专利名称：得自Curvularia verruculosa的卤过氧化物酶和编码该酶的核酸的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及Curvularia verruculosa卤过氧化物酶(haloperoxidases)和包含编码该卤过氧化物酶的核酸序列的分离的核酸片段。本发明也涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生卤过氧化物酶的方法。本发明还涉及所述卤过氧化物酶的使用方法。
相关技术的描述当过氧化氢(H2O2)存在时，卤过氧化物酶催化卤离子(X＝Cl-、Br-或I-)氧化为相应的次卤酸(hypohalous acid)(HOX)如果一个适当的亲核宿主化合物存在，次卤酸将与所述化合物反应而形成卤代化合物。卤过氧化物酶也能在缺少卤离子的情况下在某些底物上催化过氧化物酶反应， 但是当卤离子存在时，由于所述底物和次卤离子的非特异性反应，所述底物谱加宽。
卤过氧化物酶在由哺乳动物、植物、藻类、地衣、细菌和真菌产生的自然界中普遍存在。卤过氧化物酶可能是与自然产生的卤代化合物形成有关的酶。有三种类型的卤过氧化物酶，按照它们的卤离子特异性分为催化化合物的氯化、溴化和碘化的氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)，显示溴离子和碘离子特异性的溴过氧化物酶，以及单独催化碘离子的氧化的碘过氧化物酶(E.C.1.11.1.8)。
测定首先发现的卤过氧化物酶，发现其包含作为辅基或者辅因子的血红素。然而最近发现，明显也有许多非血红素卤过氧化物酶。已发现细菌卤过氧化物酶没有辅基。另外，许多其它非血红素卤过氧化物酶已显示出具有钒辅基。卤过氧化物酶包含已知包含海草溴过氧化物酶的钒辅基ire，和至少一种得自不等弯孢的真菌氯过氧化物酶类型(van Schijndel等人，1993，生物化学和生物物理学报1161249-256；Simons等人1995，欧洲生物化学杂志229；566-574；WO 95/27046)。
在当前，由于它们的潜在的工业用途广泛，卤过氧化物酶如同其它氧化还原酶一样引起了人们的兴趣。例如，已有人建议把卤过氧化物酶用作为抗微生物剂。
本发明的目的是提供新的在数量上能够进行可行的商业生产的卤过氧化物酶。
发明概述本发明涉及得自Curvularia verruculosa的分离的卤过氧化物酶，以及涉及包含编码所述Curvularia verruculosa的卤过氧化物酶的核酸序列的分离的核酸片段。本发明也提供了包含本发明的核酸片段的核酸构建体、载体和重组宿主细胞。此外，本发明还提供了产生本发明卤过氧化物酶的方法、组合物和杀灭微生物细胞或抑制微生物细胞生长的方法。
附图简要描述
图1说明锌、钒和铁对Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的活性的影响。
图2显示30℃下pH值对Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的活性的影响。
图3说明pH值为5.5时温度对Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的活性的影响。
图4显示pH值为7时温度对Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的稳定性的影响。
图5说明30℃下pH值对Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的稳定性的影响。
图6显示pH值为7时和60℃下过氧化氢浓度对Curvularia verruculosaCBS 147.63卤过氧化物酶的稳定性的影响。
图7说明由利用Curvularia verruculosa CBS 147.63基因组DNA为模板、PCR扩增具卤过氧化物酶-特异性的基因序列得到的产物的琼脂糖电泳凝胶。
图8显示以PCR-衍生的卤过氧化物酶基因片段为探针探测的Curvularia verruculosa基因组DNA的Southern印迹的放射自显影图。
图9说明用PstI加上HindIII或XhoI加上HindIII消化的卤过氧化物酶克隆的琼脂糖电泳凝胶。
图10显示编码Curvularia verruculosa卤过氧化物酶的DNA序列和推定的Curvularia verruculosa卤过氧化物酶的氨基酸序列。
图11说明Curvularia verruculosa和不等弯孢的卤过氧化物酶的氨基酸序列的序列对比。
图12显示pBANe6的限制图。
图13显示pAJ014-1的限制图。
图14显示发酵期间卤过氧化物酶产量随时间的变化时程。
发明详细描述如上所述，本发明涉及得自Curvularia verruculosa菌株的卤过氧化物酶。在优选的实施方案中，本发明涉及得自Curvularia verruculosa CBS147.63或其突变株的卤过氧化物酶，例如具有SEQ ID NO.2所描述的氨基酸序列的卤过氧化物酶。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及得自Curvularia verruculosa CBS 444.70或其突变株的卤过氧化物酶。
本发明卤过氧化物酶的物理-化学性质可以利用本领域所熟知的各种技术测定。在优选的实施方案中，本发明卤过氧化物酶包含钒辅基(参见图1)。在另一个优选的实施方案中，卤过氧化物酶的质量约在62 kDa至66 kDa之间的范围内(由质谱法测定)。在另一个优选的实施方案中，本发明卤过氧化物酶优先选择溴离子而非氯离子作为底物。在另一个优选的实施方案中，本发明卤过氧化物酶在大约4至大约11之间(优选的为大约5至大约8之间)的pH值范围内具有活性。在另一个优选的实施方案中，本发明卤过氧化物酶在大约5.25至大约6.25的范围内具有最适pH，优选的为大约5.75(参见图2)。在另一个优选的实施方案中，本发明卤过氧化物酶在50至70℃的范围内具有最适温度，更优选的为大约55-65℃，最优选的为大约60℃(参见图3)。
在另一个优选的实施方案中，本发明卤过氧化物酶在pH值为7和60℃下培养一小时之后保持至少50％活性，优选的至少80％活性(参见图4)。在另一个优选的实施方案中，本发明卤过氧化物酶在大约4至大约11之间的任一pH值和30℃下培养一小时之后保持至少50％活性，优选的至少80％活性(参见图5)。在另一个优选的实施方案中，本发明卤过氧化物酶在pH值为7和60℃下(存在0.1％的过氧化氢)培养一小时之后，保持至少50％活性，优选的至少75％活性(参见图6)。
本发明也涉及得自真菌(由M.B.Ellis于1971年在英国Surrey的联邦真菌学会的不全菌纲暗色孢科(Dematiaceous Hvphomycetes)中定义的Curvularia verruculosa的同义词)的卤过氧化物酶。弯孢属是不全菌纲暗色孢科真菌组的陆地成员。Curvularia verruculosa孢子通常被弯曲，壁变得粗糙，并通常仅有三个间隔。公众易于从许多培养物保藏中心，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和北部区域研究中心的农业研究机构专利培养物保藏中心(NRRL)获得Curvularia verruculosa菌株，例如ATCC 60943-60948、DSM 1157、CBS 147.63和CBS 444.70。
本发明也涉及被在极严格条件之下(例如在45℃下，在5 X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切的和变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交)能够与在同样条件下与SEQ ID NO.1所描述的核酸序列杂交的探针杂交的核酸序列编码的卤过氧化物酶。基因或基于该基因的寡核苷酸能够在Southern杂交中用作为探针以分离任一Curvularia verruculosa物种的同源基因。尤其是，所述探针能够用于与感兴趣的物种的基因组或cDNA杂交，随后进行标准的Southern印迹程序，以便鉴别和分离其中相应的卤过氧化物酶基因。利用本文所论及的简并探针和得自Curvulariaverruculosa物种的基因组DNA或cDNA第一链，PCR反应也能够产生Curvularia verruculosa的具卤过氧化物酶-特异性的产物，然后该产物能够用作为探针来克隆相应基因组或者cDNA。
通过利用本发明实例中所描述的方法，从公众可获得的Curvulariaverruculosa菌株能够实现从除本文那些具体实例之外的源中鉴别和分离卤过氧化物酶基因。
为了本发明的目的，术语“得自”意味着卤过氧化物酶是由特定的源，例如Curvularia verruculosa菌株，或由其中插入了来自该源的编码卤过氧化物酶的基因的细胞产生的。
本发明也包含与图10所描述的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)有至少约93％、优选约95％、更优选约97％、甚至更优选约99％的同源性的卤过氧化物酶变体，该变体定性保持本文所描述的蛋白质活性。本发明也涉及具有特定氨基酸序列(其与SEQ ID NO.2所描述的氨基酸序列的差异不超过三个氨基酸，更优选的不超过两个氨基酸，最优选的不超过一个氨基酸)的卤过氧化物酶变体。各种区别可以是氨基酸的插入或缺失或者由不同的氨基酸取代氨基酸残基。有用的取代包含那些其中已进行过保守的氨基酸取代且取代并不严重影响蛋白质活性的取代。利用保守取代意味着相同级别的氨基酸可以被该级别的任一其它氨基酸取代。例如，非极性脂族残基Ala、Val、Leu和Ile可以相互交换，碱性残基Lys和Arg，或者酸性残基Asp和Glu也可以如此。同样地，Ser和Thr彼此是保守取代，Asn和Gln也是。
