的减少或者叶片硬脂酸的增加。蛋白质分析表明在RPA113-17植株中没有与提高的叶片硬脂酸相关的Δ9去饱和酶蛋白质水平的任何减少。这些数据在图29(a)中以图表的形式显示出来。总之，两个RPA113无活性转基因系的数据表明核酶活性和在RPA85系中观察到的高硬脂酸表型相关。RPA85核酶是RPA113核酶的活性形式。实施例30核酶介导的玉米叶片(R0)中硬脂酰-ACPΔ9去饱和酶水平减少的证明部分A玉米叶片中硬脂酰-ACPΔ9去饱和酶的部分纯化除非特殊说明，所有的过程都是在4℃下进行的。收集玉米叶片(50mg)，并用研钵和研棒将其在液N2中研成细粉末。在由25mM磷酸钠(pH6.5)、1mM乙二氨四乙酸、1mM二硫苏糖醇、10mM苯甲基磺酰氟、5mM亮抑蛋白酶肽和5mMantipapin组成的等体积的缓冲液A中提取蛋白质。在10,000xg下将粗制的匀浆离心5分钟。通过Bio-Rad蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad实验室，Hercules，CA)测定上清液中的总蛋白浓度。将100μg的总蛋白加入到终体积为500μl的缓冲液A中，再加入到50μl混合的SP-琼脂糖珠(Pharmacia生物技术公司，Piscataway，NJ)，并通过简单涡旋重悬浮。在冰上使蛋白质和琼脂糖珠结合10分钟。结合后，将Δ9去饱和酶-琼脂糖珠物质离心(10,000xg)10秒钟，倾析，用缓冲液A(500μl)洗涤三次，并用200mM氯化钠(500μl)洗涤一次。通过在50μl处理缓冲液(125mMTris-HClpH6.8、4％十二烷基硫酸钠、20％甘油、10％2-巯基乙醇)中煮沸5分钟来洗脱蛋白质。把样品离心(10,000xg)5分钟。保存上清液以用于Western分析，并弃去含有琼脂糖珠的沉淀。部分B使用Western分析方法正明硬脂酰-ACPΔ9去饱和酶的减少如Laemmli，U.K.(1970)，在组装噬菌体T4头期间对结构蛋白的切割，自然227，660-685的描述在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(10％PAGE)上分离部分纯化的蛋白质。为了辨别Δ9去饱和酶水平的误差，在每个印迹上加入作为参考的经纯化和定量的大肠杆菌过量表达的Δ9去饱和酶。通过电泳利用Pharmacia半干燥印迹纸(Pharmacia生物技术公司，Piscataway，NJ)使用Towbin缓冲液(Towbin等，1979)将蛋白质转移到ECLTM硝酸纤维素膜(Amerham生命科学，ArlingtonHeights，Illinois)上。在磷酸缓冲液中用10％干牛奶将非特异性结合位点封闭1小时。使用抗大肠杆菌表达的玉米Δ9去饱和酶的兔抗血清，利用ECLTMWestern印迹检测试剂(Amerham生命科学，ArlingtonHeights，Illinois)检测免疫反应性多肽。按照Berkeley抗体公司的标准方案产生抗体。第二抗体是连接到辣根过氧化物酶(BioRad)上的羊抗兔血清。用密度计扫描了放射自显影图并以纯化的大肠杆菌Δ9去饱和酶的相对量为基础定量。重复进行这些试验并且记录减少量的平均值。部分C表达靶定到Δ9去饱和酶mRNA上的核酶的R0玉米叶片中Δ9去饱和酶水平减少的证明高硬脂酸转基因系RPA85-15含有融合多体基因的完整拷贝。利用本文所述的方案部分纯化了R0玉米叶片中Δ9去饱和酶。如部分B所述，对活性核酶植株(RPA85-15)、无活性核酶植株RPA113-17和非转化植株(HiII)进行Western分析。通过Western分析检测了非转化系(HiII)的Δ9去饱和酶的天然变异(参见图29A)。在无活性核酶系RPA113-17中发现Δ9去饱和酶没有减少，以上所有植株都在非转化系(HiII)范围内。和对照相比，发现RPA85-15系的6个植株Δ9去饱和酶明显地减少50％(参见图29B)。同时这六个植株物的硬脂酸也增加了，并且Δ9去饱和酶mRNA减少了(如实施例28和32所述)。然而，和非转化系(HiII)和无活性核酶系(RPA113-17)相比，RPA85-15系的9个活性核酶植株的Δ9去饱和酶没有发现明显减少(图29A和B)。总之，这些结果表明RPA85-15系的6个植株的核酶活性和减少的Δ9去饱和酶有关。实施例31玉米Δ9去饱和酶的大肠杆菌表达和纯化部分A把玉米Δ9去饱和酶cDNA的成熟蛋白质编码区插入到细菌T7表达载体pET9D(Novagen公司，Madison，WI)中。成熟蛋白质编码区是从成熟蓖麻子多肽序列推测的。将32位的丙氨酸(cDNA的nt239-241)作为第一残基。这是在序列Ala.Val.Ala.Ser.Met.Thr.中发现的。通过PCR将限制性内切酶NheI位点经基因工程的方法引入到玉米的序列中，结果将GCCTCC变为GCTAGC，并把BamHI位点加入到3′端。这没有改变蛋白质的氨基酸序列。使用NheI和BamHI位点将cDNA序列克隆到pET9d载体中。将重组体质粒命名为pDAB428。在细菌中表达的玉米Δ9去饱和酶蛋白质在5′端具有另外的甲硫氨酸残基。将pDAB428质粒转化到细菌菌株BL21(Novagen公司，Madison，WI)中并且接种在LB/卡那霉素(25mg/ml)培养皿上。将菌落重悬浮在具有卡那霉素(25mg/ml)和IPTG(1mM)的10mlLB中，并在37℃下振荡培养3小时。通过在4℃下在1000xg离心10分钟收获细胞。通过冰冻和融化细胞沉淀2X溶解细胞，接着加入1ml的溶解缓冲液(10mMTris-HClpH8.0、1mMEDTA、150mMNaCl、0.1％TritonX100、100μg/mlDNA酶I、100μg/mlRNA酶A和1mg/ml溶菌酶)。在37℃下将混合物培养15分钟，然后在4℃在1000xg下离心10分钟。上清液作为可溶性蛋白质部分使用。将上清液调节到25mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)并在冰上冷却1小时。之后通过离心除去生成的絮凝沉淀。在溶液保持清晰时，再重复冰浴步骤两次。此后溶液仍保持澄清。将澄清的溶液装载到用25mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)平衡的MonoSHR10/10柱(Pharmacia)上。使用0-500mMNaCl梯度洗脱结合到柱基质的碱性蛋白1个小时(2ml/分钟；以2ml为一组分)。把推定的兴趣蛋白进行SDS-PAGE、吸印到PVDF膜上、考马斯蓝显色、切除，并且送到HarvardMicrochem进行氨基末端序列分析。把蛋白质氨基末端序列和cDNA克隆编码的蛋白质进行比较表明此蛋白质为真正的Δ9。和表达的蛋白质相关的二铁氧组分(Fox等，1993美国科学院学报90，2486-2490)的分光光度分析以及使用特异性的非血红素铁染色剂鉴定(Leong等，1992生物化学年鉴207，317-320)都确认此纯化的蛋白质是Δ9。部分B多克隆抗血清的产生通过氨基末端测序鉴定的大肠杆菌产生的Δ9蛋白质经SDS-PAGE凝胶纯化，切除，并放置到凝胶基质(Berkeley抗体公司，Richmond，CA)中以便在兔体内产生多克隆血清。通过Western分析使用ECL检测系统(Amersham公司)进行针对Δ9的抗体效价测定。部分C玉米谷粒Δ9去饱和酶的纯化蛋白质沉淀使用Warring搅拌器在含有25mM亚硫酸氢钠和2.5％聚乙烯吡咯烷酮的25mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中匀浆后纯化玉米谷粒的Δ9。通过纱布过滤粗制的匀浆，离心(10,000xg)0.25小时并且再一次用纱布过滤上清液。有时，经饱和硫酸铵沉淀(先20％v/v然后80％v/v沉淀)分级分离上清液。通过加入50％聚乙二醇溶液(mw＝8000)至终浓度为5和25％v/v来分级分离由高油种质中获得的提取物。在所有的情况下，以80％硫酸铵或25％聚乙二醇沉淀出Δ9蛋白，然后在25mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)将所得的沉淀进行充分透析。阳离子交换层析通过离心澄清上述的已溶解的沉淀物质，并加入到在25mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)中平衡的MonoSHR10/10柱上。充分洗涤柱后，用0-500mMNaCl梯度洗脱结合在柱基质上的碱性蛋白1小时(2ml/分钟以2ml为一组分)。一般来说，通过酶和Western分析测定在260和350mMNaCl之间洗脱出的Δ9蛋白。透析后，通过酰基载体蛋白(ACP)-琼脂糖和苯基superose层析将该物质进一步分级分离。酰基载体蛋白-琼脂糖层析ACP从西格玛化学公司购得，并且在连接到小珠上之前于pH4.1下经沉淀纯化(Rock和Cronan.1981，生物化学杂志，254，7116-7122)。在包装插入物中，ACP-琼脂糖基本上如Pharmacia，Inc.的说明书中所述由把100mgACP共价结合到溴化氰激活的琼脂糖4B小珠上制备。在连接和用甘氨酸封阻剩余位点后，将ACP-琼脂糖材料装填进HR5/5柱(Pharmacia，Inc.)中，并在25mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中平衡。然后将以上鉴别的透析了的组分装到柱上(McKeon和Stumpf，1982生物化学杂志257，12141-12147；Thompson等，1991美国科学院学报88，2578-2582)。在充分洗涤柱后，采用1MNaCl洗脱ACP结合蛋白质。酶分析和western分析和接下来的氨基末端测序表明流出液含有Δ9蛋白质。从玉米纯化的Δ9蛋白质经SDS-PAGE分析确定具有大约38kDa的分子量(Hames，1981蛋白质的凝胶电泳实用方法，编者HamesBD和Rickwood，D.，IRL出版社，牛津)。苯基琼脂糖层析将含有从ACP-琼脂糖柱获得的Δ9的组分调节至0.4M硫酸铵(25mM磷酸钠，pH7.0)，并且加到Phamacia苯基琼脂糖柱上(HR10/10)。蛋白质经2毫升/分钟的1小时梯度(0.4-0.0M硫酸铵)洗脱。通过酶分析和western分析测定时，Δ9蛋白质典型地在60-30mM硫酸铵之间洗脱。实施例32作为用Δ9去饱和酶核酶转化植物的结果叶片中硬脂酸增加的证据部分A用于测定植物组织中硬脂酸水平的方法。从植物组织抽提和酯化脂肪酸的方法从一种描述过的方法改进(Browse等，1986，分析生物化学，152，141-145)。将1至20毫克的植物组织放置在Pyrex13mm螺旋塞试管中。在加入1毫升HCl甲醇溶液(Supelco，Bellefonte)后，用氮气吹试管并密封。将试管在80℃下加热1小时并使其冷却。在HCl甲醇溶液存在下的加热导致脂肪酸的抽提和酯化。通过以己烷抽提从反应混合物除去脂肪酸甲酯。加入1毫升己烷和0.9％(W/V)NaCl，接着剧烈振荡试管。在2000rpm下离心试管5分钟后，移出上部己烷层，用于脂肪酸甲酯分析。通过将1微升样品注射到HewlettPackard(Wilmington，DE)II系5890型气相层析仪中进行分析，该层析仪装备有火焰电离检测器和J&WScientific(Folsom，CA)DB-23柱。炉温在操作过程中是150℃，载气(氦)流速是80cm/秒，操作时间是20分钟。该条件使得可以分离5种兴趣脂肪酸甲酯C160，棕榈酸甲酯；C180，硬脂酸甲酯；C181，油酸甲酯；C182，亚油酸甲酯；和C183，亚麻酸甲酯。用HewlettPackardII系3396型积分仪和PENelson(PerkinElmer，Norwalk，CT)数据收集系统进行数据的收集和分析。样品中每一种脂肪酸的百分比直接从数据收集系统的读数取得。每一种脂肪酸的数量用标准物(Matreya，PleasantGap，PA)的峰面积计算，所说标准物由已知量的五种已知脂肪酸甲酯组成。所计算的量用来估计在样品中由五种脂肪酸代表的总鲜重的百分比。在抽提和酯化过程期间不调整丧失的脂肪酸。在进行抽提和酯化过程(没有组织存在)后，标准样品的回收率在90％到100％范围内，取决于样品原始的量。植物组织在抽提混合物中的存在对已知量的标准物的同收没有任何影响。部分B由于引入Δ9去饱和酶核酶在叶片中增加硬脂酸的证明。如部分A所述试验个体植物叶片组织的硬脂酸。试验了用活性Δ9去饱和酶核酶(RPA85、RPA114、RPA118)转化的35个系的428种植物和用Δ9去饱和酶非活性核酶(RPA113、RPA115、RPA119)转化的31个系的406种植物。表XI总结了获得的这些植物中的硬脂酸水平的结果。7％的活性系的植物具有高于3％的硬脂肪酸水平，2％具有高于5％的水平。仅有3％的非活性系的植物具有高于3％的硬脂肪酸水平。2％的对照植物的叶片具有高于3％的硬脂肪酸水平。对照包括49种非转化的植物和73种用与Δ9去饱和酶不相关的基因转化的植物。没有非活性系植物和对照植物具有高于4％的硬脂酸。以活性Δ9去饱和酶核酶RPA85转化的两个系产生许多植物，它们显示出叶片的硬脂酸增加。RPA85-06系15个植物中的6个测得具有在3和4％之间的硬脂酸水平，约是对照平均值的2倍(图30)。对照植物(122种植物)的平均硬脂肪酸含量是1.69％(SD+/-0.49％)。RPA85-06系的平均硬脂酸含量是2.86％(+/-0.57％)。RPA85-15系15个植物中的6个测得具有高于对照平均水平约4倍的硬脂酸水平(图31)。RPA85-15系平均叶片硬脂肪酸含量是3.83％(+/-2.53)。当重复对RPA85-15植物进行叶片分析时，以前已证明具有正常硬脂酸水平的植物叶片中的硬脂酸水平仍保持正常，具有高硬脂酸的植物叶片被再次发现具有高硬脂酸含量(图31)。在图32和33中显示了用非活性的Δ9去饱和酶核酶RPA113转化的两个系的植物叶片中的硬脂酸水平。RPA113-06具有硬脂酸含量为3％或更高的3种植物。RPA113-06系的叶片的平均硬脂酸含量水平是2.26％(+/-0.65)。RPA113-17没有叶片硬脂酸含量大于3％的植物。RPA113-17系的平均叶片硬脂酸含量是1.76％(+/-0.29％)。图34显示了15种对照植物的叶片的硬脂酸含量。这15种对照植物的平均硬脂肪酸含量是1.70％(+/-0.6％)。当与对照和非活性的Δ9去饱和酶核酶数据比较时，在RPA85-06和RPA85-15中获得的硬脂肪酸含量的结果说明由于引入Δ9去饱和酶核酶增加了硬脂酸含量。实施例33高硬脂酸性状在叶片中的遗传部分A高硬脂酸植物后代的硬脂酸水平的结果。如本文描述，使RPA85-15系植物授粉。在授粉后20天，从这些RPA85-15植物的未成熟谷粒上切下合子胚，并且如本文的描述置于管中培养基上供再生苗的生长。在植物转移到温室之后，对叶片组织进行脂肪酸分析。图35显示了一种杂交的、自体受精的RPA85-15.07的10种不同植物叶片的硬脂酸水平。50％植物具有高的叶片硬脂酸，50％的具有正常的叶片硬脂酸。表XII显示了5种不同杂交的RPA85-15植物的结果。具有高硬脂酸的植物的数量在20至50％的范围内。部分B说明在表达针对Δ9去饱和酶mRNA的核酶的下一代(R1)玉米叶片中Δ9去饱和酶水平降低的结果。