专利名称：定性、定量检测蓝舌病毒的引物和TaqMan探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及用分子生物学方法对病毒进行定性、定量检测的引物和探针，特别是涉及用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantification PCR，real-time FQPCR)技术对蓝舌病毒进行定性、定量检测的引物和TaqMan探针。
背景技术：
蓝舌病是世界动物卫生组织(OIE)确认的15种A类动物疾病之一，受到了全世界有关国家的特别关注。蓝舌病最早发生于南非(19世纪后期)，进入20世纪后，该病在世界各地陆续发生或查出该病病毒。我国自1979年在云南师宗县首次发生该病以来，又先后在其它地区多次发生。
蓝舌病毒(bluetongue virus，BTV)是感染家养及野生反刍动物的虫媒病毒。BTV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的代表成员，迄今已发现25个BTV血清型(Davies FG，Muugai JN，Pini A.Vet Microbiol 1992；3125-32)，其中在美国查出6个血清型(BTV2，10，11，13、17及24)，在我国查出1个血清型(BTV10)。BTV基因组含10个节段的双链RNA(dsRNA)，按大中小分片段1-3为长片段，片段4-6为中长片段，片段7-10为短片段。该10个节段的dsRNA分别编码7个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP6、VP7)和3个非结构蛋白(NS1、NS2、NS3)。其中NS1由片段6(segment 6，S6)编码翻译，属中长大小的dsRNA片段，是与BTV复制有关的一种非结构蛋白。Wang LF等的研究表明，NS1基因(又称S6)在BTV血清群的10个节段基因中最为保守(Wang LF，Dior h，Osburn BI.Nucleic Acid Res 1989；178002)。Jonathan等提出BTV NS1基因与其它环状病毒属交叉反应最小(Jonathan B K，Gary AG，David A A，Karl A A & Kathryan M M，Am J Vet Res，54(1993)2021)。
可根据发病症状、流行病学和病理剖检变化对蓝舌病进行假定诊断，确诊则必须依靠病毒的分离和鉴定或特异性血清学试验。国际通用的诊断方法是采用琼脂免疫扩散、荧光抗体或补体结合试验检测特异性抗体。中和试验、竞争性ELISA、间接ELISA也可用于检测特异性抗体。此外，PCR技术可用于该病毒的基因检测。
PCR技术作为新型的基因检测手段，具有快速、准确、特异性强等特点，已成为病毒检测方法发展的必然趋势。
PCR技术自1989年开始应用以来，不仅在分子生物学领域成为常规的方法和手段，而且在遗传性疾病的诊断、病原体的检测、法医学标本的鉴定等多方面得到了广泛的应用。并且该项技术不断得到改进。1996年，美国Applied Biosystems公司推出了实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantification PCR，real-time FQ PCR)技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记来进行定量，不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、无污染(无需使用溴化乙淀)、自动化程度高等特点。该技术是将DNA探针连接荧光试剂，待此DNA探针与PCR产物结合后，通过检测荧光光量，并用计算机软件进行辅助分析，进行量化计算，灵敏度为0.1％。定量PCR不仅可以应用在基础研究、临床检测，还可以在海关及食品卫生检疫方面发挥重要的作用。
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针(TaqMan探针)，探针只与模板特异结合，其结合位点位于两条引物之间，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。目前常用的Taqman荧光探针为寡核苷酸，其5′端标记有报告荧光基团(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端标记有淬灭荧光基团(Quencher，Q)，如TAMRA等。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在PCR扩增过程中，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及未知模板的扩增曲线可对未知模板进行定量分析。
但是，目前尚没有专门用于蓝舌病毒基因的实时荧光定量PCR检测技术，因为没有合适的引物和特异性荧光探针。