本发明卤过氧化物酶可以由本领域已知的各种方法纯化，这些方法包括但不限于色谱法(例如离子交换、亲合、疏水、色谱聚焦、尺寸排阻色谱法)、电泳方法(例如制备等电聚焦(IEF))、差别溶解性(例如硫酸铵沉淀)或萃取(参见，例如，《蛋白质纯化》，J.C.Janson和Lars Ryden合编，VCHPublishers，New York，1989)。如本文所限定，＂分离的＂卤过氧化物酶是指基本上无其它非卤过氧化物酶蛋白质的卤过氧化物酶，例如(如由SDS-PAGE所测定的)，至少大约20％纯，优选的至少大约40％纯，更优选的大约60％纯，甚至更优选的大约80％纯，最优选的大约90％纯，甚至最优选的大约95％纯。核酸片段和构建体本发明也涉及包含编码本发明卤过氧化物酶的核酸序列的核酸片段和涉及包含本发明核酸片段的核酸构建体。
在优选实施方案中，核酸序列编码得自Curvularia verruculosa CBS147.63的卤过氧化物酶(例如SEQ ID NO.1所描述的核酸序列)或CBS444.70的卤过氧化物酶。本发明也包括编码具有如SEQ ID NO.2所描述的氨基酸序列的卤过氧化物酶的核酸序列，由于遗传密码子的简并该序列有别于SEQ ID NO.1。本发明核酸序列还包含本文描述的基因组序列以及相应的cDNA与RNA序列，本文所使用的词组＂核酸序列＂理解为包含所有所述包含合成DNA的变异体。
本发明也涉及包含本发明核酸片段的核酸构建体。＂核酸构建体＂一般理解为意指单链或双链的核酸分子，其从天然产生的基因中分离得到，或其曾被修饰从而包含以天然不存在的方式组合和并列的核酸片段。在优选的实施方案中，核酸构建体可操作地连接到能够指导卤过氧化物酶在合适的表达宿主中的表达的调节区域上。
本发明也提供了包含本发明核酸构建体的重组载体。在一优选的实施方案中，核酸序列可操作地连接到启动子序列上。在另一优选的实施方案中，本发明载体还包含转录终止信号和/或选择性标记。
本发明重组载体对于Curvularia verrculosa的激活形式的卤过氧化物酶基因的表达来说是有用的。有用的表达载体包含使该载体能稳定地整合入宿主细胞基因组或使该载体能在宿主细胞中进行不依赖于宿主细胞基因组的自我复制的成分，以及优选的包含一个或更多的使转化宿主细胞易于选择的表型标记。载体也包含启动子、核糖体结合部位、翻译起始信号，以及可有可无的阻抑基因、选择性标记或各种激活基因之类的控制序列。为了使所表达的蛋白质能够分泌，编码信号序列的核酸可以先于基因的编码序列插入。为了在控制序列的指导下表达，把按照本发明所利用的卤过氧化物酶基因可操作地连接到适当的读框中的控制序列上。
携带本发明核酸构建体的载体可以能够便利地利用任一由重组DNA方法产生的载体。载体的选择将典型地取决于载体将要引入其中的宿主细胞。载体可以是自我复制的载体，即作为染色体外实体(其复制独立于染色体复制)存在的载体，例如质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体。另外，载体可以是当引入到宿主细胞中时被整合入宿主细胞基因组并且与已整合入其中的染色体一道被复制的载体。载体系统可以是共同包含被整合入基因组的全部DNA的单一载体或质粒或者两个或多个载体或质粒。
在所述载体中，DNA序列应该被可操作地连接到一个合适的启动子序列上。启动子可以是任一在选择的宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，并可以得自编码或同源于或异源于宿主细胞蛋白质的基因。用于指导本发明核酸构建体转录的合适启动子的实例(尤其是在细菌宿主中)是大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyO)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子、原核β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，美国国家科学院学报753727-3731)或者tac启动子(DeBoer等，1983，美国国家科学院学报8021-25)。更多的启动子描述在“得自重组体细菌的有用蛋白质”(《科学美国人》，1980，24274-94；和Sambrook等，分子克隆，实验手册，第二版，冷泉港实验室，纽约，1989)。在酵母宿主中，有用的启动子是eno-1启动子。对于真菌宿主中的转录，有用启动子的实例是那些得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的基因的启动子。优选的启动子是TAKA-淀粉酶和glaA启动子。
本发明的载体也可以包含合适的转录终止子和可操作地连接到编码本发明的卤过氧化物酶的DNA序列上的聚腺苷酸化序列(在真核生物中)。终止和聚腺苷酸化序列可以得自与启动子相同的源。载体还可以包含使载体能够在正论及的宿主细胞中复制的DNA序列。所述序列的实例是质粒pUCl9、pACYCl77、pUBll0、pEl94、pAMBl和pIJ702的复制起点。
载体也可以包含选择性标记，例如其产物可弥补宿主细胞中缺陷的基因(例如得自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因)或具有氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性之类的抗生素抗性的基因。曲霉菌选择标记的实例包括amdS、pyrG、argB、niaD、sC、trpC和hygB(产生潮霉素抗性的标记)。在曲霉菌宿主细胞中使用的优选标记是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记。经常利用的哺乳动物标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。此外，选择可以由共转化完成，例如如WO 91/17243所描述的。
为了避免破碎细胞来获得所表达的卤过氧化物酶的必要性和减少细胞之内所表达的卤过氧化物酶的可能降解量，优选的是卤过氧化物酶基因的表达产生在细胞外分泌的产物。为此，本发明的卤过氧化物酶因此可以包含使所表达的蛋白质能够分泌进入发酵培养基中的前区(preregion)。如果需要，这个前区可以是本发明的卤过氧化物酶所产的或者由不同的前区或信号序列取代(能方便地通过取代编码各自的前区的DNA序列完成)。例如，前区可以得自曲霉菌物种的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、芽孢杆菌物种的淀粉酶基因、Rhizomucor miehei脂酶或蛋白酶基因、酿酒酵母的α-因子的基因或小牛前凝乳酶原(preprochymosin)基因。特别优选的是米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、芽孢杆菌NCIB 11837的生麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的前区。真菌宿主的有效信号序列是米曲霉TAKA淀粉酶信号、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶信号或Rhizomucor miehei脂酶信号。
用于分别连接本发明的核酸构建体、启动子、终止子和其它因子以及把它们插入到合适的包含复制所必需信息的载体中的方法均是本领域技术人员所熟知的(参见，例如，Sambrook等，同上)。
本发明也涉及包含核酸构建体或本发明的表达载体(其有利地用于本发明卤过氧化物酶的重组生产)的宿主细胞。所述细胞可以方便地由本发明的核酸构建体转化(通过把所述构建体整合入宿主染色体)。由于序列更可能稳定地保持在细胞中，因此一般认为所述整合是一个优点。所述构建体与宿主染色体的整合可以按照常规方法进行，例如通过同源或异源重组。另外，所述细胞可以由如下所描述的与不同类型宿主细胞有关的表达载体转化。
宿主细胞和载体的选择在很大程度上取决于卤过氧化物酶和它的来源。宿主细胞可以选自细菌细胞之类的原核细胞。合适细菌的实例是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、或浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌之类的革兰氏阳性菌，或者大肠杆菌之类的革兰氏阴性菌。例如通过原生质体转化或以本质上已知的方式利用感受态细胞，可以实现细菌的转化。
优选的宿主细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或优选地真菌细胞(包括酵母和丝状真菌)之类的真核生物。例如，有用的哺乳动物细胞包括CHO或COS细胞。酵母宿主细胞可以选自酵母属或裂殖酵母菌物种，例如酿酒酵母。有用的丝状真菌选自曲霉菌物种，例如米曲霉或黑曲霉。另外，尖镰孢或禾谷镰孢之类的镰孢霉属物种菌株能够用作为宿主细胞。用包括原生质体形成、原生质体转化随后以本质上已知的方式再生细胞壁的方法可以转化真菌细胞。适合于转化曲霉菌宿主细胞的方法描述在EP 238023中。转化镰孢霉属物种的合适方法为Malardier等(Malardier等，1989，基因78147-156)所描述或描述在共同未决的美国序号08/269,449中。
在特别优选的实施方案中，卤过氧化物酶基因的表达在真菌宿主细胞(如曲霉菌)中完成。将卤过氧化物酶基因连接到优选地包含米曲霉TAKA淀粉酶启动子或黑曲霉中性淀粉酶NA2启动子以及作为选择性标记的amdS或pyrG的质粒中。另外，选择性标记可以存在于一单独质粒上并用于共转化。所述质粒用于转化曲霉菌物种宿主细胞，例如按照Yelton等(Yelton等，1984，美国国家科学院学报，811470-1474)所描述的方法转化米曲霉或黑曲霉。产生本发明卤过氧化物酶的方法本发明也涉及产生本发明卤过氧化物酶的方法，该方法包括(a)发酵Curvularia verruculosa菌株以产生包含卤过氧化物酶的上清液，和(b)回收卤过氧化物酶。
本发明也涉及用于重组产生本发明卤过氧化物酶的方法，该方法包括(a)在有利于酶产生的条件之下，发酵包含含有编码卤过氧化物酶的核酸序列的核酸构建体的宿主细胞，和(b)回收卤过氧化物酶。如果表达系统分泌卤过氧化物酶到发酵培养基中，则能直接从培养基回收所述酶。如果没有分泌重组卤过氧化物酶，则从细胞溶解产物中回收所述酶。
如本文所限定，术语＂发酵＂是任一导致卤过氧化物酶的表达或分离的细胞培养方法。因此，发酵可以理解为包括在使卤过氧化物酶能够被表达或分离的条件下在合适的培养基中进行的在实验室或工业发酵罐中的摇瓶培养、小或大规模发酵(包括连续、分批、流加或固态发酵)。