在显示高硬脂酸含量(见以上部分A)的下一代玉米植物中，采用本文描述的方案从R1玉米叶片部分纯化Δ9去饱和酶。对几种高硬脂酸植物进行Western分析。在下一代植物的叶片中，在具有高硬脂酸含量的植物中观察到Δ9去饱和酶降低40-50％(图36)。该降低与R0玉米叶片差不多。这一降低在与RPA85-15花粉杂交的QQ414植物或者自交或近交的RPA85-15植物中观察到。因此，这说明编码所述核酶的基因是可遗传的。实施例34采用反义Δ9去饱和酶在植物组织中增加硬脂酸部分A用于培养玉米体胚的方法。本文已描述了玉米胚发生愈伤组织的产生和再生。体胚形成大部分这类胚发生愈伤组织。体胚在愈伤组织中连续形成，因为愈伤组织每两周转移一次。体胚在胚发生愈伤组织中连续增殖但是通常保持在胚胎发育的早期阶段，这是由于在培养基中含有2，4-D。体胚再生为苗，因为愈伤组织经历本文所描述的再生过程。体胚在再生期间形成根和芽，并且终上胚发育。通过特定培养基处理，使体胚作为种子胚发育，即，超越见于胚胎发生愈伤组织的早期发育阶段并不再再生。这一培养基处理包含把胚胎发生愈伤组织转移到Murashige和Skoog培养基(MS；Murashige和Skoog于1962年描述)中，该培养基含6％(W/V)蔗糖并不含有植物激素。将愈伤组织在具有6％蔗糖的MS培养基上培养7天，然后将体胚单个地转移到具有6％蔗糖和10μM脱落酸(ABA)的MS培养基中。在ABA培养基上培养3到7天后，如本文的描述测定体胚的脂肪酸组成。将在上述培养基上培养的体胚的脂肪酸组成与胚发生愈伤组织和授粉后12天的玉米合子胚的脂肪酸组成比较(表XIII)。体胚的脂肪酸组成不同于胚发生愈伤组织的脂肪酸组成。胚发生愈伤组织具有较高百分比的C160和C183，以及较低百分比的C181和C182。当与体胚比较时，胚发生愈伤组织由鲜重所代表的脂类百分比不同；0.4％对4.0％。合子胚和体胚的脂肪酸组成非常相似，它们的由鲜重所代表的脂类百分比几乎相同。得到的结论是，以上描述的体胚培养系统将是用于试验某些基因对玉米发育胚中脂类合成影响的有用体外系统。部分B作为引入反义Δ9去饱和酶基因的结果在玉米体胚中硬脂酸的增加。采用本文描述的方法从用pDAB308/pDAB430转化的胚发生愈伤组织产生体胚。测定16个不同系的体胚的脂肪酸组成。发现两个系308/430-12和308/430-15产生具有高水平的硬脂酸的体胚。图37和38比较了这两个系体胚的硬脂酸含与对照系体胚的硬脂酸含量。除了它们未被转化外，对照系来自与转化系所来源的系相同的系，对308/430-12系而言，体胚中的硬脂酸范围在1至23％，而对照的范围在0.5至3％。对308/430-15系而言，体胚中的硬脂酸范围在2至15％，而对照的范围在0.5至3％。在两种转化系中，50％以上的体胚具有高于对照范围的硬脂酸水平。这些结果说明反义Δ9去饱和酶基因能够用来在玉米体胚中提高硬脂酸水平。部分C由于引入反义Δ9去饱和酶基因在叶片中增加硬脂酸的证明。将308/430-12和308/430-15系的胚发生培养物用于再生植物。采用以前描述的方法分析这些植物叶片的脂肪酸组成。从308/430-15培养物仅获得4个植物，这些植物的叶片的硬脂酸水平正常，为1-2％。308/430-12系植物的叶片中的硬脂酸水平显示在图39中。在308/430-12系植物中，叶片中的硬脂酸水平在1到13％的范围内。308/430-12系约30％的植物具有超过在对照中所观察到的范围(1-2％)的硬脂酸水平。这些结果表明通过引入反义Δ9去饱和酶基因可以提高玉米叶片中硬脂酸水平。＂反义＂意指通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白质核酸；Egholm等，1993，自然，365，566)相互作用结合到RNA(靶RNA)上并且改变靶RNA活性(综述见Stein和Cheng，1993，科学，261，1004)的非酶促核酸分子。实施例35玉米汇集淀粉样品和单个谷粒直链淀粉含量的测定用修改的Hovenkamp-Hermelink等的方法(土豆研究31241-246)测定直链淀粉含量。对于汇集淀粉样品，将10mg到100mg淀粉溶解到在塑料培养管中的5ml45％高氯酸中。不时涡流混合该溶液。1小时后，用水将0.2毫升淀粉溶液稀释至10毫升。将0.4毫升稀释的溶液与0.5毫升稀释的Lugol’s溶液(Sigma)在1毫升小池中混合。立即获取在618nm和550nm的读数，并计算R比率(618nm/550nm)。采用从土豆直链淀粉和玉米支链淀粉(Sigma，St.Louis)产生的标准的方程式P(直链淀粉的百分比)＝(4.5R-2.6)/(7.3-3R)，测定直链淀粉的含量。对于冰冻的单个谷粒样品，除了在45％高氯酸中抽提20分钟而不是1小时外，采用以上相同的方法。实施例36淀粉纯化和颗粒结合淀粉合酶(GBSS)测定淀粉的纯化和接下来的GBSS活性测定的方法从Shure等(细胞，35225-233，1983)和Nelson等(植物生理学，62383-386，1978)的方法修改而来。将玉米谷粒在2倍体积的(v/w)50mMTris-HCl，pH8.0，10mM乙二胺四乙酸中匀浆，并经120μm尼龙膜过滤。然后将该材料在5000g下离心2分钟。弃去上清液。通过重悬于水中并离心除去上清液洗涤沉淀3次。在洗涤之后，淀粉通过20μm尼龙膜过滤并离心。然后冷冻干燥沉淀并储存在-20℃下直到用于活性测定。标准的GBSS反应混合物包含在总体积200μl中的0.2MTricine，pH8.5、25mM谷胱甘肽、5mM乙二胺四乙酸、1mM14CADPG(6nci/μmol)以及10mg淀粉。反应在37℃下进行5分钟，并且通过加入200μl0.1MKCl中的70％乙醇(V/V)终止反应。离心该材料，并除去在上清液中的未掺入的ADPG。以相同的方式用1毫升水洗涤沉淀4次。在洗涤后，将沉淀悬浮在500微升水中，并置于闪烁管中，经Beckman(Fullerton，CA)闪烁计数器计数所掺入的ADPG。以每分钟掺入到每毫克淀粉中的ADPG的皮摩尔数给出比活性。实施例37反义GBSS植物的分析由于R2种子的分离，应当分析单个谷粒的直链淀粉含量以鉴别表型。由于在这种研究中产生大量的样品，因此使用两步筛选策略。在第一步骤中，从相同的穗随机取得30个谷粒，冷冻干燥并均化成淀粉面。对这一淀粉面进行直链淀粉测定。经统计分析鉴别具有降低的直链淀粉含量的系。在第二步骤中，进一步分析在具有降低的直链淀粉含量的系中的单个谷粒的直链淀粉含量(每穗25到50个谷粒)。将两组对照用于筛选中，一组是具有相同的遗传背景的未转化的系，另一组是因分离而不携带转基因的转化的系(Southern分析阴性系)。在汇集淀粉水平上测定代表16个转化事件的81个系。在这些系中，鉴定出经统计分析具有明显降低的直链淀粉含量的6个系供进一步的单个谷粒分析。有一个系即308/425-12.2.1，显示出明显降低的直链淀粉含量(图40)。分析CQ806(一种常规的玉米近交系)的25种单个谷粒。CQ806的直链淀粉含量在24.4％至32.2％的范围内，平均为29.1％。直链淀粉含量的单个谷粒分布稍微向较低直链淀粉含量倾斜。分析了308/425-12.2.1.1的49个单个谷粒。倘若308/425-12.2.1.1来自半合子个体的自我授粉，则预期的分布将由以相等的频率存在的4个明显不同的遗传类别组成，因为胚乳是三倍体组织。这4个遗传类别由携带0、1、2和3个拷贝的反义构建体的个体组成。如果存在转基因的大剂量的作用，则直链淀粉含量的分布将是四种形式的。形成的分布的一种形式应该是与非转基因亲本不能区别的。如果没有转基因剂量作用(携带1、2或3个拷贝的转基因的个体是表型上等同的)，则分布应该是两种形式的，其中之一与亲本相同。包含在这些形式中的个体的数量应该是转基因亲本3∶1。308/425-12.2.1.1的分布明显是三种形式的。中心形式大约是任一其它形式的两倍。两种远侧形式大小大约相等。检验了对1∶2∶1比例的拟合优度，拟合良好。说明具有最高直链淀粉含量的形式与非转基因亲本相同的进一步的证据是可获得的。这采用判别式分析进行。将CQ806和308/425-12.2.1.1数据组结合起来进行这种分析。用于进行分析的距离量度仅采用直链淀粉含量计算。在所有检验中都采用个体分析所得出的估计方差。没有采用汇集方差。检验原始数据供再分类。根据判别式分析，具有最高直链淀粉含量的308/425-12.2.1.1分布的整个形式将更适当地分类为亲本。这有力地证实了这种分布形式属亲本。在剩下的两种形式中，中心形式约是最低直链淀粉含量形式的大小的两倍。如果中心形式包括两种遗传类型(具有1或2个拷贝的反义构建体的个体)，则它是所预期的。因此，具有最低直链淀粉含量的形式代表反义构建体充分纯合(3个拷贝)的那些个体。检验2∶1比率，根据数据不能排除该比例。这种分析表明在308/425-12.2.1.1中起作用的反义GBSS基因使玉米谷粒直链淀粉含量达到剂量依赖性降低。实施例38核酶GBSS植物的分析用于与反义研究(实施例37)中相同的两步筛选策略分析核酶GBSS植物。在汇集淀粉水平上测定代表11个转化事件的160个系。在对照系(未转化的系和Southern阴性系两者)中，直链淀粉含量在28％至19％内变化。在携带核酶基因的所有系(Southern阳性系)中没有观察到任何明显的降低。在单个谷粒水平上进一步分析20个以上的选择的系，没有发现明显的直链淀粉降低以及分离模式。很明显，核酶未引起表型水平的任何改变。进一步测定转化系的GBSS活性(如实施例36的描述)。对各系而言，从冷冻的穗取得30个谷粒，并纯化淀粉。表XIV显示在汇集淀粉样品中代表GBSS活性一种转化事件的9个植物的结果，在汇集淀粉样品中直链淀粉含量的结果以及Southern分析的结果。将三种Southern阴性系RPA63.0283、RPA63.0236和RPA63.0219用作对照。对照系RPA63.0283、RPA63.0236和RPA63.0219的GBSS活性大约为300单位/mg淀粉。在RPA63.0211、RPA63.0218、RPA63.0209以及RPA63.0210系中，观察到GBSS活性的降低超过30％。在这一组(表XIV的从RPA63.0314到RPA63.0210)中改变的GBSS活性与Southern分析的相关性说明降低的GBSS活性由掺入到玉米基因组中的核酶基因的表达引起。采用RPA63.0306(在汇集淀粉中Southern阴性，GBSS活性正常)作为对照，进一步测定RPA63.0218系(在汇集淀粉中Southern阳性，GBSS活性降低)的单个谷粒水平上的GBSS活性。从每系取得约30个谷粒，从每个谷粒中分别纯化淀粉样品。图41清楚表明与RPA63.0306比较RPA63.0218系中的GBSS活性降低。其他实施方案在所附权利要求的范围内。表1天然存在的核酶的特征I组内含子*大小～150到大于1000个核苷酸。*需要靶序列中紧靠切割位点5’有一个U。*在切割位点5’-侧结合4-6个核苷酸。*反应机理由鸟苷的3’-OH进攻，产生具有3’-OH和5’-鸟苷的切割产物。*在某些情况下，需要附加的蛋白质辅因子以帮助折叠和保持活性结构[1]。*在这一类中有超过300个已知成员。在TetrahymenathermophilarRNA、真菌线粒体、叶绿体、噬菌体T4、蓝绿藻等中作为一种间插序列被发现。*主要的结构特征很大程度上通过种系发生比较、诱变和生物化学研究[2，3]建立。*对一种核酶建立了完全的动力框架[4，5，6，7]。*核酶折叠和底物停靠研究正在进行[8，9，10]。*重要残基的化学修饰研究完全建立[11，12]。*小的(4-6nt)结合位点可以使得这一核酶对靶RNA切割特异性过差。然而，TetrahymenaI组内含子已用于修复“缺陷”β半乳糖苷酶信息(通过将新的β-半乳糖苷酶序列连接到缺陷信息上)[13]。RNA酶PRNA(M1RNA)*大小～290至400个核苷酸。*一种遍在核糖核蛋白酶的RNA部分。*切割tRNA前体形成成熟的tRNA[14]。*反应机理可能由M2+-OH进攻，产生具有3’-OH和5’-磷酸的切割产物。*所有原核生物与真核生物中都发现RNA酶P。RNA亚单位已从细菌、酵母、啮齿动物和灵长类动物测序。*通过将外部指导序列(EGS)杂交到靶RNA上，内源RNA酶P的治疗用途是可能的[15，16]。*重要的磷酸和2’-OH接触最近被确定[17，18]。II组内含子*大小大于1000个核苷酸。*靶RNA的反式切割最近被阐明[19，20]。*序列要求未完全确定。*反应机理内部腺苷的2’-OH产生具有3’-OH和＂套索＂RNA(含有3’-5’和2’-5’支化点)的切割产物。*仅有天然核酶被证明除RNA切割和连接外参与DNA切割[21，22]。*主要的结构特征很大程度上通过种系发生比较建立[23]。*重要的2’OH接触开始被鉴别[24]。*动力学框架在建立中[25]。脉孢菌VSRNA*大小～144个核苷酸。*发夹靶RNA的反式切割最近被阐明[26]。*序列要求未完全确定。*反应机理由2’-OH进攻易切断的键的5’，产生具有2’，3’-环状磷酸和5’-OH末端的切割产物。*结合位点和结构要求未完全确定。*这一组仅1个已知成员。在脉孢菌VSRNA中发现。锤头核酶(参考文献见正文)*大小～13至40个核苷酸。*要求在紧靠切割位点5’有靶序列UH。*在切割位点的两侧结合可变数量的核苷酸。*反应机理由2’-OH进攻易切断的键的5’，产生具有2’，3’-环状磷酸和5’-OH末端的切割产物。*这一组已知14个成员。在一些用RNA作为感染体的植物病原体(拟病毒)中发现。*重要的结构特性大部分已确定，包括2种晶体结构[]。*阐明了最小连接活性(以便通过体外选择进行加工)[]。*对两种或多种核酶建立了完全的动力学框架[]。*对重要残基的化学修饰研究完全建立[]。发夹核酶*大小～50个核苷酸。*紧靠切割位点3’要求有靶序列GUC。*在切割位点的5’侧结合4-6个核苷酸，在切割位点的3’侧结合可变数量的核苷酸。*反应机理由2’-OH进攻易切断的键，产生具有2’，3’-环状磷酸和5’-OH末端的切割产物。*这一组已知3种成员。在一些用RNA作为感染体的植物病原体(烟草环斑病毒、arabis斑纹病毒和菊苣黄色色泽斑驳病毒的卫星RNA)中发现。*重要结构特征大部分已被限定[27，28，29，30]。*连接活性(除了切割活性外)使得核酶适合于经体外选择进行加工[31]。*对一种核酶建立了完全的动力学框架[32]。*开始了重要残基的化学修饰研究[33，34]。肝炎Δ病毒(HDV)核酶*大小～60个核苷酸。*阐明了靶RNA的反式切割[35]。*虽然切割位点5’不需要任何序列，结合位点和结构要求未完全确定。折叠核酶包含假角蛋白结构[36]。*反应机理由2’-OH进攻易切断的键的5’，产生具有2’，3’-环状磷酸和5’-OH末端的切割产物。*这一组仅2种已知成员。在人类HDV中发现。*HDV的环形式是活性的，并且显示出增加的核酸酶稳定性[37]。1.Mohr.G.；Caprara.M.G.；Guo，Q.；Lambowitz.A.M.Nature，370，147-150(1994).2.Michel，Francois；Westhof，Eric.Slipperysubstrates.Nat.Struct.Biol.