发明内容
本发明的目的是提供一对用于对蓝舌病毒(BTV)进行定性、定量检测的引物。
本发明所提供的引物，其上游引物具有序列表中的SEQ ID №1，下游引物具有序列表中的SEQ ID №2。
将上游引物命名为P(NS1-1)，序列表中的SEQ ID №1由21个碱基组成，该序列位于BTV NS1基因(又称S6基因)自5’端第10-30碱基；将下游引物命名为P(NS1-2)，SEQ ID №2由21个碱基组成，该序列为BTV NS1基因自5’端第110-130位碱基的反向互补序列。所述NS1基因指含有5’端非编码区核苷酸序列的全基因。
由上述引物衍生的引物序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQID №1和/或SEQ ID №2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
上述引物既适用于蓝舌病毒各血清型的实时荧光定量PCR检测中，也可用于该病毒的常规PCR检测技术中，其检测的对象是BTV的NS1基因。若以待测样品经反转录形成的cDNA为模板，在上述引物的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有121bp大小的条带，则样品中含有BTV。
本发明还提供了用于对蓝舌病毒进行定性、定量检测的TaqMan探针。
本发明所提供的TaqMan探针，可具有序列表中SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的DNA序列；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
所述报告荧光基团可为FAM、VIC等，荧光淬灭基团可为TAMRA、MGB等。
为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端要经过磷酸化处理。
将具有序列表中SEQ ID NO3的TaqMan探针命名为TaqManProbel(NS1)，序列表中的SEQ ID №3由25个碱基组成，该序列为BTV NS1基因自5’端第70-94位碱基的反向互补序列；将具有序列表中SEQ ID NO4的TaqMan探针命名为TaqManProbe2(NS1)，序列表中的SEQ ID №4由23个碱基组成，该序列为BTV NS1基因自5’端第72-94位碱基。
上述TaqMan探针序列的衍生序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ ID №3或SEQ ID №4的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。
本发明的第三个目的是提供一种检测蓝舌病毒的实时荧光定量PCR试剂盒。
本发明所提供的检测蓝舌病毒的实时荧光定量PCR试剂盒，可包括用于对蓝舌病毒进行定性、定量检测的引物和TaqMan探针。
本发明提供了用于对蓝舌病毒进行定性、定量检测的引物和TaqMan探针，通过提取待测样品的总RNA，并通过逆转录得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中蓝舌病毒RNA的目的。本发明所提供的引物及探针可用于临床及科研中对感染蓝舌病的动物中的蓝舌病毒RNA进行定性及定量分析，对判断蓝舌病的发生、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义。本发明将在动物医学检测领域发挥重要作用。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为BTV-3、5、8、10、11、21、22、(A)样品PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果图2为菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果图3为阳性克隆质粒pGEM-T120的琼脂糖凝胶电泳检测结果图4A为不同稀释度的pGEM-T120标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线图4B为6种BTV血清型样品的实时荧光定量PCR扩增曲线图5为检测BTV的实时荧光定量PCR标准曲线以及6种BTV血清型的样品在标准曲线上的位点图6为2种其它BTV血清型样品的实时荧光定量PCR扩增曲线具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物均由三博公司合成，所用TaqMan探针由上海生工合成，所有序列测定工作均由华大公司完成。