所述发酵发生于合适的包含碳和氮源以及无机盐的营养培养基中，利用的是本领域已知的方法(参见，例如，Bennett，J.W.和LaSure，L.(合著)，真菌中的多基因操作，学术出版社，CA，1991)。合适的培养基是市售的或者可以按照已公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。
由上述方法所产生的卤过氧化物酶可以利用常规方法(包括但并不限于离心、过滤、喷雾-干燥、蒸发或沉淀)从发酵培养基中回收。然后，回收的蛋白质还可以由各种色谱方法(例如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱法或者是诸如此类的色谱法)纯化。用途本发明还涉及把卤离子氧化成相应的次卤酸的方法(包括在有本发明的卤过氧化物酶存在时使卤离子和过氧化氢源发生反应)。本发明也涉及卤代化合物的方法，包括在有本发明的卤过氧化物酶存在时使所述化合物、卤离子和过氧化氢源发生反应。
本发明也涉及用于杀灭微生物细胞或抑制微生物细胞生长的方法，包括在水溶液中使所述细胞与本发明的卤过氧化物酶、过氧化氢源和硫氰酸源相接触。
过氧化氢源能够是过氧化氢本身或过碳酸盐、过硼酸盐、过氧羧酸或其盐之类的过氧化物前体。此外，所述源可以是过氧化氢产生酶系统(例如氧化酶，如葡糖氧化酶、甘油氧化酶或氨基酸氧化酶)和它的底物。过氧化氢源可以以相当于大约0.001至大约10mM范围的过氧化氢浓度的浓度添加，优选的为大约0.01至1mM。
硫氰酸源可以是硫氰酸本身或其盐(例如硫氰酸钠或硫氰酸钾)。此外，如果反应发生在口部，那么硫氰酸内源于唾液。硫氰酸源可以以相当于大约0.001至大约10mM范围的硫氰酸浓度的浓度添加，优选的为大约0.01至1mM。
卤过氧化物酶可以在诸如水基涂料和个人护理产品(例如牙膏、漱口剂、护肤乳油和洗肤剂、护发和护身制剂、接触透镜和假牙清洗液)中用作为防腐剂和消毒剂。卤过氧化物酶也可以在食品加工厂和制备或供应食品的任何领域中用于清洗表面和煮器具。卤过氧化物酶也可以应用于酶促漂白，例如纸浆漂白和污点漂白(在去垢剂组合物中)。
在本发明的使用方法中，卤过氧化物酶的浓度在0.0001 HU/ml至10HU/ml的范围内是优选的，更优选的在0.001 HU/ml至1 HU/ml的范围内(如下所限定的)。
在下列实施例中本发明将得到进一步的说明，这些实施例没有任何意图限制本发明所要求的范围。
实施例实施例1Curvularia verruculosa CBS 147.63的培养使Curvularia verruculosa CBS 147.63在26℃和250rpm下在具有包含下列组分的发酵培养基的21发酵罐中生长165小时葡萄糖 15g/l酵母膏 4g/lK2HPO41g/lMgSO4·7H2O 0.5g/lVOSO4167mg/l在高压灭菌之前将培养基pH值调整至7.2。从用10ml包含0.1％吐温的已灭菌的H2O悬浮的琼脂斜面上直接接种发酵罐，其中每个摇瓶利用2.5ml悬液接种。通过离心所述全部内汤回收上清液，洗涤该上清液并利用具有10 kDa截断膜的Filtron仪器将所述上清液浓缩24倍。实施例2卤过氧化物酶分析通过混合100μl卤过氧化物酶样品(大约0.2μg/ml)和100μl的0.3 M磷酸钠pH7缓冲液-0.5 M溴化钾-0.08％酚红，添加所述溶液至10μl的0.3％的H2O2中和在595nm测量作为时间的函数的吸收作用进行微量滴定分析。
利用一氯二甲基环己二酮(Sigma M4632，在290nm，ε＝20000 M-1cm-1)作为底物的分析以如下所述过程进行。在290nm测量作为时间函数的吸收作用的减少。在0.1M磷酸钠或0.1M醋酸钠、50μM一氯二甲基环己二酮、10mM KBr/KCl和1mM H2O2中进行分析(利用大约1μg/ml浓度的卤过氧化物酶)。将1 HU定义为在pH值为5和30℃下每分钟氯化或溴化1微摩尔一氯二甲基环己二酮。通过在所给定的条件下预培养卤过氧化物酶而后用微量滴定分析测定剩余活性进行温度，pH值和H2O2稳定性实验。实施例3Curvularia verruculosa CBS 147.63的纯化将30ml从实施例1所描述的全部肉汤中浓缩的上清液装载在30mlQ-Sepharose凝胶柱(XK 16/60)(其用10mM磷酸钾pH值7.0缓冲液平衡)上，以2ml/分钟流速用300ml线性梯度为0到1M的氯化钠洗脱所述上清液。收集3ml组分，汇集、浓缩(Centricon-10，Amicon)包含卤过氧化物酶活性的组分，同时使所述组分在HiLoad Superdex 75(16/60)柱(Pharmacia)(其在50mM磷酸钠pH7.1缓冲液中平衡)上凝胶过滤，并以1ml/分钟流速用相同缓冲液洗脱该组分。收集1.5ml组分。如实施例2所描述，进行卤过氧化物酶的分析。实施例4Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的特征确定将实施例3所纯化的卤过氧化物酶在0.3M磷酸钠pH7的缓冲液(对照)中或在0.1M柠檬酸钠-10mM EDTA pH3.8的缓冲液中预处理45分钟。在预处理之后，用10mM在0.2M Tris-HCl pH7.5中的添加剂(其或者是Na3VO4、FeCl2或者是ZnCl2)把所述卤过氧化物酶处理2小时。
图1表明当用指示活性所必需的辅基存在的EDTA处理卤过氧化物酶时，卤过氧化物酶失去活性。锌或铁的添加对卤过氧化物酶的活性没有影响。然而，钒酸盐的添加导致卤过氧化物酶重新获得活性，表明所述卤过氧化物酶包含钒辅基。
所述卤过氧化物酶的Br-和Cl-的最适pH值和特异性在0.1M的包含50mM一氯二甲基环己二酮、1mM H2O2、10mM KBr或KCl和0.4μg/ml卤过氧化物酶的醋酸钠缓冲液(消光系数＝2.6l/(g*cm)，30℃)中测定。如图2所示，卤过氧化物酶首选Br-而非Cl-作为底物并有大约5.75的最适pH值。
在0.1M pH5.5的包含50mM一氯二甲基环己二酮、10mM KBr、1mM H2O2和0.1μg/ml酶的醋酸钠缓冲液中，所述卤过氧化物酶的最适温度是60℃(图3)。
通过在所给定的温度下在20mM磷酸钠pH7的缓冲液中把所述卤过氧化物酶预培养1小时，测定作为温度的函数的卤过氧化物酶稳定性。结果表明在温度高达60℃时所述卤过氧化物酶保持稳定至少一小时(图4)。
所述卤过氧化物酶(4μg/ml)在如图5所显示的宽的pH值范围内也是稳定的，其在30℃下在20mM Britten-Robinson缓冲液(pH值变化于5至11之间)(对照的为pH7，4℃)中培养1小时之后仍然保持80％以上的活性。
此外，存在H2O2时所述卤过氧化物酶(3μg/ml)是高度稳定的，其在60℃下在50mM磷酸钠pH7的缓冲液(其中存在0.1％的H2O2)中培养1小时之后仍然保持75％的剩余活性(图6)。实施例5Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的氨基酸测序在20 mM NH4HCO3中，利用10μg得自无色杆菌属的具赖氨酰特异性的蛋白酶，在37℃下把还原的和S-羧甲基化的Curvularia verruculosa CBS147.63卤过氧化物酶(≈1mg)消化16小时。利用Vydac C18柱和0.1％三氟醋酸(TFA)作为溶剂A以及80％的包含0.08％TFA的2-丙醇作为溶剂B，由反相HPLC分离形成的肽。所述柱首先用5％溶剂B(与95％溶剂A相等)平衡。然后在注入肽混合物之后用5％溶剂B把所述柱洗涤5分钟。最后以溶剂B的线性梯度(用90％的溶剂B(与10％溶剂A相等)时，梯度运行超过85分钟，结束时总共用去90分钟)，以150μl/分钟的流速洗脱结合的肽。利用包含0.1％TFA的线性梯度作为溶剂A和80％的包含0.08％TFA的乙腈作为溶剂B，以250μl/分钟的流速再纯化所述肽。
按照产品说明书用应用生物系统473A蛋白质测序仪进行氨基酸测序。
在氨基酸测序的进行过程中，明显地发现蛋白质的N-末端被封阻，因此不易于对其进行测序。然而，8个内部肽的序列得到测定。所获得的序列如下(SEQ ID NOS3-10)。肽1Xaa-Phe-Ala-Thr-Gln-Ser-Glu-His-Ile-Leu-Ala-Asp-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Ser-Asn-Ala-Asp-Glu-Thr-Ala-Glu-Tyr-Asp-Asp-Ser-Ile-Arg-Val-Ala-Ile-Ala-Met-Gly-Gly-Ala-Gln-Asp-Leu-Asn(SEQ ID NO3)肽2Phe-Arg-Gln-Tyr-His-Ala-Pro-Phe-Tyr-Gly-Met-Thr-Thr-Lys(SEQ IDNO4)肽3Asp-Val-Tyr-Ala-Val-Asp-Ser-Asn-Gly-Ala-Thr-Val-Phe-Gln-Asn-Val-Glu-Asp-Val-Arg-Tyr-Ser-Thr-Lys(SEQ ID NO5)肽4Arg-Ser-Pro-Trp-Gln-Thr-Ala-Gln-Gly-Leu-Tyr-Trp-Ala-Tyr-Asp-Gly-Ser-Asn-Leu-Val-Gly-Thr-Pro-Pro-Arg-Phe-Tyr-Asn-Gln-Ile-Val-Arg-Arg-Ile-Ala-Val-Thr-Tyr-Lys-Lys(SEQ ID NO6)肽5Phe-Asp-Asp-Glu-Pro-Thr-His-Pro-Val-Val-Leu-Val-Pro-Val-Asp-Pro-Asn-Asn-Asn-Asn-Gly-Gly-Lys(SEQ ID NO7)肽6Pro-Ala-Asp-Pro-Asn-Thr-Gly-Thr-Asn-Ile-Ser-Asp-Asn-Ala-Tyr-Ala-Gln-Leu-Ala-Leu-Val-Leu-Glu-Arg-Ala-Val-Val-Lys(SEQ ID NO8)肽7Met-Leu-Ser-Ser-Leu-Tyr-Met-Lys(SEQ ID NO9)肽8Met-Pro-Phe-Arg-Gln-Tyr-His-Ala-Pro-Phe-Tyr-Gly-Met-Thr-Thr-Lys(SEQ ID NO10)除了在N-末端的两个附加的氨基酸残基外，肽8与肽2是相等的。实施例6Curvularia verruculosaCBS 147.63卤过氧化物酶的氨基酸分析用于氨基酸分析的水解重复进行。在110℃下，在已抽空密封的包含100r-6N HCl和0.1％苯酚的玻璃小瓶中将已冷冻干燥的样品水解16小时。按照产品说明书利用应用生物系统420A氨基酸分析系统进行氨基酸分析。氨基酸组成的测定结果显示在表1中(表中值是四次测定的平均值)。表1得自Curvularia verruculosa的卤过氧化物酶的氨基酸组成ND＝没有测定。