(1994)，1(1)，5-7.3.Lisacek，Frederique；Diaz，Yolande；Michel，Francois.AutomaticidentificationofgroupIintroncoresingenomicDNAsequences.J.Mol.Biol.(1994)，235(4).1206-17.4.Herschlag，Daniel；Cech.ThomasR.，CatalysisofRN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UCACCGGCAU2041829AAGGUGGUCGGCACGCC2051223ACCGGCAUCGUCAACGG2061843GCCGGCGUACGAGGAGA2071226GGCAUCGUCAACGGCAU2081871UGCAUGAUCCAGGAUCU209表IIIAnt.底物Seq.IDnt.底物Seq.ID位置No.位置No.1878UCCAGGAUCUCUCCUGG2102219CGGUAAUUUUAUAUUGC2111880CAGGAUCUCUCCUGGAA2122220GGUAAUUUUAUAUUGCG2131882GGAUCUCUCCUGGAAGG2142221GUAAUUUUAUAUUGCGA2151922GUGCUGCUCAGCCUCGG2162223AAUUUUAUAUUGCGAGU2171928CUCAGCCUCGGGGUCGC2182225UUUUAUAUUGCGAGUAA2191934CUCGGGGUCGCCGGCGG2202232UUGCGAGUAAAUAAAUG2211955CCAGGGGUCGAAGGCGA2222236GAGUAAAUAAAUGGACC2231970GAGGAGAUCGCGCCGCU2242248GGACCUGUAGUGGUGGA2251979GCGCCGCUCGCCAAGGA2262012UGAAGAGUUCGGCCUGC2272013GAAGAGUUCGGCCUGCA2282033CCCCUGAUCUCGCGCGU2292035CCUGAUCUCGCGCGUGG2302055AAACAUGUUGGGACAUC2312063UGGGACAUCUUCUUAUA2322065GGACAUCUUCUUAUAUA2332066GACAUCUUCUUAUAUAU2342068CAUCUUCUUAUAUAUGC2352069AUCUUCUUAUAUAUGCU2362071CUUCUUAUAUAUGCUGU2372073UCUUAUAUAUGCUGUUU2382080UAUGCUGUUUCGUUUAU2392061AUGCUGUUUCGUUUAUG2402082UGCUGUUUCGUUUAUGU2412085UGUUUCGUUUAUGUGAU2422086GUUUCGUUUAUGUGAUA2432087UUUCGUUUAUGUGAUAU2442094UAUGUGAUAUGGACAAG2452104GGACAAGUAUGUGUAGC2462110GUAUGUGUAGCUGCUUG2472117UAGCUGCUUGCUUGUGC2482121UGCUUGCUUGUGCUAGU2492127CUUGUGCUAGUGUAAUA2502132GCUAGUGUAAUAUAGUG2512135AGUGUAAUAUAGUGUAG2522137UGUAAUAUAGUGUAGUG2532142UAUAGUGUAGUGGUGGC2542165CACAACCUAAUAAGCGC2552168AACCUAAUAAGCGCAUG2562181CAUGAACUAAUUGCUUG2572184GAACUAAUUGCUUGCGU2582188UAAUUGCUUGCGUGUGU2592197GCGUGUGUAGUUAAGUA2602200UGUGUAGUUAAGUACCG2612201GUGUAGUUAAGUACCGA2622205AGUUAAGUACCGAUCGG2632211GUACCGAUCGGUAAUUU2642215CGAUCGGUAAUUUUAUA2652218UCGGUAAUUUUAUAUUG266表IIIB表IIIB针对GBSSmRNA的锤头核酶序列nt.位置HH核酶序列Seq.IDNo.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表IIIBnt.位置HH核酶序列Seq.IDNo.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表IIIBnt.位置HH核酶序列Seq.IDNo.970GCCCUGGUAGCUGAUGAXGAAAGAUGUUGUG364973CCGGCCCUGGCUGAUGAXGAAAGGAGAUGUU365985GGAGAAGGCGCUGAUGAXGAAACCGGCCCUG366986CGGAGAAGGCCUGAUGAXGAAAACCGGCCCU367991GUAGUCGGAGCUGAUGAXGAAAGGCGAACCG368992GGUAGUCGGACUGAUGAXGAAAAGGCGAACC369994CGGGUAGUCGCUGAUGAXGAAAGAAGGCGAA3701000CAGCUCCGGGCUGAUGAXGAAAGUCGGAGAA3711016AUCUCUCCGGCUGAUGAXGAAAGGUUCAGCU3721027GGACGACUUGCUGAUGAXGAAAUCUCUCCGG3731028AGGACGACUUCUGAUGAXGAAAAUCUCUCCG3741033AUCGAAGGACCUGAUGAXGAAACUUGAAUCU3751036GAAAUCGAAGCUGAUGAXGAAACGACUUGAA3761039GAUGAAAUCGCUGAUGAXGAAAGGACGACUU3771040CGAUGAAAUCCUGAUGAXGAAAAGGACGACU3781044CCGUCGAUGACUGAUGAXGAAAUCGAAGGAC3791045GCCGUCGAUGCUGAUGAXGAAAAUCGAAGGA3801046AGCCGUCGAUCUGAUGAXGAAAAAUCGAAGG3811049CGUAGCCGUCCUGAUGAXGAAAUGAAAUCGA3821057GGGCUUCUCGCUGAUGAXGAAAGCCGUCGAU3831085UCAUCCAGUUCUGAUGAXGAAAUCUUCCGGC3641106CGGCCUCGAGCUGAUGAXGAAAUCCCGGCCU3851109UGUCGGCCUCCUGAUGAXGAAAGGAUCCCGG3861124UGACGGUGAGCUGAUGAXGAAACCCUGUCGG3871127GGCUGACGGUCUGAUGAXGAAAGGACCCUGU3881133AGUAGGGGCUCUGAUGAXGAAACGGUGAGGA3891141CUCGGCGUAGCUGAUGAXGAAAGGGGCUGAC3901144CUCCUCGGCGCUGAUGAXGAAAGUAGGGGCU3911157UGCCGGAGAUCUGAUGAXGAAAGCUCCUCGG3921160CGAUGCCGGACUGAUGAXGAAAUGAGCUCCU3931162GGCGAUGCCGCUGAUGAXGAAAGAUGAGCUC3941169AGCCCCUGGCCUGAUGAXGAAAUGCCGGAGA3951187UGAUGUUGUCCUGAUGAXGAAAGCUCGCAGC3961196UGAGGCGCAUCUGAUGAXGAAAUGUUGUCGA3971205UGAUGCCGGUCUGAUGAXGAAAGGCGCAUGA3981214CGAUGCCGGUCUGAUGAXGAAAUGCCGGUGA3991223UGCCGUUGACCUGAUGAXGAAAUGCCGGUGA4001226CCAUGCCGUUCUGAUGAXGAAACGAUGCCGG4011241CCCACUCGCUCUGAUGAXGAAACGUCCAUGC4021270CACGGCGAUGCUGAUGAXGAAACUUGUCCCU4031274ACUUCACGGCCUGAUGAXGAAAUGUACUUGU4041285CGACACGUCGCUGAUGAXGAAACUUCACGGC4051294CACGGCCGUCCUGAUGAXGAAACACGUCGUA4061346CCGGGAGCCCCUGAUGAXGAAACCUCCGCCU4071352GGUCCACCGGCUGAUGAXGAAAGCCCGACCU4081370CCACCAGCGGCUGAUGAXGAAAUGUUCCGGU4091384CCUGCCGAUGCUGAUGAXGAAACGCCACCAG4101385GCCUGCCGAUCUGAUGAXGAAAACGCCACCA4111388CCAGCCUGCCCUGAUGAXGAAAUGAACGCCA4121421CGGCCGCCAUCUGAUGAXGAAACGUCGGGUC4131436UGAGCUGCGGCUGAUGAXGAAAUGGCGGCCG4141445CCAUCUCCAUCUGAUGAXGAAAGCUGCGGGA415表IIIBnt.位置HH核酶序列Seq.IDNo.1472CCAGCAGAACCUGAUGAXGAAAUCUGCACGU4161475UGCCCAGCAGCUGAUGAXGAAACGAUCUGCA4171476GUGCCCAGCACUGAUGAXGAAAACGAUCUGC4181501CAUGCGCUCGCUGAUGAXGAAACUUCUUCUU4191502GCAUGCGCUCCUGAUGAXGAAAACUUCUUCU4201514CGGCGCUCAUCUGAUGAXGAAAGCAUGCGCU4211534CUUGCCUGGGCUGAUGAXGAAACUUCUCCUC4221535CCUUGCCUGGCUGAUGAXGAAAACUUCUCCU4231559CGUUGAACUUCUGAUGAXGAAACCACGGCGC4241564CGCCGCGUUGCUGAUGAXGAAACUUGACCAC4251565GCGCCGCGUUCUGAUGAXGAAAACUUGACCA4261589CGCCGGCCAUCUGAUGAXGAAAUGUGGUGCG4271610UGGUGACGGCCUGAUGAXGAAAGCACGUCGG4281616AGCGGCUGGUCUGAUGAXGAAACGGCGAGCA4291627GCAGGGCUCGCUGAUGAXGAAAGCGGCUGGU4301628CGCAGGGCUCCUGAUGAXGAAAAGCGGCUGG4311643GCAGCUGGAUCUGAUGAXGAAAGGCCGCAGG4321646CCUGCAGCUGCUGAUGAXGAAAUGAGGCCGC4331666GGGCGUUCCGCUGAUGAXGAAAUCGCAUCCC4341690UCCACCGGUGCUGAUGAXGAAACGCGCAGGC4351703UGGUGUCGACCUGAUGAXGAAAGUCCACCGG4361706UGAUGGUGUCCUGAUGAXGAAACGAGUCCAC4371715UGCCUUCGAUCUGAUGAXGAAAUGGUGUCGA4381718UCUUGCCUUCCUGAUGAXGAAAUGAUGGUGU4391735GCCCAUGUGGCUGAUGAXGAAACCCGGUCUU4401736GGCCCAUGUGCUGAUGAXGAAAACCCGGUCU4411751AGUCGACGCUCUGAUGAXGAAAGGCGGCCCA4421757CGUUGCAGUCCUGAUGAXGAAACGCUGAGGC4431769CCGGCUCCACCUGAUGAXGAAACGUUGCAGU4441787CCACCUUCUUCUGAUGAXGAAACGUCCGCCG4451807GGCGCGCUGCCUGAUGAXGAAAGGUGGUGGC4461820CGACCACCUUCUGAUGAXGAAAUGGCGCGCU4471829CCGGCGUGCCCUGAUGAXGAAACCACCUUGA4481843CAUCUCCUCGCUGAUGAXGAAACGCCGGCGU4491871AGAGAUCCUGCUGAUGAXGAAAUCAUGCAGU4501878UUCCAGGAGACUGAUGAXGAAAUCCUGGAUC4511880CCUUCCAGGACUGAUGAXGAAAGAUCCUGGA4521882GCCCUUCCAGCUGAUGAXGAAAGAGAUCCUG4531922CCCCGAGGCUCUGAUGAXGAAAGCAGCACGU4541928CGGCGACCCCCUGAUGAXGAAAGGCUGAGCA4551934CGCCGCCGGCCUGAUGAXGAAACCCCGAGGC4561955CCUCGCCUUCCUGAUGAXGAAACCCCUGGCU4571970CGAGCGGCGCCUGAUGAXGAAAUCUCCUCGC4581979UCUCCUUGGCCUGAUGAXGAAAGCGGCGCGA4592012CUGCAGGCCGCUGAUGAXGAAACUCUUCAGG4602013CCUGCAGGCCCUGAUGAXGAAAACUCUUCAG4612033CCACGCGCGACUGAUGAXGAAAUCAGGGGGC4622035CACCACGCGCCUGAUGAXGAAAGAUCAGGGG4632055AAGAUGUCCCCUGAUGAXGAAACAUGUUUGC4642063UAUAUAAGAACUGAUGAXGAAAUGUCCCAAC4652065CAUAUAUAAGCUGAUGAXGAAAGAUGUCCCA4662066GCAUAUAUAACUGAUGAXGAAAAGAUGUCCC457nt.