实施例1、用于对蓝舌病毒(BTV)进行定性、定量检测的引物及TaqMan探针的设计根据GenBank中8个血清型BTV的NS1基因序列，利用DNAStar软件对该8个血清型BTV的NS1基因进行序列比对，选取NS1基因5’端的最保守区域序列作为检测序列。由于该8个血清型BTV NS1基因中有6个血清型BTV NS1基因序列(GenBankAccession No.AY462225、M97762、NC_006025、X15891、X56735、Y00422)包括较长的5’非编码区序列，利用DNAStar软件对该6个血清型/株BTV NS1基因序列进行比对，然后根据比对结果设计引物及TaqMan探针，序列如下上游引物P(NS1-1)5’-GTTCTCTAGTTGGCAACCACC-3’(序列表中SEQ ID NO1)，Tm为57℃；下游引物P(NS1-2)5’-GTGACTGCAAGTCCATTGAGG-3’(序列表中SEQ ID NO2)，Tm为57℃。
TaqManProbe1(NS1)5’FAM-AGTTCTCGTGGCATTTGCGTAATCC-TAMRA3’(序列表中SEQ IDNO3)，Tm为67℃。
TaqManProbe2(NS1)5’FAM-ATTACGCAAATGCCACGAGAACT-TAMRA3’(序列表中SEQ IDNO4)，Tm为62℃。
将上游引物命名为P(NS1-1)，序列表中的SEQ ID №1由21个碱基组成，该序列位于BTV NS1基因(又称S6基因)自5’端第10-30碱基；将下游引物命名为P(NS1-2)，SEQ ID №2由21个碱基组成，该序列为BTV NS1基因自5’端第110-130碱基的反向互补序列。所述NS1基因指含有5’端非编码区核苷酸序列的全基因。
将具有序列表中SEQ ID NO3的TaqMan探针命名为TaqManProbe1(NS1)，序列表中的SEQ ID №3由25个碱基组成，该序列为BTV NS1基因自5’端第70-94位碱基的反向互补序列。
将具有序列表中SEQ ID NO4的TaqMan探针命名为TaqManProbe2(NS1)，序列表中的SEQ ID №4由23个碱基组成，该序列为BTV NS1基因自5’端第72-94位碱基。
将上述TaqMan探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA，并将探针的3’端进行磷酸化处理。
实施例2、用本发明的引物对蓝舌病毒进行BTV的常规PCR检测1、BTV样品的处理选用经细胞培养的BTV、血浆及组织中的8个血清型(分别为BTV3、BTV5、BTV8、BTV10、BTV11、BTV21、BTV22、BTV(A)型)的BTV作为待测BTV样品。
用下述方法对经细胞培养的BTV样品进行处理先接种BTV至BHK-21细胞，在37℃的CO2温箱中培养至细胞病变达80％以上，然后在无菌条件下将病变细胞移入灭菌离心管中，8000rpm离心30min，在无菌条件下将上清移入另一离心管中暂置于室温下，将细胞沉淀反复冻融三次后加入上清，吹打混匀，8000rpm离心30min，取上清用于BTV RNA的提取。
血浆及组织中的BTV样品无需进行处理。
2、BTV RNA的提取上述BTV样品各取300μl，用Body-fluid viral DNA/Viral RNA Mini-prep试剂盒(V-Gene)并参照试剂盒说明书提取RNA。
3、反转录分别以步骤2提取的不同BTV样品的RNA为模板，反转录合成其cDNA，反应体系及反应条件为取BTV RNA 9μl，加下游特异性引物P(NS1-2)2μl(50pg/μl)，混匀，97℃水浴5min，迅速置于冰水上5min，再在冰盒上加入M-MLV缓冲液4μl、dNTPs(2.5mM each)4μl(TaKaRa)、M-MLV RT 1μl(TaKaRa)、RNasin 0.5μl(TaKaRa)，混匀，42℃反应1h。
4、常规PCR检测分别以步骤3反转录合成的不同BTV样品的cDNA为模板，在本发明引物P(NS1-1)和P(NS1-2)的引导下进行PCR扩增，25μl PCR反应体系为10×PCR缓冲液 2.5μl，dNTPs(2.5mM each)2μl，P(NSl-1)0.5μl(50pg)，P(NS1-2)0.5μl(50pg)，cDNA 5μl，Taq酶1μl(TaKaRa)，ddH2O 13.5μl。PCR反应条件为先94℃ 5min；然后94℃ 45s，45℃ 45s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 7min，4℃终止反应。反应结束后，取PCR扩增产物各6μl进行2.5％琼脂糖凝胶电泳检测(70V电泳30min)，检测结果如图1所示(泳道MMarker DL2000，泳道ABTV3，泳道BBTV5，泳道CBTV8，泳道DBTV10，泳道EBTV11，泳道FBTV21，泳道GBTV22，泳道HBTV(A))，结果经细胞培养的8个血清型的BTV样品(BTV-3、5、8、10、11、21、22、(A))经PCR扩增均得到了121bp的目的条带，与预期结果相符，表明本发明的引物可用于蓝舌病毒的常规PCR检测。