实施例7 Curvularia verruculosaCBS 147.63卤过氧化物酶的SDS-PAGE和IEF按照产品说明书进行SDS-PAGE(Novex)和IEF(Pharmacia)。利用酚红试剂和H2O2给IEF凝胶着色以显示卤过氧化物酶活性。
SDS-PAGE显示卤过氧化物酶具有大约68 kDa的分子量，而IEF表明卤过氧化物酶具有大约3.8的等电点。实施例8Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的碳水化合物分析在复制中进行用于单糖组成分析的蛋白质结合的碳水化合物的水解。使冷冻干燥的样品在抽空密封的玻璃管中用100μl2 M TFA水解1小时和在100℃下水解4小时。由利用Dionex PA1柱(由16mM NaOH洗脱)的高效阴离子交换色谱法分离单糖，并由脉冲电流检测法检测所述单糖。
单糖组成分析表明如表2所示(其值是四次测定的平均值)，卤过氧化物酶被糖基化。分析中缺乏葡糖胺表明碳水化合物可能是O-连接的。有趣的是，糖蛋白中并不常发现葡萄糖。
表2.得自Curvularia verruculosa的卤过氧化物酶的单糖组成
实施例9Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的质谱分析在VG Analytical TofSpec中，利用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱进行质谱分析。在质谱分析中，把2μl卤过氧化物酶与2μl饱和基质溶液(在0.1％TFA中的α-氰基-4-羟基肉桂酸∶乙腈(70∶30))混合，并将2μl的所述混合物点滴在靶平板上。在引入质谱仪之前，通过蒸发除去所述溶剂。以4ns激光脉冲(337nm)阈值激光强度解吸附和电离样品，并以25kV的加速电压将样品加速进入自由场飞行管。在1850V时由微型通道平板套(microchannel plate set)检测到离子。由质谱法分析完整的卤过氧化物酶和所有初始肽组分。
质谱分析清楚地表明卤过氧化物酶的糖基化是不均匀的。所述卤过氧化物酶的平均质量大约为64,500 Da，其与由SDS-PAGE测定的68 kDa分子量趋于合理的一致。所述卤过氧化物酶的质量变化于62kDa至66kDa之间。实施例10Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的比活性测定在下列条件下测定Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的比活性0.1M醋酸钠、50μM一氯二甲基环己二酮、1mM H2O2和10mM KCl，pH值为5以及温度为30℃。
基于所测得的消光系数(2.6l/(g*cm))测定13 HU/A280比活性，其相当于33.8 U/mg卤过氧化物酶的比活性。在类似的条件下，Simons等(Simons等，同上)所报道的不等弯孢卤过氧化物酶的比活性是7.5U/mg。因此，看起来Curvularia verruculosa酶的比活性比不等弯孢酶的比活性大约高四倍。实施例11基因组DNA抽提在25ml 0.5％酵母膏-2％葡萄糖(YEG)培养基中，使Curvulariaverruculosa CBS 147.63在32℃和250rpm下生长24小时。然后由通过Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)的过滤收集菌丝体，并用25ml的10mM Tris-1 mM EDTA(TE)缓冲液一次性洗涤所述菌丝体。多余的缓冲液从随后冷冻在液态氮中的菌丝体制剂中除去。在电咖啡研磨机中研磨所述冷冻的菌丝体制剂使之成为细粉，并将所述粉末添加到包含20ml TE缓冲液和5ml 20％w/v十二烷基硫酸钠(SDS)的一次性塑料离心管中。轻轻地将所述混合物翻转几次以确保混合，用相同体积的苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取该混合物两次。将醋酸钠(3M溶液)添加至所萃取的样品中形成最终浓度为0.3M的溶液，然后用2.5体积的冰冷乙醇沉淀DNA。所述试管以15,000×g离心30分钟使DNA沉淀。让所述沉淀风干30分钟而后再悬浮于0.5ml TE缓冲液。将无DNA酶的核糖核酸酶A添加至再悬浮的DNA沉淀悬液中至浓度为100μg/ml，然后将所述混合物在37℃下培养30分钟。添加蛋白酶K(200μg/ml)，并将所述试管在37℃下再温育1小时。最后，用苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇萃取样品两次并用乙醇沉淀DNA。洗涤(用70％乙醇)、干燥(在真空下)、再悬浮(在TE缓冲液中)并贮藏(在4℃下)所沉淀的DNA。实施例12Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶基因片段的PCR扩增基于以上所描述的Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的氨基酸序列和Simons等(Simons等，同上)所揭示的不等弯孢卤过氧化物酶的氨基酸序列，按照产品说明书用应用生物系统394型DNA/RNA合成仪合成以下所示的寡核苷酸引物(其用于PCR扩增得自CurvulariaverruculosaCBS 147.63的卤过氧化物酶基因片段)正向引物dGAAGAGTACAACACCAACTACATA反向引物dCCCATCGTAGGCCCAGTATAGGCCCTG利用大约1μg的Curvularia verruculosa CBS 147.63基因组DNA作为模板，制备扩增反应物(100μl)。各反应物包含下列组分1μg基因组DNA、40pmol正向引物、40pmol反向引物、各200μM dNTP、1 xTaq聚合酶缓冲液(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)和5单位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)。无菌矿物油(100μl)层状分布于各反应混合物的顶部，同时在已如下编程的Perkin-Elmer 480型热循环仪温育所述反应物循环1-95℃下5分钟，45℃下2分钟，67℃下5分钟；循环2-30-95℃下2分钟，45℃下2分钟，67℃下2分钟和4℃下Soak循环。在1％的低熔点琼脂糖凝胶(西格玛化学公司，St.Louis，MO)上分离所述反应产物。按照产品说明书，从所述凝胶上切除所述产物带，并利用β-琼脂糖酶(New England Biolabs，Beverly，MA)纯化该产物带。其后将所纯化的PCR产物克隆进入pCRII载体(Invitrogen，San Diego，CA)，并利用lac正向和反向引物(New England BioLabs，Beverly，MA)测定DNA序列。
利用如上所描述的卤过氧化物酶-特异性PCR引物，从如图7所显示的Curvularia verruculosaCBS 147.63中，扩增由大约278个密码子(834 bp)组成的卤过氧化物酶基因片段。DNA序列分析表明所扩增的基因片段编码相应的Curvularia verruculosa卤过氧化物酶基因部分。所述卤过氧化物酶基因片段用于探测Curvularla verruculosa CBS 147.63基因组DNA的Southern印迹。实施例13基因组DNA的杂交分析由Southern杂交(Maniatis等，1982，分子克隆，实验室手册，冷泉港出版社，冷泉港，纽约)分析从Curvularia verruculosa CBS 147.63中制备的如实施例11所描述的全部细胞DNA样品。用XbaI、BamHI加上HindIII、BamHI加上PstI、或者BamHI加上XbaI消化大约2-5μgDNA，并在1％琼脂糖凝胶上分级分离该DNA。在短波长紫外线下给所述凝胶照相，并使该凝胶在0.5M NaOH-1.5M NaCl中浸泡15分钟而后在1M Tris-HClpH8-1.5M NaCl中浸泡15分钟。按照Davis等(1980，高级细菌遗传学，用于遗传工程的手册，冷泉港出版社，冷泉港，纽约)，通过在20 X SSPE(3M氯化钠-0.2M二磷酸钠-0.02M乙二胺四乙酸二钠)中进行的毛细印迹，将凝胶中的DNA转移至NytranTM杂交膜(Schleicher和Schuell，Keene，NH)上。利用UV Stratalinker(Stratagene，La Jolla，CA)使所述DNA交联到膜上，并使该膜在45℃下在下列杂交缓冲液中浸泡2小时(伴随着轻轻的搅拌)5XSSPE、50％甲酰胺(v/v)、0.3％SDS和200μg/ml已变性和剪切的鲑鱼试验DNA。放射性标记如实施例2所描述的从CurvulariaverruculosaCBS 147.63 PCR-克隆中分离的所述卤过氧化物酶基因片段，并利用该基因片段探测Curvularia verruculosa CBS 147.63基因组DNA的Southern印迹。具体地说，用α[32P]d CTP(Amersham，Arlington Heights，IL)由切口转译(Maniatis等，同上)放射性标记所述基因片段，通过添加NaOH直至最终浓度为0.1M使该基因片段变性，并将该基因片段以每ml缓冲液1×106cpm的活性添加至杂交缓冲液中。在45℃下，使所述混合物在摇动水浴中温育一整夜。培养后，在45℃下用含有0.1％SDS的0.2 XSSPE将所述膜洗涤一次，随后在同一温度下用0.2 X SSPE(不含有SDS)洗涤两次。让所述膜在纸巾上干燥15分钟，然后用Saran-WrapTM包裹该膜并在-70℃下用增强分辨率的X光胶卷(Kodak，Rochester，NY)对该膜曝光过夜。