位置HH核酶序列Seq.IDNo.2068CAGCAUAUAUCUGAUGAXGAAAGAAGAUGUC4682069ACAGCAUAUACUGAUGAXGAAAAGAAGAUGU4692071AAACAGCAUACUGAUGAXGAAAUAAGAAGAU4702073CGAAACAGCACUGAUGAXGAAAUAUAAGAAG4712080ACAUAAACGACUGAUGAXGAAACAGCAUAUA4722081CACAUAAACGCUGAUGAXGAAAACAGCAUAU4732082UCACAUAAACCUGAUGAXGAAAAACAGCAUA4742085AUAUCACAUACUGAUGAXGAAACGAAACAGC4752086CAUAUCACAUCUGAUGAXGAAAACGAAACAG4762087CCAUAUCACACUGAUGAXGAAAAACGAAACA4772094UACUUGUCCACUGAUGAXGAAAUCACAUAAA4782104CAGCUACACACUGAUGAXGAAACUUGUCCAU4792110AGCAAGCAGCCUGAUGAXGAAACACAUACUU4802117UAGCACAAGCCUGAUGAXGAAAGCAGCUACA4812121ACACUAGCACCUGAUGAXGAAAGCAAGCAGC4822127UAUAUUACACCUGAUGAXGAAAGCACAAGCA4832132UACACUAUAUCUGAUGAXGAAACACUAGCAC4842135CACUACACUACUGAUGAXGAAAUUACACUAG4852137ACCACUACACCUGAUGAXGAAAUAUUACACU4862142UGGCCACCACCUGAUGAXGAAACACUAUAUU4872165AUGCGCUUAUCUGAUGAXGAAAGGUUGUGCC4882168UUCAUGCGCUCUGAUGAXGAAAUUAGGUUGU4892181CGCAAGCAAUCUGAUGAXGAAAGUUCAUGCG4902184ACACGCAAGCCUGAUGAXGAAAUUAGUUCAU4912188CUACACACGCCUGAUGAXGAAAGCAAUUAGU4922197GGUACUUAACCUGAUGAXGAAACACACGCAA4932200AUCGGUACUUCUGAUGAXGAAACUACACACG4942201GAUCGGUACUCUGAUGAXGAAAACUACACAC4952205UACCGAUCGGCUGAUGAXGAAACUUAACUAC4962211UAAAAUUACCCUGAUGAXGAAAUCGGUACUU4972215AAUAUAAAAUCUGAUGAXGAAACCGAUCGGU4982218CGCAAUAUAACUGAUGAXGAAAUUACCGAUC4992219UCGCAAUAUACUGAUGAXGAAAAUUACCGAU5002220CUCGCAAUAUCUGAUGAXGAAAAAUUACCGA5012221ACUCGCAAUACUGAUGAXGAAAAAAUUACCG5022223UUACUCGCAACUGAUGAXGAAAUAAAAUUAC5032225AUUUACUCGCCUGAUGAXGAAAUAUAAAAUU5042232UCCAUUUAUUCUGAUGAXGAAACUCGCAAUA5052236CAGGUCCAUUCUGAUGAXGAAAUUUACUCGC5062248UUUCCACCACCUGAUGAXGAAACAGGUCCAU507其中＂X＂代表HH核酶的茎II区(Hertel等，1992，核酸研究，203252)。茎II的长度可以≥2碱基对。表IV表IV针对GBSSmRNA试验的HH核酶序列nt.HH核酶序列序列位置I.D.425CGACGAAGACCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACGUUCAUGC2593CUCCCAUCUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUCUCGGACA3742GUUGUCCCUGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGUCCGUUCC4812GGUUGUUGUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGGCUCAGGA5892GAGGUAGCACCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGAGAGGGCC6913GUGGGACUGGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGUUGCUCUU7919GAUGCCGUGGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACUGGUAGUU8953UGUGGAUGCACUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAAAGCGGUCU9959AGAUGUUGUGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUGCAGAAAG10968CCUGGUAGGACUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUGUUGUGGA111016AUCUCUCCGGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGGUUCAGCU121028AGGACGACUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAAUCUCUCCG131085UCAUCCAGUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUCUUCCGGC141187UGAUGUUGUCCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGCUCGCAGC151196UGAGGCGCAUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUGUUGUCGA161226CCAUGCCGUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACGAUGCCGG171241CCCACUCGCUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACGUCCAUGC181270CACGGCGAUGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACUUGUCCCU191352GGUCCACCGGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGCCCGACCU201421CGGCCGCCAUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACGUCGGGUC211534CUUGCCUGGGCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACUUCUCCUC221715UGCCUUCGAUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAUGGUGUCGA231787CCACCUUCUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACGUCCGCCG24表VA表VAGBSS发夹核酶和底物序列nt.发夹核酶序列Seq.ID底物Seq.IDNo.位置No.48CUCCUGGCAGAAGUCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA508CGACAGCCGCCAGGAG509129CCCUGCCGAGAAGUGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA510GCACCGCCCGGCAGGG511468GUCGCCGAAGAAGCCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA512CGGCGGCCUCGGCGAC513489CGGCGGCAAGAAGCCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA514CGGCGGCCUGCCGCCG515496CCAUGGCCAGAAGCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA516CUGCCGCCGGCCAUGG517676UCUCCAGGAGAAGUGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA518CCACUGUUCCUGGAGA519737UCCCUGUAAGAAGUUCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA520GAACGGACUACAGGGA521760GCAGGCUGAGAAGCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA522CUGCGGUUCAGCCUGC5231298GCCUCCACAGAAGUCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA524CGACGGCCGUGGAGGC5251427GGGAUGGCAGAAGCCAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA526UGGCGGCCGCCAUCCC5271601GCGAGCACAGAAGCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA528GCGCCGACGUGCUCGC5291638CUGGAUGAAGAAGCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA530CUGCGGCCUCAUCCAG5311746GACGCUGAAGAAGCCCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA532GGGCCGCCUCAGCGUC5331781UUCUUGACAGAAGCCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA534CGGCGGACGUCAAGAA5352077AUAAACGAAGAAGCAUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA536AUGCUGUUUCGUUUAU537表VB表VBGBSS发夹核酶和底物序列t.位置核酶序列Seq.ID底物Seq.IDNo.No.31GUCGCCUCAGAAGGUGGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA538ACCACCCGCCGAGGCGAC53948CUCCUGGCAGAAGUCGCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA540CGCGACAGCCGCCAGGAG541105GUGGACGGAGAAGUACACACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA542GUGUACUGCUCCGUCCAC543110CACUGGUGAGAAGAGCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA544CUGCUCCGUCCACCAGUG545129CCCUGCCGAGAAGUGCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA546GCGCACCGCCCGGCAGGG547142ACGAGAUGAGAAGCCCUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA548CAGGGCUGCUCAUCUCGU549182GUGGCUAGAGAAGCCAUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA550CAUGGCGGCUCUAGCCAC551199UUGCGACGAGAAGCGACGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA552CGUCGCAGCUCGUCGCAA553219GACGCCCAAGAAGGCGCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA554CGCGCCGGCCUGGGCGUC555233GUGGACGCAGAAGGGACGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA556CGUCCCGGACGCGUCCAC557249GGCGCCGCAGAAGAACGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA558ACGUUCCGCCGCGGCGCC559283CCGACGCCAGAAGGCCCCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA560GGGGCCGGACGGCGUCGG561316GCGCGCUGAGAAGAAUGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA562GCAUUCGGACCAGCGCGC563388CGACGAGCAGAAGGAACCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA564GGUUCCCGUCGCUCGUCG565468GUCGCCGAAGAAGCCGGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA566ACCGGCGGCCUCGGCGAC567489CGGCGGCAAGAAGCCGAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA568CUCGGCGGCCUGCCGCCG569493UGGCCGGCAGAAGGCCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA570GCGGCCUGCCGCCGGCCA571496CCAUGGCCAGAAGCAGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA572GCCUGCCGCCGGCCAUGG573676UCUCCAGGAGAAGUGGGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA574ACCCACUGUUCCUGGAGA575725GUUCCAGCAGAAGGCCCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA576CGGGCCUGACGCUGGAAC577737UCCCUGUAAGAAGUUCCAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA578UGGAACGGACUACAGGGA579754UGAACCGCAGAAGGUUGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA580ACAACCAGCUGCGGUUCA581760GCAGGCUGAGAAGCAGCUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA582AGCUGCGGUUCAGCCUGC583765GCAUAGCAAGAAGAACCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA584CGGUUCAGCCUGCUAUGC585834CCCGUAUGAGAAGGAGAAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA586UUCUCCGGACCAUACGGG587882CGAGAGAGAGAAGGUGUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA588CACACCGGCCCUCUCUCG589916UGCCGUGGAGAAGGUAGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA590ACUACCAGUCCCACGGCA591947AUGCAGAAAGAAGUCUUUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA592AAAGACCGCUUUCUGCAU593982AGAAGGCGAGAAGGCCCUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA594AGGGCCGGUUCGCCUUCU595995UCCGGGUAAGAAGAGAAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA596CUUCUCCGACUACCCGGA5971134GUAGUAGGAGAAGACGGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA598ACCGUCAGCCCCUACUAC5991298GCCUCCACAGAAGUCGACACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA600GUCGACGGCCGUGGAGGC601表VB位置核酶序列Seq.ID底物Seq.IDNo.No.1372ACGCCACCAGAAGGAUGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA602ACAUCCCGCUGGUGGCGU6031415GCCAUGACAGAAGGUCCCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA604GGGACCCGACGUCAUGGC6051427GGGAUGGCAGAAGCCAUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA606CAUGGCGGCCGCCAUCCC6071441UCUCCAUGAGAAGCGGGAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA608UCCCGCAGCUCAUGGAGA6091468GCAGAACGAGAAGCACGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA610ACGUGCAGAUCGUUCUGC6111477CCGUGCCCAGAAGAACGAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA612UCGUUCUGCUGGGCACGG6131601GCGAGCACAGAAGCGCCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA614CGGCGCCGACGUGCUCGC6151620CUCGAAGCAGAAGGUGACACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA616GUCACCAGCCGCUUCGAG6171623GGGCUCGAAGAAGCUGGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA618ACCAGCCGCUUCGAGCCC6191638CUGGAUGAAGAAGCAGGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA620CCCUGCGGCCUCAUCCAG6211648UCCCCUGCAGAAGGAUGAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA622UCAUCCAGCUGCAGGGGA6231746GACGCUGAAGAAGCCCAUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA624AUGGGCCGCCUCAGCGUC6251781UUCUUGACAGAAGCCGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA626GCCGGCGGACGUCAAGAA6271918CGAGGCUGAGAAGCACGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA628ACGUGCUGCUCAGCCUCG6291923GACCCCGAAGAAGAGCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA630CUGCUCAGCCUCGGGGUC6311975CCUUGGCGAGAAGCGCGAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA632UCGCGCCGCUCGCCAAGG6332014GGCCUGCAAGAAGAACUCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA634GAGUUCGGCCUGCAGGCC6352029CGCGCGAGAGAAGGGGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA636GCCCCCUGAUCUCGCGCG6372077AUAAACGAAGAAGCAUAUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA638AUAUGCUGUUUCGUUUAU6392113CACAAGCAAGAAGCUACAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA640UGUAGCUGCUUGCUUGUG6412207AAUUACCGAGAAGUACUUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA642AAGUACCGAUCGGUAAUU643表VI表VIΔ-9去饱和酶HH核酶靶序列nt.底物Seq.IDnt.底物Seq.ID位置No.位置No.13CGCGCCCUCUGCCGCUU644319GUCCAGGUUACACAUUC64521CUGCCGCUUGUUCGUUC646320UCCAGGUUACACAUUCA64724CCGCUUGUUCGUUCCUC648326UUACACAUUCAAUGCCA64925CGCUUGUUCGUUCCUCG650327UACACAUUCAAUGCCAC65128UUGUUCGUUCCUCGCGC652338UGCCACCUCACAAGAUU65329UGUUCGUUCCUCGCGCU654346CACAAGAUUGAAAUUUU65532UCGUUCCUCGCGCUCGC656352AUUGAAAUUUUCAAGUC65738CUCGCGCUCGCCACCAG658353UUGAAAUUUUCAAGUCG65963ACACACAUCCCAAUCUC660354UGAAAUUUUCAAGUCGC66169AUCCCAAUCUCGCGAGG662355GAAAUUUUCAAGUCGCU66371CCCAAUCUCGCGAGGGC664360UUUCAAGUCGCUUGAUG66592AGCAGGGUCUGCGGCGG666364AAGUCGCUUGAUGAUUG667117GCCGCGCUUCCGGCUCC668371UUGAUGAUUGGGCUAGA669118CCGCGCUUCCGGCUCCC670377AUUGGGCUAGAGAUAAU671124UUCCGGCUCCCCUUCCC672383CUAGAGAUAAUAUCUUG673129GCUCCCCUUCCCAUUGG674386GAGAUAAUAUCUUGACG675130CUCCCCUUCCCAUUGGC676388GAUAAUAUCUUGACGCA677135CUUCCCAUUGGCCUCCA678390UAAUAUCUUGACGCAUC679141AUUGGCCUCCACGAUGG680398UGACGCAUCUCAAGCCA681154AUGGCGCUCCGCCUCAA682400ACGCAUCUCAAGCCAGU683160CUCCGCCUCAACGACGU684409AAGCCAGUCGAGAAGUG685169AACGACGUCGCGCUCUG686419AGAAGUGUUGGCAGCCA687175GUCGCGCUCUGCCUCUC688434CACAGGAUUUCCUCCCG689181CUCUGCCUCUCCCCGCC690435ACAGGAUUUCCUCCCGG691183CUGCCUCUCCCCGCCGC692436CAGGAUUUCCUCCCGGA693193CCGCCGCUCGCCGCCCG694439GAUUUCCUCCCGGACCC695228CGGCAGGUUCGUCGCCG696453CCCAGCAUCUGAAGGAU697229GGCAGGUUCGUCGCCGU698462UGAAGGAUUUCAUGAUG699232AGGUUCGUCGCCGUCGC700463GAAGGAUUUCAUGAUGA701238GUCGCCGUCGCCUCCAU702464AAGGAUUUCAUGAUGAA703243CGUCGCCUCCAUGACGU704475GAUGAAGUUAAGGAGCU705252CAUGACGUCCGCCGUCU706476AUGAAGUUAAGGAGCUC707259UCCGCCGUCUCCACCAA708484AAGGAGCUCAGAGAACG709261CGCCGUCUCCACCAAGG710505AAGGAAAUCCCUGAUGA711271ACCAAGGUCGAGAAUAA712515CUGAUGAUUAUUUUGUU713278UCGAGAAUAAGAAGCCA714516UGAUGAUUAUUUUGUUU715288GAAGCCAUUUGCUCCUC716518AUGAUUAUUUUGUUUGU717289AAGCCAUUUGCUCCUCC718519UGAUUAUUUUGUUUGUU719293CAUUUGCUCCUCCAAGG720520GAUUAUUUUGUUUGUUU721296UUGCUCCUCCAAGGGAG722523UAUUUUGUUUGUUUGGU723307AGGGAGGUACAUGUCCA724524AUUUUGUUUGUUUGGUG725313GUACAUGUCCAGGUUAC726527UUGUUUGUUUGGUGGGA727528UGUUUGUUUGGUGGGAG728857ACACUGCUCGUCACGCC729544GACAUGAUUACCGAGGA730860CUGCUCGUCACGCCAAG731545ACAUGAUUACCGAGGAA732873CAAGGACUUUGGCGACU733557AGGAAGCUCUACCAACA734874AAGGACUUUGGCGACUU735559GAAGCUCUACCAACAUA736882UGGCGACUUAAAGCUUG737567ACCAACAUACCAGACUA738883GGCGACUUAAAGCUUGC739575ACCAGACUAUGCUUAAC740889UUAAAGCUUGCACAAAU741580ACUAUGCUUAACACCCU742898GCACAAAUCUGCGGCAU743581CUAUGCUUAACACCCUC744907UGCGGCAUCAUCGCCUC745589AACACCCUCGACGGUGU746910GGCAUCAUCGCCUCAGA747598GACGGUGUCAGAGAUGA748915CAUCGCCUCAGAUGAGA749表VInt.底物Seq.IDnt.底物Seq.ID位置No.位置No.637UGGGCUGUUUGGACGAG750942AACUGCGUACACCAAGA751638GGGCUGUUUGGACGAGG752952ACCAAGAUCGUGGAGAA753680AUGGUGAUCUGCUCAAC754966GAAGCUGUUUGAGAUCG755685GAUCUGCUCAACAAGUA756967AAGCUGUUUGAGAUCGA757693CAACAAGUAUAUGUACC758973UUUGAGAUCGACCCUGA759695ACAAGUAUAUGUACCUC760986CUGAUGGUACCGUGGUC761699GUAUAUGUACCUCACUG762994ACCGUGGUCGCUCUGGC763703AUGUACCUCACUGGGAG764998UGGUCGCUCUGGCUGAC765719GGGUGGAUAUGAGGCAG7661024AAGAAGAUCUCAAUGCC767730AGGCAGAUUGAGAAGAC7681026GAAGAUCUCAAUGCCUG769742AAGACAAUUCAGUAUCU7701047CCUGAUGUUUGACGGGC771743AGACAAUUCAGUAUCUU7721048CUGAUGUUUGACGGGCA773747AAUUCAGUAUCUUAUUG7741071CAAGCUGUUCGAGCACU775749UUCAGUAUCUUAUUGGC7761072AAGCUGUUCGAGCACUU777751CAGUAUCUUAUUGGCUC7781080CGAGCACUUCUCCAUGG779752AGUAUCUUAUUGGCUCU7801081GAGCACUUCUCCAUGGU781754UAUCUUAUUGGCUCUGG7821083GCACUUCUCCAUGGUCG783759UAUUGGCUCUGGAAUGG7841090UCCAUGGUCGCGCAGAG785770GAAUGGAUCCUAGGACU7861102CAGAGGCUUGGCGUUUA787773UGGAUCCUAGGACUGAG7881108CUUGGCGUUUACACCGC789785CUGAGAAUAAUCCUUAU7901109UUGGCGUUUACACCGCC791788AGAAUAAUCCUUAUCUU7921110UGGCGUUUACACCGCCA793791AUAAUCCUUAUCUUGGU7941125CAGGGACUACGCCGACA795792UAAUCCUUAUCUUGGUU7961135GCCGACAUCCUCGAGUU797794AUCCUUAUCUUGGUUUC7981138GACAUCCUCGAGUUCCU799796CCUUAUCUUGGUUUCAU8001143CCUCGAGUUCCUCGUCG801800AUCUUGGUUUCAUCUAC8021144CUCGAGUUCCUCGUCGA803801UCUUGGUUUCAUCUACA8041147GAGUUCCUCGUCGACAG805802CUUGGUUUCAUCUACAC8061150UUCCUCGUCGACAGGUG807805GGUUUCAUCUACACCUC8061181UGACUGGUCUGUCGGGU809807UUUCAUCUACACCUCCU8101185UGGUCUGUCGGGUGAAG811813CUACACCUCCUUCCAAG8121212GCAGGACUACCUUUGCA813816CACCUCCUUCCAAGAGC8141216GACUACCUUUGCACCCU815817ACCUCCUUCCAAGAGCG8161217ACUACCUUUGCACCCUU817834GGCGACCUUCAUCUCAC8181225UGCACCCUUGCUUCAAG819835GCGACCUUCAUCUCACA8201229CCCUUGCUUCAAGAAUC821838ACCUUCAUCUCACACGG8221230CCUUGCUUCAAGAAUCA823840CUUCAUCUCACACGGGA8241237UCAAGAAUCAGGAGGCU8251292CGCUGCCUUUCAGCUGG8261494UUUGAUGUACAACCUGU8271293GCUGCCUUUCAGCUGGG8281546CAUGCCGUACUUUGUCU8291294CUGCCUUUCAGCUGGGU8301549GCCGUACUUUGUCUGUC8311303AGCUGGGUAUACGGUAG8321550CCGUACUUUGUCUGUCG8331305CUGGGUAUACGGUAGGG8341553UACUUUGUCUGUCGCUG8351310UAUACGGUAGGGACGUC8361557UUGUCUGUCGCUGGCGG8371318AGGGACGUCCAACUGUG8381571CGGUGUGUUUCGGUAUG8391331UGUGAGAUCGGAAACCU8401572GGUGUGUUUCGGUAUGU8411348GCUGCGGUCUGCUUAGA8421573GUGUGUUUCGGUAUGUU8431353GGUCUGCUUAGACAAGA8441577GUUUCGGUAUGUUAUUU8451354GUCUGCUUAGACAAGAC8461581CGGUAUGUUAUUUGAGU8471372UGCUGUGUCUGCGUUAC8481582GGUAUGUUAUUUGAGUU8491378GUCUGCGUUACAUAGGU8501584UAUGUUAUUUGAGUUGC8511379UCUGCGUUACAUAGGUC8521585AUGUUAUUUGAGUUGCU8531383CGUUACAUAGGUCUCCA8541590AUUUGAGUUGCUCAGAU8551387ACAUAGGUCUCCAGGUU8561594GAGUUGCUCAGAUCUGU8571389AUAGGUCUCCAGGUUUU8581599GCUCAGAUCUGUUAAAA8591395CUCCAGGUUUUGAUCAA8601603AGAUCUGUUAAAAAAAA8611396UCCAGGUUUUGAUCAAA8621604GAUCUGUUAAAAAAAAA863表VInt.底物Seq.ID位置No.1397CCAGGUUUUGAUCAAAU8641401GUUUUGAUCAAAUGGUC8651409CAAAUGGUCCCGUGUCG8661416UCCCGUGUCGUCUUAUA8671419CGUGUCGUCUUAUAGAG8681421UGUCGUCUUAUAGAGCG8691422GUCGUCUUAUAGAGCGA8701424CGUCUUAUAGAGCGAUA8711432AGAGCGAUAGGAGAACG8721444GAACGUGUUGGUCUGUG8731448GUGUUGGUCUGUGGUGU8741457UGUGGUGUAGCUUUGUU8751461GUGUAGCUUUGUUUUUA8761462UGUAGCUUUGUUUUUAU8771465AGCUUUGUUUUUAUUUU8781466GCUUUGUUUUUAUUUUG8791467CUUUGUUUUUAUUUUGU8801468UUUGUUUUUAUUUUGUA8811469UUGUUUUUAUUUUGUAU8821471GUUUUUAUUUUGUAUUU8831472UUUUUAUUUUGUAUUUU8841473UUUUAUUUUGUAUUUUU8851476UAUUUUGUAUUUUUCUG8861478UUUUGUAUUUUUCUGCU8871479UUUGUAUUUUUCUGCUU8881480UUGUAUUUUUCUGCUUU8891481UGUAUUUUUCUGCUUUG8901482GUAUUUUUCUGCUUUGA8911487UUUCUGCUUUGAUGUAC8921488UUCUGCUUUGAUGUACA893表VII表VIIΔ-9去饱和酶HH核酶序列nt.核酶序列Seq.IDNo.位置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表VIInt.核酶序列Seq.IDNo.位置371UCUAGCCCCUGAUGAXGAAAUCAUCAA948377AUUAUCUCCUGAUGAXGAAAGCCCAAU949383CAAGAUAUCUGAUGAXGAAAUCUCUAG950386CGUCAAGACUGAUGAXGAAAUUAUCUC951388UGCGUCAACUGAUGAXGAAAUAUUAUC952390GAUGCGUCCUGAUGAXGAAAGAUAUUA953398UGGCUUGACUGAUGAXGAAAUGCGUCA954400ACUGGCUUCUGAUGAXGAAAGAUGCGU955409CACUUCUCCUGAUGAXGAAACUGGCUU956419UGGCUGCCCUGAUGAXGAAACACUUCU957434CGGGAGGACUGAUGAXGAAAUCCUGUG958435CCGGGAGGCUGAUGAXGAAAAUCCUGU959436UCCGGGAGCUGAUGAXGAAAAAUCCUG960439GGGUCCGGCUGAUGAXGAAAGGAAAUC961453AUCCUUCACUGAUGAXGAAAUGCUGGG962462CAUCAUGACUGAUGAXGAAAUCCUUCA963463UCAUCAUGCUGAUGAXGAAAAUCCUUC964464UUCAUCAUCUGAUGAXGAAAAAUCCUU965475AGCUCCUUCUGAUGAXGAAACUUCAUC966476GAGCUCCUCUGAUGAXGAAAACUUCAU967484CGUUCUCUCUGAUGAXGAAAGCUCCUU968505UCAUCAGGCUGAUGAXGAAAUUUCCUU969515AACAAAAUCUGAUGAXGAAAUCAUCAG970516AAACAAAACUGAUGAXGAAAAUCAUCA971518ACAAACAACUGAUGAXGAAAUAAUCAU972519AACAAACACUGAUGAXGAAAAUAAUCA973520AAACAAACCUGAUGAXGAAAAAUAAUC974523ACCAAACACUGAUGAXGAAACAAAAUA975524CACCAAACCUGAUGAXGAAAACAAAAU976527UCCCACCACUGAUGAXGAAACAAACAA977528CUCCCACCCUGAUGAXGAAAACAAACA978544UCCUCGGUCUGAUGAXGAAAUCAUGUC979545UUCCUCGGCUGAUGAXGAAAAUCAUGU980557UGUUGGUACUGAUGAXGAAAGCUUCCU981559UAUGUUGGCUGAUGAXGAAAGAGCUUC982567UAGUCUGGCUGAUGAXGAAAUGUUGGU983575GUUAAGCACUGAUGAXGAAAGUCUGGU984580AGGGUGUUCUGAUGAXGAAAGCAUAGU985581GAGGGUGUCUGAUGAXGAAAAGCAUAG986589ACACCGUCCUGAUGAXGAAAGGGUGUU987598UCAUCUCUCUGAUGAXGAAACACCGUC988637CUCGUCCACUGAUGAXGAAACAGCCCA989638CCUCGUCCCUGAUGAXGAAAACAGCCC990680GUUGAGCACUGAUGAXGAAAUCACCAU991685UACUUGUUCUGAUGAXGAAAGCAGAUC992693GGUACAUACUGAUGAXGAAACUUGUUG993695GAGGUACACUGAUGAXGAAAUACUUGU994699CAGUGAGGCUGAUGAXGAAACAUAUAC995703CUCCCAGUCUGAUGAXGAAAGGUACAU996719CUGCCUCACUGAUGAXGAAAUCCACCC997730GUCUUCUCCUGAUGAXGAAAUCUGCCU998742AGAUACUGCUGAUGAXGAAAUUGUCUU999743AAGAUACUCUGAUGAXGAAAAUUGUCU1000747CAAUAAGACUGAUGAXGAAACUGAAUU1001749GCCAAUAACUGAUGAXGAAAUACUGAA1002751GAGCCAAUCUGAUGAXGAAAGAUACUG1003752AGAGCCAACUGAUGAXGAAAAGAUACU1004表VIInt.核酶序列Seq.IDNo位置754CCAGAGCCCUGAUGAXGAAAUAAGAUA1005759CCAUUCCACUGAUGAXGAAAGCCAAUA1006770AGUCCUAGCUGAUGAXGAAAUCCAUUC1007773CUCAGUCCCUGAUGAXGAAAGGAUCCA1008785AUAAGGAUCUGAUGAXGAAAUUCUCAG1009788AAGAUAAGCUGAUGAXGAAAUUAUUCU1010791ACCAAGAUCUGAUGAXGAAAGGAUUAU1011792AACCAAGACUGAUGAXGAAAAGGAUUA1012794GAAACCAACUGAUGAXGAAAUAAGGAU1013796AUGAAACCCUGAUGAXGAAAGAUAAGG1014800GUAGAUGACUGAUGAXGAAACCAAGAU1015801UGUAGAUGCUGAUGAXGAAAACCAAGA1016802GUGUAGAUCUGAUGAXGAAAAACCAAG1017805GAGGUGUACUGAUGAXGAAAUGAAACC1018807AGGAGGUGCUGAUGAXGAAAGAUGAAA1019813CUUGGAAGCUGAUGAXGAAAGGUGUAG1020816GCUCUUGGCUGAUGAXGAAAGGAGGUG1021817CGCUCUUGCUGAUGAXGAAAAGGAGGU1022834GUGAGAUGCUGAUGAXGAAAGGUCGCC1023835UGUGAGAUCUGAUGAXGAAAAGGUCGC1024838CCGUGUGACUGAUGAXGAAAUGAAGGU1025840UCCCGUGUCUGAUGAXGAAAGAUGAAG1026857GGCGUGACCUGAUGAXGAAAGCAGUGU1027860CUUGGCGUCUGAUGAXGAAACGAGCAG1028873AGUCGCCACUGAUGAXGAAAGUCCUUG1029874AAGUCGCCCUGAUGAXGAAAAGUCCUU1030882CAAGCUUUCUGAUGAXGAAAGUCGCCA1031883GCAAGCUUCUGAUGAXGAAAAGUCGCC1032889AUUUGUGCCUGAUGAXGAAAGCUUUAA1033898AUGCCGCACUGAUGAXGAAAUUUGUGC1034907GAGGCGAUCUGAUGAXGAAAUGCCGCA1035910UCUGAGGCCUGAUGAXGAAAUGAUGCC1036915UCUCAUCUCUGAUGAXGAAAGGCGAUG1037942UCUUGGUGCUGAUGAXGAAACGCAGUU1038952UUCUCCACCUGAUGAXGAAAUCUUGGU1039966CGAUCUCACUGAUGAXGAAACAGCUUC1040967UCGAUCUCCUGAUGAXGAAAACAGCUU1041973UCAGGGUCCUGAUGAXGAAAUCUCAAA1042986GACCACGGCUGAUGAXGAAACCAUCAG1043994GCCAGAGCCUGAUGAXGAAACCACGGU1044998GUCAGCCACUGAUGAXGAAAGCGACCA10451024GGCAUUGACUGAUGAXGAAAUCUUCUU10461026CAGGCAUUCUGAUGAXGAAAGAUCUUC10471047GCCCGUCACUGAUGAXGAAACAUCAGG10481048UGCCCGUCCUGAUGAXGAAAACAUCAG10491071AGUGCUCGCUGAUGAXGAAACAGCUUG10501072AAGUGCUCCUGAUGAXGAAAACAGCUU10511080CCAUGGAGCUGAUGAXGAAAGUGCUCG10521081ACCAUGGACUGAUGAXGAAAAGUGCUC10531083CGACCAUGCUGAUGAXGAAAGAAGUGC10541090CUCUGCGCCUGAUGAXGAAACCAUGGA10551102UAAACGCCCUGAUGAXGAAAGCCUCUG10561108GCGGUGUACUGAUGAXGAAACGCCAAG10571109GGCGGUGUCUGAUGAXGAAAACGCCAA10581110UGGCGGUGCUGAUGAXGAAAAACGCCA10591125UGUCGGCGCUGAUGAXGAAAGUCCCUG10601135AACUCGAGCUGAUGAXGAAAUGUCGGC1061表VIInt.