实施例3、用本发明的引物及TaqMan探针进行BTV的实时荧光定量PCR(real-timeFQ PCR)检测1、BTV的培养及处理选用经细胞培养的BTV作为待测BTV样品，并用与实施例2中相同的方法对经细胞培养的BTV样品进行处理。
2、BTV RNA的提取取步骤1获得的BTV样品300μl，用与实施例2中相同的方法提取RNA。
3、反转录以步骤2提取的BTV样品的RNA为模板，反转录合成其cDNA，反应体系及反应条件与实施例2中相同。
4、real-time FQ PCR标准品的制备(1)BTV-5的PCR扩增产物回收取实施例2获得的检测样品BTV5的PCR扩增产物50μl，对其进行2.5％琼脂糖凝胶电泳(70V电泳30min)，在紫外灯下切取121bp的目的条带，然后用Wizard SVGel and PCR Clean-up System(Promega)并参照试剂盒说明书对该目的片断进行回收及纯化。
(2)连接将步骤(1)回收的121bp的目的片断与pGEM-T Easy Vector进行连接，连接体系及条件为回收产物8μl，2×T4DNA连接酶缓冲液10μl，pGEM-T Easy Vector 1μl(Promega)，T4DNA连接酶1μl(Promega)，混匀，16℃反应2h后，4℃放置12-24h。
(3)转化取步骤(2)的连接产物20μl，加入100μl用CaCl2法制备的DH5α感受态细胞，轻轻旋转混匀，冰水上放置30min，然后42℃热激2min，再迅速置冰水上5min，加入800μl LB液体培养基，37℃摇床培养1h，6000rpm离心5min，弃约800μl上清，用剩余上清吹打悬浮沉淀，并将菌悬液涂布于LB抗性选择平板(含氨苄青霉素(Amp)50mg/L，50mg/mL X-gal 16μl，200mg/mL IPTG 4μl)上，在37℃下培养12-24h。
(4)菌落PCR检测随机挑取在LB抗性选择平板上长出的3个白斑进行菌落PCR扩增，PCR反应体系及反应条件与实施例2中的常规PCR所用的相同。反应结束后，取PCR扩增产物6μl，对其进行2.5％琼脂糖凝胶电泳检测(70V电泳30min)，检测结果如图2所示(泳道MMarker DL2000，泳道A菌落1，泳道B菌落2，泳道C菌落3)，结果其中1个克隆(菌落1)经PCR扩增出现了121bp的目的条带。
(5)提取阳性克隆的质粒挑取步骤(4)经初步鉴定的阳性单克隆，将其接种于含50mg/L Amp的LB液体培养基中，在37℃、300rpm下摇床培养14h，然后用高纯度质粒提取试剂盒(法特捷)提取质粒，将该质粒命名为pGEM-T120。取提取的质粒pGEM-T120 5μl，对其进行2.5％琼脂糖凝胶电泳检测(70V电泳30min)，检测结果如图3所示(泳道MMarker DL2000，泳道A和泳道BpGEM-T120)，质粒pGEM-T120的条带大小约为3kb，与预期结果相符。
(6)测序将携带有pGEM-T120的重组菌命名为DH5α(pGEM-T120)，取DH5α(pGEM-T120)菌液进行测序，结果pGEM-T120所携带扩增片断具有序列表中SEQ ID №5的核苷酸序列，表明pGEM-T120所携带的121bp的扩增片断与BTV NS1基因中的待扩增序列(BTV NS1基因自5’端第10-130位碱基)完全一致，构建的质粒序列正确。
(7)pGEM-T120的浓度测定取pGEM-T120原液20μl，稀释至100μl ddH2O中，用紫外分光光度计测定OD260值，结果测得pGEM-T120原液的浓度为31.7μg/mL，1μl pGEM-T120原液含9×109个拷贝。
5、用TaqManProbe1(NS1)对BTV样品进行real-time FQ PCR检测(1)绘制标准曲线将pGEM-T120原液按10×系列稀释为104、105、106、107个拷贝进行real-time FQPCR检测，25μl反应体系为10×PCR缓冲液2.5μl，dNTPs(2.5mM each)2μl，P(NS1-1)1μl(50pg)，P(NS1-2)1μl(50pg)，TaqManProbe1(NS1)0.5μl(25pg)，pGEM-T120 1μl，Taq酶1μl(TaKaRa)，MgCl2(25mM)2.5μl(Promega)，ddH2O 13.5μl。反应条件为先94℃ 3min；然后94℃30s，45℃45s，72℃20s，共40个循环。结果各稀释度的pGEM-T120均能产生荧光信号，Ct值分别为29.63、24.83、21.06、18.08，扩增曲线见图4A，定量数据见表1，由扩增曲线得到的标准曲线斜率为-3.933，标准曲线见图5(Y＝-3.933X+45.257)。
表1不同稀释度pGEM-T120以及BTV-5、8、10、21、22、(A)样品荧光定量PCR的定量数据