利用中等严格条件下的Southern印迹法(利用从Curvularia verrulolosaCBS 147.63 PCR-衍生的卤过氧化物酶基因片段探针进行)的全部细胞DNA样品(得自Curvularia verruculosa CBS 147.63)的分析显示了单一杂交信号(图8)。所述单一杂交信号表明有存在于Curvularia verruculosaCBS 147.63基因组中的卤过氧化物酶基因的单一拷贝。实施例14卤过氧化物酶克隆的DNA文库和鉴别基因组DNA文库由噬菌体克隆载体λZipLox构建(生命技术，Gaithersburg，MD)。首先，由Tsp509I部分消化全细胞DNA，并在1％琼脂糖凝胶上按大小分级分离该DNA。切除在3-7kb的大小范围内迁移的DNA片段，并利用Prep-a-Gene试剂(BioRad Laboratories，Hercules，CA)从所述凝胶上洗脱该DNA片段。把所洗脱的DNA片段与EcoRI-切割的和脱磷酸化的λZipLox载体臂(生命技术，Gaithersburg，MD)连接，利用商业包装提取物(Stratagene，La Jolla，CA)包装所述连接混合物。用大肠杆菌Y1090ZL细胞(生命技术，Gaichersburg，MD)平板培养和扩增所包装的DNA文库。没有扩增的基因组DNA文库包含3.1×105pfu/ml(没有DNA的背景效价是2.0×104pfu/ml)。利用得自Curvularia verruculosa CBS147.63的具有卤过氧化物酶-特异性的PCR片段作为探针，由噬斑-杂交从所述文库中筛选大约60,000个噬斑(Davis等，1980，高级细菌遗传学，遗传工程手册，冷泉港出版社，冷泉港，纽约)。用大肠杆菌Y1090ZL细胞两次纯化六个噬斑(用所述探针其可给出强大杂交信号)；其后利用经由大肠杆菌DH10Bzip细胞感染的活体内切除术(生命技术，Gaithersburg，MD)，从λZipLox载体切除所述卤过氧化物酶基因作为pZL1-衍生物(D’Alessio等，1992，Focus1476)。从所述各克隆中制备小量制备的DNA，卤过氧化物酶插入片段的大小则由如图9所显示的琼脂糖凝胶电泳测定。有几个克隆似乎是近亲的，包括所指定的4A1和4A2两个克隆(其包含与质粒带(约4.3kb)互迁移的插入片段)。利用Wizard 373 DNA纯化试剂盒(Promega，Madison，WI)，选择卤过氧化物酶克隆4A(大肠杆菌DH10B-pHAP4A.1)用于DNA序列分析。实施例15Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶基因的DNA序列分析利用鸟枪DNA测序和引物步查技术与染料-终止子化学(Giesecke等，1992，病毒学方法杂志3847-60)的组合法，用应用生物系统373A型自动DNA测序仪(应用生物系统公司，Foster City，CA)，在两条链上进行实施例14所描述的卤过氧化物酶克隆4A(大肠杆菌DH10B-pHAP4A.1)的DNA测序。除lac正向和lac反向引物外，下列用于基因测序的寡核苷酸测序引物按照产品说明书由应用生物系统394型DNA/RNA合成仪合成测序引物引物序列951337dCATGTGGGACGAGCAGGTGCCGTTG (SEQ ID NO11)951338dGATAGAAAAGTAGGCATCGTGGATA (SEQ ID NO12)951367dCAGAGCTCTGGCAGAGAGAGGCGGTCC(SEQ ID NO13)951368dCATTGGGGCTAGGCAGACGGTACGC (SEQ ID NO14)951969dGAAGACAGCATCTTGAGAGCAGCTC (SEQ ID NO15)951455dCAAGCGTAAGCAGCCAAACTGATCT (SEQ ID NO16)951456dGAGATGTACATACGTCAGACCTGGC (SEQ ID NO17)编码所述Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的基因的核苷酸序列显示在图10中。所克隆的名为hpxl的插入片段的序列分析揭示1800 nt的大开放读框(排除终止密码子)编码具有600个氨基酸的蛋白质。没有内含子出现在所述基因中。所述开放读框的G+C含量是57％。
显示于图10中的推定的Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶氨基酸序列表明计算得到的主要翻译产物分子量是66,593，这与估计值68 kDa(基于纯化的蛋白质在SDS-PAGE上的迁移率和得自如上所描述的纯化的卤过氧化物酶的肽的氨基酸序列)是一致的。
所述推得的氨基酸序列预测在Curvularia verruculosa卤过氧化物酶中仅有两个半胱氨酸残基存在，它们在活性酶中可能作为游离硫醇出现，这与得自不等弯孢的卤过氧化物酶一致(Simons等，1995，欧洲生物化学杂志229566-574)。对于N-糖基化有三个可能位点。如实施例8所描述的，Curvularia verruculosa卤过氧化物酶的单糖组成分析表明卤过氧化物酶为3pmol半乳糖、16pmol葡萄糖和29pmol甘露糖所糖基化。然而，由于观察到的Curvularia verruculosa卤过氧化物酶分子量(68 kDa)十分接近于计算得到的分子量(MW＝66,573)，糖基化的程度可能非常小。此外，分析中缺少葡糖胺表明碳水化合物部分是O-连接的。所述结果是与得自不等弯孢的据报道没有被糖基化的卤过氧化物酶(Simons等，1995，欧洲生物化学杂志229566-574)形成对照。
如图11所示，推得的Curvularia verruculosa卤过氧化物酶氨基酸序列与不等弯孢卤过氧化物酶氨基酸序列是90.9％等同的。有趣的是，不等弯孢卤过氧化物酶比Curvularia verruculosa卤过氧化物酶长九个残基并且聚集在两处，一处靠近不等弯孢卤过氧化物酶的N-末端而另一处靠近C-末端。实施例16Curvularia verruculosa卤过氧化物酶CBS 444.70的产生在500ml的包含100ml培养基(组成如下)的摇瓶中产生Curvulariaverruculosa CBS 444.70种子培养物。
玉米浆(干燥) 1.2g葡萄糖 2.4gCaCO30.5g豆油 0.5ml在高压灭菌之前将pH值调整至5.5。
在26℃和250rpm下生长3天，以如上所描述的种子培养物接种10升实验室发酵罐。发酵罐中的培养基组分是酵母膏(Difco 0127)8g/lK2HPO4(Merck 5101) 2g/lMgSO4·7H2O(Merck 5886)1g/l右旋糖(Roquelle 101-0441) 30g/lNa3VO41mg/lpH值没有调整至6.2，但测量到该值。所述发酵发生于26℃和550rpm下，持续7天。实施例17Curvularia verruculosa CBS 444.70卤过氧化物酶的纯化离心、过滤(GF/F Whatman)实施例16所制备的培养物肉汤，并在Filtron仪器(膜截断10000 Da)上将该肉汤浓缩大约80倍，并在Amicon槽(PM 10)中进一步浓缩。以5ml/分钟流速，将浓缩的肉汤装载在预先在10mM磷酸钾pH7(缓冲液A)中平衡的Q-琼脂糖凝胶FF-柱(100ml，XK26，Pharmacia)上。用200ml的10mM pH 7磷酸钾洗涤所述柱，然后在相同的缓冲液中以0-＞1M NaCl的梯度洗脱该柱200分钟以上。按照实施例2所描述的卤过氧化物酶活性的存在，收集和集中10ml组分。在Amicon槽(PM 10)上和Centricon-10上集中和浓缩36-45组分。将1.5ml浓缩液样品装载在已用50mM pH7.1磷酸钠平衡的HiLoad Superdex 75-柱(Pharmacia)上，并以1ml/分钟的流速洗脱所述卤过氧化物酶。收集1.5ml组分，并如实施例2所述分析该组分的卤过氧化物酶活性。集中包含卤过氧化物酶活性的组分。实施例18Curvularia verruculosa CBS 444.70卤过氧化物酶的抗菌活性检测如实施例17所描述制备的Curvularia verruculosa CBS 444.70卤过氧化物酶对下列四种不同的非病原菌的抗菌活性革兰氏阴性细菌荧光假单胞菌(ATCC 13525)解藻酸弧菌(ATCC 17749)革兰氏阳性细菌无害利斯特氏菌(ATCC 33090)藤黄微球菌(ATCC 10240)。
在包含下列组分的TY培养基(以氢氧化钾调整pH值至7.3)中培养所述试验有机体胰蛋白酶 20g/l酵母膏 5g/lFeCl2·4H2O 6mg/lMnCl2·7H2O 1mg/lMgSO4·7H2O 15mg/l抗菌活性用下列溶液(卤过氧化物酶溶液是0.2μ膜过滤的)之一，在30℃下在TY-培养基中培养所述试验有机体(107-108CFU/ml，这里的CFU＝菌落形成单位)(1)10ppm苯扎氯铵；(2)得自黑曲霉的具有0.2 GODU/ml(Sigma)活性的葡糖氧化酶+10mM葡萄糖；(3)得自黑曲霉的具有0.2 GODU/ml(Sigma)活性的葡糖氧化酶+10mM葡萄糖+1mM SCN-；(4)得自黑曲霉的具有0.2 GODU/ml(Sigma)活性的葡糖氧化酶+10mM葡萄糖+0.1HU/ml C.verruculosam卤过氧化物酶；和(5)得自黑曲霉的具有0.2 GODU/ml(Sigma)活性的葡糖氧化酶+10mM葡萄糖+1 mM SCN-+0.1 HU/ml C.verruculosam卤过氧化物酶。
通过由氧氧化D-葡萄糖为葡糖酸和过氧化氢，测定葡糖氧化酶活性。进而由过氧化物酶和2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)把所产生的过氧化氢还原为水。在418nm测量所产生的蓝绿色。所述分析条件是0.1 M醋酸钠、90 mMβ-D-葡萄糖、pH 5.6、30℃和反应20分钟。一个葡糖氧化酶单位(GODU)定义为在所述条件下每分钟催化1μmol过氧化氢转化的葡糖氧化酶量。
随后在30℃下进行利斯特氏菌属和微球菌属的生长抑制，并在490nm测量其浊度。