核酶序列Seq.IDNo位置1138AGGAACUCCUGAUGAXGAAAGGAUGUC10621143CGACGAGGCUGAUGAXGAAACUCGAGG10631144UCGACGAGCUGAUGAXGAAAACUCGAG10641147CUGUCGACCUGAUGAXGAAAGGAACUC10651150CACCUGUCCUGAUGAXGAAACGAGGAA10661181ACCCGACACUGAUGAXGAAACCAGUCA10671185CUUCACCCCUGAUGAXGAAACAGACCA10681212UGCAAAGGCUGAUGAXGAAAGUCCUGC10691216AGGGUGCACUGAUGAXGAAAGGUAGUC10701217AAGGGUGCCUGAUGAXGAAAAGGUAGU10711225CUUGAAGCCUGAUGAXGAAAGGGUGCA10721229GAUUCUUGCUGAUGAXGAAAGCAAGGG10731230UGAUUCUUCUGAUGAXGAAAAGCAAGG10741237AGCCUCCUCUGAUGAXGAAAUUCUUGA10751292CCAGCUGACUGAUGAXGAAAGGCAGCG10761293CCCAGCUGCUGAUGAXGAAAAGGCAGC10771294ACCCAGCUCUGAUGAXGAAAAAGGCAG10781303CUACCGUACUGAUGAXGAAACCCAGCU10791305CCCUACCGCUGAUGAXGAAAUACCCAG10801310GACGUCCCCUGAUGAXGAAACCGUAUA10811318CACAGUUGCUGAUGAXGAAACGUCCCU10821331AGGUUUCCCUGAUGAXGAAAUCUCACA10831348UCUAAGCACUGAUGAXGAAACCGCAGC10841353UCUUGUCUCUGAUGAXGAAAGCAGACC10851354GUCUUGUCCUGAUGAXGAAAAGCAGAC10861372GUAACGCACUGAUGAXGAAACACAGCA10871378ACCUAUGUCUGAUGAXGAAACGCAGAC10881379GACCUAUGCUGAUGAXGAAAACGCAGA10891383UGGAGACCCUGAUGAXGAAAUGUAACG10901387AACCUGGACUGAUGAXGAAACCUAUGU10911389AAAACCUGCUGAUGAXGAAAGACCUAU10921395UUGAUCAACUGAUGAXGAAACCUGGAG10931396UUUGAUCACUGAUGAXGAAAACCUGGA10941397AUUUGAUCCUGAUGAXGAAAAACCUGG10951401GACCAUUUCUGAUGAXGAAAUCAAAAC10961409CGACACGGCUGAUGAXGAAACCAUUUG10971416UAUAAGACCUGAUGAXGAAACACGGGA10981419CUCUAUAACUGAUGAXGAAACGACACG10991421CGCUCUAUCUGAUGAXGAAAGACGACA11001422UCGCUCUACUGAUGAXGAAAAGACGAC11011424UAUCGCUCCUGAUGAXGAAAUAAGACG11021432CGUUCUCCCUGAUGAXGAAAUCGCUCU11031444CACAGACCCUGAUGAXGAAACACGUUC11041448ACACCACACUGAUGAXGAAACCAACAC11051457AACAAAGCCUGAUGAXGAAACACCACA11061461UAAAAACACUGAUGAXGAAAGCUACAC11071462AUAAAAACCUGAUGAXGAAAAGCUACA11081465AAAAUAAACUGAUGAXGAAACAAAGCU11091466CAAAAUAACUGAUGAXGAAAACAAAGC11101467ACAAAAUACUGAUGAXGAAAAACAAAG11111468UACAAAAUCUGAUGAXGAAAAAACAAA11121469AUACAAAACUGAUGAXGAAAAAAACAA11131471AAAUACAACUGAUGAXGAAAUAAAAAC11141472AAAAUACACUGAUGAXGAAAAUAAAAA11151473AAAAAUACCUGAUGAXGAAAAAUAAAA11161476CAGAAAAACUGAUGAXGAAACAAAAUA11171478AGCAGAAACUGAUGAXGAAAUACAAAA1118表VIInt.核酶序列Seq.IDNo.位置1479AAGCAGAACUGAUGAXGAAAAUACAAA11191480AAAGCAGACUGAUGAXGAAAAAUACAA11201481CAAAGCAGCUGAUGAXGAAAAAAUACA11211482UCAAAGCACUGAUGAXGAAAAAAAUAC11221487GUACAUCACUGAUGAXGAAAGCAGAAA11231488UGUACAUCCUGAUGAXGAAAAGCAGAA11241494ACAGGUUGCUGAUGAXGAAACAUCAAA11251546AGACAAAGCUGAUGAXGAAACGGCAUG11261549GACAGACACUGAUGAXGAAAGUACGGC11271550CGACAGACCUGAUGAXGAAAAGUACGG11281553CAGCGACACUGAUGAXGAAACAAAGUA11291557CCGCCAGCCUGAUGAXGAAACAGACAA11301571CAUACCGACUGAUGAXGAAACACACCG11311572ACAUACCGCUGAUGAXGAAAACACACC11321573AACAUACCCUGAUGAXGAAAAACACAC11331577AAAUAACACUGAUGAXGAAACCGAAAC11341581ACUCAAAUCUGAUGAXGAAACAUACCG11351582AACUCAAACUGAUGAXGAAAACAUACC11361584GCAACUCACUGAUGAXGAAAUAACAUA11371585AGCAACUCCUGAUGAXGAAAAUAACAU11381590AUCUGAGCCUGAUGAXGAAACUCAAAU11391594ACAGAUCUCUGAUGAXGAAAGCAACUC11401599UUUUAACACUGAUGAXGAAAUCUGAGC11411603UUUUUUUUCUGAUGAXGAAACAGAUCU11421604UUUUUUUUCUGAUGAXGAAAACAGAUC1143其中＂X＂代表HH核酶茎II区(Hertel等，1992，核酸研究203252)茎II长度可以≥2碱基对。表VIII表VIIIΔ-9去饱和酶发夹核酶和底物序列nt.核酶Seq.ID底物Seq.ID位置No.No.14GAACAAGCAGAAGAGGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1144GCCCUCUGCCGCUUGUUC114517AACGAACAAGAAGCAGAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1146CUCUGCCGCUUGUUCGUU1147108GGAAGCGCAGAAGCCGCCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1148GGCGGCGGCCGCGCUUCC1149120GGAAGGGGAGAAGGAAGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1150GCUUCCGGCUCCCCUUCC1151155GUCGUUGAAGAAGAGCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1152GCGCUCCGCCUCAACGAC1153176CGGGGAGAAGAAGAGCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1154GCGCUCUGCCUCUCCCCG1155186CGGCGAGCAGAAGGGAGAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1156UCUCCCCGCCGCUCGCCG1157189GGGCGGCGAGAAGCGGGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1158CCCCGCCGCUCGCCGCCC1159196CGGCGGCGAGAAGCGAGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1160GCUCGCCGCCCGCCGCCG1161200GCGGCGGCAGAAGGCGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1162GCCGCCCGCCGCCGCCGC1163203GCGGCGGCAGAAGCGGGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1164GCCCGCCGCCGCCGCCGC1165206GCUGCGGCAGAAGCGGCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1166CGCCGCCGCCGCCGCAGC1167209GCUGCUGCAGAAGCGGCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1168CGCCGCCGCCGCAGCAGC1169235AUGGAGGCAGAAGCGACGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1170CGUCGCCGUCGCCUCCAU1171253GUGGAGACAGAAGACGUCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1172GACGUCCGCCGUCUCCAC1173256UUGGUGGAAGAAGCGGACACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1174GUCCGCCGUCUCCACCAA1175406CACUUCUCAGAAGGCUUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1176CAAGCCAGUCGAGAAGUG1177442GAUGCUGGAGAAGGGAGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1178CCUCCCGGACCCAGCAUC1179508AAAUAAUCAGAAGGGAUUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1180AAUCCCUGAUGAUUAUUU1181570UAAGCAUAAGAAGGUAUGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1182CAUACCAGACUAUGCUUA1183625ACAGCCCAAGAAGUGGGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1184CCCCACUGCCUGGGCUGU1185634CUCGUCCAAGAAGCCCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1186CUGGGCUGUUUGGACGAG1187655UUCUCCUCAGAAGUCCAUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1188AUGGACUGCUGAGGAGAA1189681ACUUGUUGAGAAGAUCACACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1190GUGAUCUGCUCAACAAGU1191726UCUUCUCAAGAAGCCUCAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1192UGAGGCAGAUUGAGAAGA1193853GCGUGACGAGAAGUGUUCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1194GAACACUGCUCGUCACGC1195916CGCUUCUCAGAAGAGGCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1196CGCCUCAGAUGAGAAGCG1197表VIIInt.核酶Seq.ID底物Seq.ID位置No.No.963CGAUCUCAAGAAGCUUCUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1198AGAAGCUGUUUGAGAUCG1199979ACGGUACCAGAAGGGUCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1200CGACCCUGAUGGUACCGU12011033AUCAGGUGAGAAGGCAUUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1202AAUGCCUGCCCACCUGAU12031041CGUCAAACAGAAGGUGGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1204CCCACCUGAUGUUUGACG12051068AGUGCUCGAGAAGCUUGUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1206ACAAGCUGUUCGAGCACU12071173ACAGACCAAGAAGGCUCGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1208CGAGCCUGACUGGUCUGU12091182CUUCACCCAGAAGACCAGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1210CUGGUCUGUCGGGUGAAG12111287AGCUGAAAAGAAGCGUGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1212GCACGCUGCCUUUCAGCU12131295GUAUACCCAGAAGAAAGGACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1214CCUUUCAGCUGGGUAUAC12151339CAGACCGCAGAAGGUUUCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1216GAA4CCUGCUGCGGUCUG12171345UCUAAGCAAGAAGCAGCAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1218UGCUGCGGUCUGCUUAGA12191349CUUGUCUAAGAAGACCGCACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1220GCGGUCUGCUUAGACAAG12211364GCAGACACAGAAGGUCUUACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1222AAGACCUGCUGUGUCUGC12231483UACAUCAAAGAAGAAAAAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1224UUUUUCUGCUUUGAUGUA12251554CCGCCAGCAGAAGACAAAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1226UUUGUCUGUCGCUGGCGG12271595UUUAACAGAGAAGAGCAAACCAGAGAAACACACGUUGUGGUACAUUACCUGGUA1228UUGCUCAGAUCUGUUAAA1229表IX表IX由HH核酶产生的Δ-9去饱和酶RNA的切割切割百分比20℃26℃nt.