(2)BTV样品的real-time FQ PCR检测首先对6个BTV血清型的待测样品(BTV5、BTV8、BTV10、BTV21、BTV22、BTV(A))进行real-time FQ PCR检测，除模板(由RNA反转录形成的cDNA)外，反应体系及反应条件与步骤(1)相同，扩增曲线见图4B，定量数据见表1，在标准曲线上的位点见图6，其Ct值依次为22.50、35.92、32.98、26.24、28.18、28.07，扩增起始浓度拷贝数依次为5.58×105、1.73×102、1.03×103、6.03×104、2.00×104、2.12×104。
然后对另外2个BTV血清型样品(BTV3、BTV11)用相同方法进行real-time FQ PCR检测，扩增曲线见图6，其Ct值依次为22.20、19.37，扩增起始拷贝数依次为7.21×105、3.85×106。
此外，用TaqManProbe2(NS1)对上述BTV样品进行real-time FQ PCR检测，结论相同，表明本发明的TaqManProbe1(NS1)和TaqManProbe2(NS1)均可用于BTV的real-time FQ PCR检测。
序列表<160>5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gttctctagt tggcaaccac c21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gtgactgcaa gtccattgag g21<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3agttctcgtg gcatttgcgt aatcc 25<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4attacgcaaa tgccacgaga act23<210>5<211>121<212>DNA<213>蓝舌病毒(bluetongue virus，BTV)<400>5gttctctagt tggcaaccac caaacatgga gcgctttttg agaaaataca acatcagtgg60ggattacgca aatgccacga gaactttttt ggctatttca cctcaatgga cttgcagtca120c12权利要求
1.用于对蓝舌病毒进行定性、定量检测的引物，其上游引物具有序列表中的SEQID №1，下游引物具有序列表中的SEQ ID №2。
2.权利要求1所述引物的衍生序列。
3.根据权利要求2所述的衍生序列，其特征在于所述衍生序列是在SEQ ID №1和/或SEQ ID №2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
4.用于对蓝舌病毒进行定性、定量检测的TaqMan探针，具有序列表中SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的DNA序列；所述探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
5.根据权利要求4所述的TaqMan探针，其特征在于所述报告荧光基团为FAM或VIC，淬灭荧光基团为TAMRA或MGB。
6.根据权利要求4或5所述的TaqMan探针，其特征在于所述探针的3’端经过磷酸化处理。
7.权利要求4所述TaqMan探针的衍生序列。
8.根据权利要求7所述的衍生序列，其特征在于所述衍生序列是在SEQ ID №3或SEQ ID №4的基础上，在序列的5’端和/或3’端添加一个或多个碱基得到的序列。
9.检测蓝舌病毒的实时荧光定量PCR试剂盒，包括权利要求1所述的用于对蓝舌病毒进行定性、定量检测的引物和权利要求4所述的用于对蓝舌病毒进行定性、定量检测的TaqMan探针。
全文摘要
本发明公开了用于对蓝舌病毒进行定性、定量检测的引物和TaqMan探针。该引物的上游引物具有序列表中的SEQ ID №1，下游引物具有序列表中的SEQ ID №2。该TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的DNA序列；所述探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。本发明所提供的引物及探针可用于临床及科研中对感染蓝舌病的动物中的蓝舌病毒RNA进行定性及定量分析，对判断蓝舌病的发生、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义。本发明将在动物医学检测领域发挥重要作用。
文档编号C12Q1/68GK1880482SQ200610081309
公开日2006年12月20日 申请日期2006年5月16日 优先权日2006年5月16日
发明者章金刚, 尹惠琼, 吕茂民 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所