表3所显示的结果表明在用溶液5处理之后利斯特氏菌属或微球菌属的生长受到抑制，虽然微球菌属的生长对溶液2敏感。
表3以相对于对照的％表示的革兰氏阳性细菌的生长；在培养24小时之后测得在490nm浊度增加
在50mM磷酸钠pH 7缓冲液中用上述溶液把较低细胞数的试验有机体(105-106CFU/ml)培养1小时，并平板展开在TY-琼脂上。当利用溶液5时，在如表4所显示的给定条件下革兰氏阴性细菌(假单胞菌属和弧菌属)受到严重的影响而革兰氏阳性细菌则存活下来。革兰氏阳性细菌的存活可能是由于有限的培养时间(1小时)。表4基于CFU计数的％存活率表示的纯化的卤过氧化物酶抗菌活性
实施例19Curvularia vcrruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶(hpxl)米曲霉表达质粒的构建扩增Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶基因(hpx)的编码区，并将所形成的片段克隆进入在米曲霉中表达的pBANe6。pBANe6提供了TAKA/NA2-tpi启动子、AMG 3’终止子和amdS选择标记基因(图12)。具体地说，利用设计成第一符合读框的ATG的有义引物(aHaP1)和在下游伸展20bp，以及利用设计成转录终止密码子下游14bp区的反义引物(aHaP1A)和在下游伸展19bp，由PCR扩增所述片段。为了有利于克隆所述扩增的片段，有义和反义引物分别包含SwaI和PacI限制位点。利用ABI 394型DNA/RNA合成仪(应用生物系统公司，Foster City，CA)合成下面所显示的寡核苷酸引物。
SwaIaHaP1 5’GCATATTTAAATGATGGGGTCCGTTACACCAAT(SEQID NO18)
PacIaHaP1A 5’ATATTAATTAATCACTGGTAAACTCTGCCG(SEQ IDNO19)所述50μl PCR溶液(10mM Tris-HCl pH8.3、50 mM KCl、1.5 mMMgCl2、0.01％w/v明胶)包含大约200ng hpxl DNA，各200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，以及各50pmol所述的PCR引物。添加五个单位的PWO聚合酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，并使所述反应物在95℃下温育3分钟和冷却到80℃。然后在Perkin-Elmer9600热循环仪中将所述反应物循环30次，每个循环在95℃下进行30秒、在57℃下进行1分钟和在72℃下进行1分钟。最后一个循环之后，在72℃下将所述反应物温育5分钟。
由利用SwaI和PacI的消化分离所预测的1.8kb片段，并将该片段克隆进入由相同的限制性内切核酸酶所消化的pBANe6中以形成pAJ014-1(图13)。为了检验所克隆的PCR片段的保真性，按照Hattori和Sakaki的方法(1986，分析生物化学152232-237)，利用自动的应用生物系统373 A型测序仪(应用生物系统公司，Foster City，CA)测序所述片段。
pAJ014-1的克隆的hpx7扩增的插入片段的测序证实在如SEQ ID NO1所描述的序列中没有区别。实施例20利用pAJ014-1的米曲霉菌株JaL 142的转化按照下列方法利用pAJ014-1转化米曲霉菌株JaL 142。利用原生质体，以每ml2×107原生质体的浓度进行所述转化。利用10μgDNA和200μl60％PEG 4000-10mM HEPES-10mM CaCl2溶液，在34℃下将100μl原生质体温育30分钟。添加3ml SPTC(40％PEG 4000、0.8M山梨醇、0.05M Tris pH 8.0、0.05M CaCl2)，并将原生质体直接铺展到COVE转化平板(每升含有342.3g蔗糖、25g诺贝尔琼脂、10ml 1M乙酰胺、20ml COVE盐溶液和10ml 3M CsCl)上以便amdS转化。所述COVE盐溶液(50X)包含26g KCl、26g MgSO4-7H2O、76g KH2PO4和50ml COVE痕量金属溶液。每升所述COVE痕量金属溶液包含0.04g NaB4O7-10H2O、0.04g CuSO4-5H2O、0.70g FeSO4-H2O、0.80g Na2MoO2-2H2O和10g ZnSO4。在34℃下将所述平板温育5-7天。将所述转化体转移到相同培养基的平板上，并在34℃下将该转化体培养3-5天。然后在相同条件下利用相同平板，通过划线孢子和挑选分离的菌落将所述转化体纯化。实施例21在米曲霉中的Curvularia verruculosa CBS 147.63卤过氧化物酶的表达在24-孔平板中将实施例20所获得的二十四个转化体的每一个接种到1ml补充了1mM V2O5的1/4强度的MY50N培养基中。每升MY50N培养基包含62.5g钠酪蛋白、2g MgSO4-7H2O、2g KH2PO4、4g柠檬酸、8g酵母膏、2g尿素、0.1g CaCl2和0.5ml痕量金属。每升所述痕量金属溶液包含22g ZnSO4-7H2O、11g H3BO3、5g FeSO4-7H2O、1.6gCoCl2-5H2O、1.6g(NH4)6Mo7O24和50g Na4EDTA。以150rpm摇动速率使所述培养物在34℃下生长5天，然后利用实施例2所描述的方法(不同的是所述分析缓冲液外也包含1.25mM用于激活酶的V2O5)进行卤过氧化物酶活性分析。由添加10μl 0.3％的H2O2开始所述分析，并在培养期间在30℃下监测在600nm的吸收率作为时间的函数。以每毫升每分钟在600nm的吸收率变化(mOD600/分钟-ml)表示活性。
所述二十四个转化体均具有卤过氧化物酶可检测活性，范围从250到8,390 mOD600/分钟-ml。得自24-孔平板的样品的SDS-PAGE很容易表明与卤过氧化物酶(其丰度与分析结果的相关性很好)相对应的66 kDa带的存在。
然后将最好的八个转化体孢子纯化两次，并且将这些转化体接种到125ml的包含25ml补充了1mM V2O5的MY50N培养基的隔板式摇瓶中并在34℃下以250rpm速率摇动生长5天。在5天生长之后分析所述培养物，并使最好的分离物HaP14在发酵罐中运转。
在每升包含30g钠酪蛋白、10g酵母膏、2g MgSO4-7H2O、2gK2SO4、2g柠檬酸、3g CaCl2和0.5ml痕量金属溶液(如上所述)的罐培养基中发酵HaP14，并在发酵过程中用每升包含400g钠酪蛋白、20g尿素和1g柠檬酸的培养基补料HaP14。让发酵在34℃和pH 7.2下进行7天，此期间获得大约1.2升的肉汤。对发酵1至7天的肉汤样品所进行的分析表明卤过氧化物酶的产量在第4天达到峰值，此后产量不断降低，虽然在第7天产量看起来似乎稍有回升(图14)。
微生物的保藏下列菌株已按照布达佩斯条约保藏在美国北部区域研究实验室的农业研究机构专利培养物保藏中心(NRRL)(61604，Illinois，Peoria，1815大学街道)。菌株 保藏号 保藏日期大肠杆菌DH10B(pHAP4A.1)NRRLB-215191996年1月18日所述菌株已在一定的条件下保藏，该条件确保在专利申请未决期间，所述培养物对根据37 C.F.R§1.14和35 U.S.C.§122授权的专利和商标委员确定的对象是可获得的。所述保藏提供了各个所保藏的菌株的基本上纯的培养物。可按照外国专利法的要求在该主题申请的相应部分或其后续申请所提出的国家中得到所述保藏物。然而，应该明白所述保藏物的可得到性并不构成因部分废除由政府部门授予的专利权而实施该主题发明的许可。
本文所描述的和所要求的发明并不限制在本文的具体实施方案所揭示的范围内，因为这些实施方案是打算作为本发明若干方面的说明。任一等同的实施方案预期在本发明的范围之内。实际上，从所述说明书，除了本文所显示和所描述的修改，各种本发明修改对本领域技术人员将是显而易见的。所述修改也预期在附加权利要求的范围之内。本文引用了各种参考文献，参考文献所公开的内容以其整体一并作为本文的参考资料。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvard(D)州(E)国家丹麦(F)ZIPDK-2880(G)电话45-4444-8888(H)传真45-4449-0555(i)申请人(A)名称Novo Nordisk生物技术公司(B)街道1445 Drew大街(C)城市Davis(D)州加利福尼亚(E)国家美国(F)ZIP95616-4880(G)电话(916)757-8100(H)传真(916)758-0317(ii)发明名称得自Curvularia verruculosa的卤过氧化物酶和编码该酶的核酸(iii)序列数10(iv)通讯地址(A)收信人北美Novo Nordisk公司(B)街道405 Lexington大街，6400房间(C)城市纽约(D)州纽约(E)国家美国
(F)ZIP10174(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)当前申请的数据(A)申请号(B)申请日期1996-7-9(C)分类号(vii)在先申请的数据(A)申请号60/001,194(B)提交日期1995-7-14(vii)在先申请的数据(A)申请号08/603,534(B)申请日1996-2-21(viii)律师/代理人信息；(A)姓名Lambiris，Elias J.