位置10分120分10分120分1836.37.010.4511.825225.251.233.152.925920.341.324.844.027117.252.421.556.32789.925.713.333.630710.324.29.232.431316.943.023.853.432010.623.615.031.33265.714.68.017.133810.017.510.412.935310.211.310.714.73908.68.97.89.84196.310.15.810.94537.329.08.033.84847.828.96.929.25454.88.53.68.97734.511.54.48.9102411.917.113.323.8102611.612.613.117.2123723.132.413.828.6表X表IX与对照叶片比较，用活性的和非活性的核酶转化的植物叶片中的硬脂酸水平表XII来源于高硬脂酸植物杂交的高硬脂酸特性在叶片中的遗传表XIII胚胎发生愈伤组织，体胚和合子胚的脂肪酸组成的比较</tables>表XIV选择的核酸系的GBSS活性，直链淀粉含量和Southern分析结果系GBSS活性直链淀粉含量Southern(单位/mg淀粉)(％)RPA63.0283321.5±31.223.3±0.5-RPA63.0236314.6±9.227.4±0.3-RPA63.0219299.8±10.421.5±0.3-RPA63.0314440.4±17.119.1±0.8-RPA63.0316346.5±8.517.9±0.5-RPA63.0311301.5±17.419.5±0.4-RPA63.0309264.7±1921.7±0.1+RPA63.0218190.8±7.821.0±0.3+RPA63.0209203±2.422.6±0.6+RPA63.0306368.2±7.519.0±0.4-RPA63.0210195.1±722.1±0.2+权利要求1.一种具有RNA切割活性的酶促核酸分子，其中所说的核酸分子调节植物基因的表达。2.权利要求1的酶促核酸分子，其中所说的植物是单子叶植物。3.权利要求1的酶促核酸分子，其中所说的植物是双子叶植物。4.权利要求1的酶促核酸分子，其中所说的植物是裸子植物。5.权利要求1的酶促核酸分子，其中所说的植物是被子植物。6.权利要求1的酶促核酸分子，其中所说的核酸是锤头构型的。7.权利要求1的酶促核酸分子，其中所说的核酸是发夹构型的。8.权利要求1的酶促核酸分子，其中所说的核酸分子是肝炎Δ病毒、I组内含子、II组内含子、VS核酸或RNA酶P核酸构型的。9.权利要求1-8中任一项的酶促核酸，其中所说的核酸包含互补于所说基因的RNA的12至100个碱基。10.权利要求1-8中任一项的酶促核酸，其中所说的核酸包含互补于所说基因的RNA的14至24个碱基。11.权利要求6的酶促核酸，其中所说的锤头包含长度大于或等于2个碱基对的干II区。12.权利要求7的酶促核酸，其中所说的发夹包含长度在3和7个碱基对之间的干II区。13.权利要求7的酶促核酸，其中所说的发夹包含长度大于或等于2个碱基对的干IV区。14.权利要求2的酶促核酸，其中所说的单子叶植物选自玉米、水稻、小麦和大麦。15.权利要求2的酶促核酸，其中所说的双子叶植物选自canola、向日葵、红花、大豆、棉花、花生、橄榄、芝麻、萼距花属、亚麻、希蒙得木属以及葡萄。16.权利要求1的酶促核酸，其中所说的基因是在所说的植物中的脂肪酸生物合成中所涉及的基因。17.权利要求16的酶促核酸，其中所说的基因是Δ-9去饱和酶。18.权利要求16或17的酶促核酸，其中所说的植物选自玉米、canola、亚麻、向日葵、棉花、花生、红花、大豆以及水稻。19.权利要求1的酶促核酸，其中所说的基因是在所说的植物中的淀粉生物合成中所涉及的基因。20.权利要求19的酶促核酸，其中所说的基因是颗粒结合淀粉合酶。21.权利要求19或20的酶促核酸，其中所说的植物选自玉米、土豆、小麦以及木薯。22.权利要求1的酶促核酸，其中所说的基因是在咖啡因合成中所涉及的基因。23.权利要求22的酶促核酸，其中所说的基因选自7-甲基鸟苷和3-甲基转移酶。24.权利要求22或23的酶促核酸，其中所说的植物是咖啡植物。25.权利要求1的酶促核酸，其中所说的基因是在所说的植物中的尼古丁产生中所涉及的基因。26.权利要求25的酶促核酸，其中所说的基因选自N-甲基腐胺氧化酶和腐胺N-甲基转移酶。27.权利要求25或26的酶促核酸，其中所说的植物是烟草植物。28.权利要求1的酶促核酸，其中所说的基因是在所说的植物的果实成熟过程中所涉及的基因。29.权利要求28的酶促核酸，其中所说的基因选自乙烯形成酶、果胶甲基转移酶、果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、1-氨基环丙烷羧酸(ACC)-合酶以及ACC氧化酶。30.权利要求28或29的酶促核酸，其中所说的植物选自苹果、番茄、梨、梅以及桃。31.权利要求1的酶促核酸，其中所说的基因是在所说的植物的花色素形成中所涉及的基因。32.权利要求31的酶促核酸，其中所说的基因选自查耳酮合酶、查耳酮黄烷酮异构酶、苯丙氨酸氨裂合酶、脱氢黄酮醇羟化酶以及脱氢黄酮醇还原酶。33.权利要求31或32的酶促核酸，其中所说的植物选自玫瑰、矮牵牛属、菊属以及金盏花。34.权利要求1的酶促核酸，其中所说的基因是在所说的植物的木素产生中所涉及的基因。35.权利要求34的酶促核酸，其中所说的基因选自O-甲基转移酶、肉桂酰辅酶ANADPH还原酶和肉桂酰醇脱氢酶。36.权利要求34或35的酶促核酸，其中所说的植物选自烟草、白杨、杨树和松树。37.一种核酸片段，该片段包含编码玉米Δ-9去饱和酶的cDNA序列，其中所说的序列由SEQIDNO1表示。38.权利要求17的酶促核酸分子，其中所说的核酸特异性地切割表VI中限定的任何序列，其中所说核酸是锤头构型的。39.权利要求17的酶促核酸分子，其中所说核酸的特异性地切割表VIII中限定的任何序列，其中所说的核酸是发夹构型的。40.权利要求38或39的酶促核酸分子，该分子基本上由选自表VII和VIII中所示的组的一种或多种序列组成。41.权利要求20的酶促核酸分子，其中所说的核酸特异性地切割表IIIA中所限定的任何序列，其中所说的核酸是锤头构型的。42.权利要求20的酶促核酸分子，其中所说核酸特异性地切割表VA和VB中所限定的任何序列，其中所说的核酸是发夹构型的。43.权利要求41或42的酶促核酸分子，该分子基本上由选自表IIIB、IV、VA和VB中所示的组的一种或多种序列组成。44.权利要求41的酶促核酸分子，该分子基本上由SEQIDNO2-24中任一个所限定的序列组成。45.一种植物细胞，该细胞包含权利要求1-8、11-17、19-20、22-23、25-26、28-29、31-32、34-35、37-39、41-42或44中任一项的酶促核酸分子。46.一种转基因植物和其子代，它包含权利要求1-8、11-17、19-20、22-23、25-26、28-29、31-32、34-35、37-39、41-42或44中任一项的酶促核酸分子。47.一种表达载体，它包含编码权利要求1-8、11-17、19-20、22-23、25-26、28-29、31-32、34-35、37-39、41-42或44中任一项的酶促核酸分子的核酸，其编码方式允许在植物细胞内表达和/或释放该酶促核酸分子。48.一种表达载体，它包含编码权利要求1-8、11-17、19-20、22-23、25-26、28-29、31-32、34-35、37-39、41-42或44中任一项的许多酶促核酸分子的核酸，其编码方式允许在植物细胞内表达和/或释放所说的酶促核酸分子。49.一种包含权利要求47的表达载体的植物细胞。50.一种包含权利要求48的表达载体的植物细胞。51.一种转基因植物和其子代，它包含权利要求47的表达载体。52.一种转基因植物和其子代，它包含权利要求48的表达载体。53.一种植物细胞，它包含权利要求16或17的酶促核酸。54.权利要求53的植物细胞，其中所说的细胞是玉米细胞。55.权利要求53的植物细胞，其中所说的细胞是canola细胞。56.一种转基因植物和其子代，它包含权利要求16或17的酶促核酸。57.权利要求56的转基因植物和其子代，其中所说的植物是玉米植物。58.权利要求56的转基因植物和其子代，其中所说的植物是canola植物。59.一种包含权利要求19或20的酶促核酸的植物细胞。60.权利要求59的植物细胞，其中所说的细胞是玉米细胞。61.一种转基因植物和其子代，它包含权利要求19或20的酶促核酸。62.权利要求61的转基因植物和其子代，其中所说的植物是玉米植物。63.一种在植物中调节基因表达的方法，该方法包括向所说的植物施用权利要求1-8中任一项的酶促核酸分子。64.权利要求63的方法，其中所说的植物是单子叶植物。65.权利要求63的方法，其中所说的植物是双子叶植物。66.权利要求63的方法，其中所说的植物是裸子植物。67.权利要求63的方法，其中所说的植物是被子植物。68.权利要求63的方法，其中所说的基因是Δ-9去饱和酶。69.权利要求68的方法，其中所说的植物是玉米植物。70.权利要求68的方法，其中所说的植物是canola植物。71.权利要求68的方法，其中所说的基因是颗粒结合淀粉合酶。72.权利要求71的方法，其中所说的植物是玉米植物。73.权利要求47的表达载体，其中所说的载体包含a)转录起始区；b)转录终止区；c)编码至少一种所说的酶促核酸分子的基因；其中所说的基因以允许在所说的植物细胞内表达和/或释放所说的酶促分子的方式可操作地连接到所说的起始区和所说的终止区上。74.权利要求47的表达载体，其中所说的载体包含a)转录起始区；b)转录终止区；c)开放读框；d)至少编码一种所说的酶促核酸分子的基因，其中所说的基因可操作地连接到所说的开放读框的3’-末端上；其中所说的的基因以允许在所说的植物细胞内表达和/或释放所说的酶促分子的方式可操作地连接到所说的起始区、所说的开放读框和所说的终止区上。75.权利要求47的表达载体，其中所说的载体包含a)转录起始区；b)转录终止区；c)内含子；d)编码至少一种所说的酶促核酸分子的基因；其中所说的基因以允许在所说的植物细胞内表达和/或释放所说的酶促分子的方式可操作地连接到所说的起始区、所说的内含子和所说的终止区上。76.权利要求47的表达载体，其中所说的载体包含a)转录起始区；b)转录终止区；c)内含子；d)开放读框；e)编码至少一种所说的酶促核酸分子的基因，其中所说的基因可操作地连接到所说的开放读框的3’-末端上，并且，其中所说的的基因以允许在所说的植物细胞内表达和/或释放所说的酶促分子的方式可操作地连接到所说的起始区、所说的内含子、所说的开放读框和所说的终止区上。77.权利要求1的酶促核酸，其中所说的植物选自玉米、水稻、大豆、canola、苜蓿、棉花、小麦、大麦、向日葵、亚麻和花生。78.一种转基因植物，该植物包含具有RNA切割活性的酶促核酸分子，其中所说的核酸分子在所说的植物中调节基因的表达。79.权利要求78的转基因植物，其中所说的植物选自玉米、水稻、大豆、canola、苜蓿、棉花、小麦、大麦、向日葵、亚麻和花生。80.权利要求78的转基因植物，其中所说的基因是颗粒结合淀粉合酶(GBSS)。81.权利要求78的转基因植物，其中所说的基因是Δ-去饱和酶。82.权利要求78的转基因植物，其中所说的植物是用土壤杆菌属、DNA包被微粒轰击、噬菌体颈须或电穿孔转化的。83.权利要求82的转基因植物，其中所说的用DNA包被微粒轰击是用基因枪完成的。84.权利要求78或82的转基因植物，其中所说的植物包含选自chlorosulfuron、潮霉素、bar基因、溴草腈以及卡那霉素等的选择性标记。85.权利要求78或82的转基因植物，其中所说的核酸可操作地连接到启动子上，所说的启动子选自章鱼碱合成酶、胭脂氨酸合酶、manopine合成酶、花椰菜斑纹病毒(35S)；核酮糖-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚单位(ssu)、β-conglycinin、菜豆素启动子、napin、γ玉米醇溶蛋白、球蛋白、ADH启动子、热休克、肌动蛋白以及遍在蛋白。86.权利要求78的转基因植物，所说的酶促核酸分子是锤头、发夹、肝炎Δ病毒、I组内含子、II组内含子、VS核酸或RNA酶P核酸构型的。87.权利要求86的转基因植物，其中所说的具有RNA切割活性的酶促核酸以单体被编码。88.权利要求86的转基因植物，其中所说的具有RNA切割活性的酶促核酸以多体被编码。89.权利要求78的转基因植物，其中所说的编码所说的具有RNA切割活性的酶促核酸分子的核酸可操作地连接到开放读框的3’末端上。90.权利要求78的转基因植物，其中所说的基因是内源基因。91.一种转基因玉米植物，该植物以5’到3’转录方向包含在所说的植物中有功能的启动子；SEQIDNO1的编码Δ9基因的双链DNA(dsDNA)序列，其中所说的dsDNA的转录链互补于所说植物的内源RNA；在所说的植物中有功能的终止区；92.一种转基因玉米植物，该植物以5’到3’转录方向包含在所说的植物中有功能的启动子；SEQIDNO25的编码颗粒结合淀粉合酶(GBSS)基因的双链DNA(dsDNA)序列，其中所说的dsDNA的转录链互补于所说植物的内源RNA；在所说的植物中有功能的终止区；93.权利要求1的酶促核酸分子，其中所说的基因是内源基因。94.权利要求63的调节基因表达的方法，其中所说的基因是内源基因。95.图42的载体，其中所说的载体用于转化植物细胞。全文摘要一种具有RNA切割活性的酶促核酸分子,其中所说的核酸分子在植物中调节基因的表达。一种包含编码具有RNA切割活性的酶促核酸分子的核酸的转基因植物,其中所说的核酸分子在所说的植物中调节基因的表达。文档编号C12N5/10GK1196091SQ96196925公开日1998年10月14日申请日期1996年7月12日优先权日1995年7月13日发明者M·G·维克,B·E·艾丁顿,J·A·麦斯维根,P·A·O·梅尔罗,郭立宁,T·A·斯科库特,S·A·扬,O·福尔科茨,D·J·梅尔罗申请人:里伯希姆药品公司,唐艾兰科公司