(B)注册号33,728(C)参考/索引号4441.204-WO(ix)通讯信息(A)电话(212)867-0123(B)传真(212)878-9655(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度2822碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置477..2276(xi)序列描述SEQ ID NO1GAGATGTACA TACGTCAGAC CTGGCCATCC AACATTTATC CCAGTCGGAC ACCGGCTCCT60TTCGCCACCA GTTGGTCACC GAGTTTTAAT ATCACATGTG GTTCACGCCA AGCGTAAGCA 120GCCAAACTGA TCTCCCTAGA TCCGTCTTGG TTACCGCCTC AGGACAATTT CCATTTGACG 180GCAGTGGTCT GCCACACCGC TGCAATGCGG CTGTGGCTTC ACGTCTGCCT TGCGCCCTTG 240CATGAGAATA GCAGTTCCCC GTAACTTTGT GGCTTGACTA TGGTTCACCT GATAGCGACG 300AGTGTACCAT TCTAAGAGTC TTCAAGGGTC TTTTGAAGGG AACAGAGTGG ATGTGTGTGT 360GTGTGCTGAT ATCCTTGAAG AATTGACTAT AAAGTCTGTG AGCTCTCGCA TTCTTTGTTG 420CAATATCACA ATTCATCTAC TCATTCTGTG CACCACATAT CATCATCACA CCTACT 476ATG GGG TCC GTT ACA CCA ATT CCG TTG CCT ACG ATC GAT GAA CCC GAA 524Met Gly Ser Val Thr Pro Ile Pro Leu Pro Thr Ile Asp Glu Pro Glu1 5 10 15GAG TAT AAC AAC AAC TAC ATA CTC TTC TGG AAT AAT GTC GGG CTG GAA 572Glu Tyr Asn Asn Asn Tyr Ile Leu Phe Trp Asn Asn 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255TCT ATC CGC GTG GCC ATC GCC ATG GGA GGT GCC CAG GAT CTC AAC TCC 1292Ser Ile Arg Val Ala Ile Ala Met Gly Gly Ala Gln Asp Leu Asn Ser260 265 270ACC AAG CGT AGC CCA TGG CAG ACG GCA CAA GGT CTG TAC TGG GCC TAT 1340Thr Lys Arg Ser Pro Trp Gln Thr Ala Gln Gly Leu Tyr Trp Ala Tyr275 280 285GAT GGG TCA AAC CTT GTT GGA ACC CCA CCG CGA TTC TAC AAT CAG ATT 1388Asp Gly Ser Asn Leu Val Gly Thr Pro Pro Arg Phe Tyr Asn Gln Ile290 295 300GTG CGT CGC ATC GCA GTG ACT TAC AAG AAG GAA GAT GAC CTT GCC AAC 1436Val Arg Arg Ile Ala Val Thr Tyr Lys Lys Glu Asp Asp Leu Ala Asn305 310 315 320AGC GAA GTC AAC AAT GCT GAT TTT GCC CGC CTC TTC GCC CTC GTC AAC 1484Ser Glu Val Asn Asn Ala Asp Phe Ala Arg Leu Phe Ala Leu Val Asn325 330 335GTC GCC TGC ACA GAC GCC GGC ATC TTT TCC TGG AAG GAA AAA TGG GAG 1532Val Ala Cys Thr Asp Ala Gly Ile Phe Ser Trp Lys Glu Lys Trp Glu340 345 350TTT GAA TTC TGG CGC CCT TTG TCT GGT GTG AGA GAC GAT GGC CGT CCA 1580Phe Glu Phe Trp Arg Pro Leu Ser Gly Val Arg Asp Asp Gly Arg Pro355 360 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475 480TTC GAA AAC GCC ATT TCT CGC ATC TTC CTC GGC GTC CAC TGG CGC TTC 1964Phe Glu Asn Ala Ile Ser Arg Ile Phe Leu Gly Val His Trp Arg Phe485 490 495GAT GCC GCC GCC GCT CGC GAC ATT CTG ATC CCC ACC AAC ACA AAG GAT 2012Asp Ala Ala Ala Ala Arg ASp Ile Leu Ile Pro Thr Asn Thr Lys Asp500 505 510GTG TAT GCC GTC GAC AGC AAC GGC GCG ACA GTG TTC CAG AAT GTA GAG 2060Val Tyr Ala Val Asp Ser Asn Gly Ala Thr Val Phe Gln Asn Val Glu515 520 525GAT GTC AGG TAC TCG ACC AAG GGC ACG CGT GAG GGC CGC GAG GGC CTC 2108Asp Val Arg Tyr Ser Thr Lys Gly Thr Arg Glu Gly Arg Glu Gly Leu530 535 540TTC CCT ATC GGT GGT GTG CCG CTG GGT ATC GAG ATT GCC GAT GAG ATT 2156Phe Pro Ile Gly Gly Val Pro Leu Gly Ile Glu Ile Ala Asp Glu Ile545 550 555 560TTT AAT AAT GGA CTT AGG CCC ACG CCG CCG GAG CTT CAG CCT ATG CCG 2204Phe Asn Asn Gly Leu Arg Pro Thr Pro Pro Glu Leu Gln Pro Met Pro565 570 575CAG GAT ACC CCG GTG CAG AAG CCG GTT CAG GGC ATG TGG GAC GAG CAG 2252Gln Asp Thr Pro Val Gln Lys Pro Val Gln Gly Met Trp Asp Glu Gln580 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Pro Pro35 40 45Leu Ser Ala Arg Ala Leu Gly Met Leu His Leu Ala Ile His Asp Ala50 55 60Tyr Phe Ser Ile Cys Pro Pro Thr Glu Phe Thr Thr Phe Leu Ser Pro65 70 75 80Asp Ala Glu Asn Pro Ala Tyr Arg Leu Pro Ser Pro Asn Gly Ala Asp85 90 95Asp Ala Arg Gln Ala Val Ala Gly Ala Ala Leu Lys Met Leu Ser Ser100 105 110Leu Tyr Met Lys Pro Ala Asp Pro Asn Thr Gly Thr Asn Ile Ser Asp115 120 125Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Ala Leu Val Leu Glu Arg Ala Val Val Lys130 135 140Val Pro Gly Gly Val Asp Arg Glu Ser Val Ser Phe Met Phe Gly Glu145 150 155 160Ala Val Ala Asp Val Phe Phe Ala Leu Leu Asn Asp Pro Arg Gly Ala165 170 175Ser Gln Glu Gly Tyr Gln Pro Thr Pro Gly Arg Tyr Lys Phe Asp Asp180 185 190Glu Pro Thr His Pro Val Val Leu Val Pro Val Asp Pro Asn Asn Pro195 200 205Asn Gly Pro Lys Met Pro Phe Arg Gln Tyr His Ala Pro Phe Tyr Gly210 215 220Met Thr Thr Lys Arg Phe Ala Thr Gln Ser Glu His Ile Leu Ala Asp225 230 235 240Pro Pro Gly Leu Arg Ser Asn A la Asp Glu Thr Ala Glu Tyr Asp Asp245 250 255Ser Ile Arg Val Ala Ile Ala Mat Gly Gly Ala Gln Asp Leu Asn Ser260 265 270Thr Lys Arg Ser Pro Trp Gln Thr Ala Gln Gly Leu Tyr Trp Ala Tyr275 280 285Asp Gly Ser Asn Leu Val Gly Thr Pro Pro Arg Phe Tyr Asn Gln Ile290 295 300Val Arg Arg Ile Ala Val Thr Tyr Lys Lys Glu Asp Asp Leu Ala Asn305 310 315 320Ser Glu Val Asn Asn Ala Asp Phe Ala Arg Leu Phe Ala Leu Val Asn325 330 335Val Ala Cys Thr Asp Ala Gly Ile Phe Ser Trp Lys Glu Lys Trp Glu340 345 350Phe Glu Phe Trp Arg Pro Leu Ser Gly Val Arg Asp Asp Gly Arg Pro355 360 365Asp His Gly Asp Pro Phe Trp Leu Thr Leu Gly Ala Pro Ala Thr Asn370 375 380Thr Asn Asp Ile Pro Phe Lys Pro Pro Phe Pro Ala Tyr Pro Ser Gly385 390 395 400His Ala Thr Phe Gly Gly Ala Val Phe Gln Met Val Arg Arg Tyr Tyr405 410 415Asn Gly Arg Val Gly Thr Trp Lys Asp Asp Glu Pro Asp Asn Ile Ala420 425 430Ile Asp Met Met Ile Ser Glu Glu Leu Asn Gly Val Asn Arg Asp Leu435 440 445Arg Gln Pro Tyr Asp Pro Thr Ala Pro Ile Glu Asp Gln Pro Gly Ile450 455 460Val Arg Thr Arg Ile Val Arg His Phe Asp Ser Ala 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Tyr Gly Met Thr Thr Lys1 5 10(2)SEQ ID NO5的信息(ii)序列特征(A)长度24个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO5Asp Val Tyr Ala Val Asp Ser Asn Gly Ala Thr Val Phe Gln Asn Val1 5 10 15Glu Asp Val Arg Tyr Ser Thr Lys20(2)SEQ ID NO6的信息(ii)序列特征(A)长度40个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO6Arg Ser Pro Trp Gln Thr Ala Gln Gly Leu Tyr Trp Ala Tyr Asp Gly1 5 10 15Ser Asn Leu Val Gly Thr Pro Pro Arg Phe Tyr Asn Gln Ile Val Arg20 25 30Arg Ile Ala Val Thr Tyr Lys Lys35 40(2)SEQ ID NO7的信息(ii)序列特征(A)长度23个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO7Phe Asp Asp Glu Pro Thr His Pro Val Val Leu Val Pro Val Asp Pro1 5 10 15Asn Asn Asn Asn Gly Gly Lys20(2)SEQ ID NO8的信息(ii)序列特征(A)长度28个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO8Pro Ala Asp pro Asn Thr Gly Thr Asn Ile Ser Asp Asn Ala Tyr Ala1 5 10 15Gln Leu Ala Leu Val Leu Glu Arg Ala Val Val Lys20 25(2)SEQ ID NO9的信息(ii)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Leu Ser Ser Leu Tyr Met Lys1 5(2)SEQ ID NO10的信息(ii)序列特征(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Pro Phe Arg Gln Tyr His Ala Pro Phe Tyr Gly Met Thr Thr Lys1 5 10 2权利要求
1.一种得自Curvularia verruculosa菌株的分离的卤过氧化物酶。
2.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其得自Curvularia verruculosaCBS 147.63或其突变株。
3.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其得自Curvularia verruculosaCBS 444.70或其突变株。
4.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其在存在0.1％H2O2时在pH 7.0和60℃下温育一小时之后保持至少50％的活性。
5.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其在存在0.1％H2O2时在pH 7.0和60℃下培养一小时之后保持至少75％的活性。
6.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其在30℃下和4-11的pH值范围内保持至少50％的活性。
7.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其在30℃下和4-11的pH值范围内保持至少80％的活性。
8.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其在50-70℃范围内具有最适温度。
9.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其在55-65℃范围内具有最适温度。
10.一种按照权利要求9的卤过氧化物酶，其在pH 5.5下具有大约60℃的最适温度。
11.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其在大约pH 5.25-6.25范围内具有最适pH值。
12.一种按照权利要求11的卤过氧化物酶，其在30℃下具有大约5.75的最适pH值。
13.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其优先选择Br-而非Cl-作为底物。
14.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其包含SEQ ID NO3所描述的部分肽序列。
15.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其包含SEQ ID NO4所描述的部分肽序列。
16.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其包含SEQ ID NO5所描述的部分肽序列。
17.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其包含SEQ ID NO6所描述的部分肽序列。
18.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其包含SEQ ID NO7所描述的部分肽序列。
19.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其包含SEQ ID NO8所描述的部分肽序列。
20.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其包含SEQ ID NO9所描述的部分肽序列。
21.一种按照权利要求1的卤过氧化物酶，其包含SEQ ID NO10所描述的部分肽序列。
22.一种分离的卤过氧化物酶，其具有至少93％同源于SEQ ID NO2所描述的氨基酸序列的氨基酸序列。
23.一种按照权利要求22的卤过氧化物酶，其具有SEQ ID NO2所描述的氨基酸序列。
24.一种分离的卤过氧化物酶，其由包含在大肠杆菌DH10B，NRRL B-21519的质粒pHAP4A.1中的核酸序列编码区编码。
25.一种分离的核酸片段，其包含编码权利要求1的卤过氧化物酶核酸序列。
26.一种按照权利要求25的核酸片段，其中所说的核酸序列编码得自Curvularia verruculosa CBS 147.63的卤过氧化物酶。
27.一种按照权利要求25的核酸片段，其中所说的核酸序列编码得自Curvularia verruculosa CBS 444.70的卤过氧化物酶。
28.一种按照权利要求25的核酸片段，其中所说的核酸序列描述在SEQ IDNO1中。
29.一种核酸构建体，该构建体包含权利要求25的核酸片段，所述片段可操作地连接到能够指导卤过氧化物酶在合适的表达宿主中的表达的调节区上。
30.一种包含权利要求29的核酸构建体的重组载体。
31.一种包含按照权利要求29的核酸构建体的重组宿主细胞。
32.一种用于产生权利要求1的卤过氧化物酶的方法，该方法包括(a)发酵Curvularia verruculosa菌株以产生包含所述卤过氧化物酶的上清液；和(b)回收所述卤过氧化物酶。
33.一种用于产生权利要求1的卤过氧化物酶的方法，该方法包括(a)在有利于所述卤过氧化物酶表达的条件之下，发酵包含含有编码所述卤过氧化物酶的核酸序列的核酸构建体的宿主细胞；和(b)回收卤过氧化物酶。
34.一种用于氧化卤离子的方法，该方法包括在存在权利要求1的卤过氧化物酶时使卤离子和过氧化氢源发生反应。
35.一种用于卤代化合物的方法，该方法包括在存在权利要求1的卤过氧化物酶时使所述化合物、卤离子和过氧化氢源发生反应。
36.一种用于杀灭微生物细胞或者抑制微生物细胞生长的方法，该方法包括在含水溶液中使权利要求1的卤过氧化物酶、过氧化氢源和硫氰酸源与所述细胞接触。
全文摘要
本发明涉及Curvularia verruculosa卤过氧化物酶和包含编码该卤过氧化物酶的核酸序列的分离的核酸片段,以及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和重组宿主细胞。本发明也涉及重组产生所述卤过氧化物酶的方法。本发明还涉及包含所述卤过氧化物酶的组合物和利用所述组合物杀灭微生物细胞或抑制微生物细胞生长的方法。
文档编号C12N15/53GK1194003SQ96196565
公开日1998年9月23日 申请日期1996年7月9日 优先权日1995年7月14日
发明者C·福格尔桑格, K·M·奥克森伯尔, T·哈尔基尔, R·M·伯卡, J·彻瑞 申请人:诺沃挪第克公司, 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司