I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法。

背景技术：

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的一种在雏鸭间传播迅速和高度致死性的传染病，主要特征为肝脏肿大，有出血斑点和神经症状，在新疫区，本病致死率很高，可达90％以上。鸭肝炎病毒I型属于小RNA病毒科，呈球形或类球形，直径在20-40NM，无囊膜，无血凝性，可在鸭、鸡、鹅胚尿囊腔增殖。病毒抵抗力强，在自然环境中可较长时间存活。DHV病毒II型属于星状病毒，DHV病毒III型属于小RNA病毒。DVH病毒三种血清型之间无交叉保护作用。目前在我国鸭肝炎病毒I型是主要的流行血清型。

鸭瘟又名鸭病毒性肠炎，是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。该病可引起7日龄以上的雏鸭发病。该病的特征是流行广泛，传播迅速，发病率和死亡率极高。引起鸭瘟的病原体鸭瘟病毒(DPV)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)疱疹病毒属(Herpesvirus)中的滤过性的病毒，病毒粒子呈球形，直径为120～180nm，有囊膜，病毒核酸型为DNA。病毒在病鸭体内分散于各种内脏器官、血液、分泌物和排泄物中，其中以肝、肺、脑含毒量最高。本病毒对禽类和哺乳动物的红细胞没有凝集现象，毒株间在毒力上有差异，但免疫原性相似。

I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒是危害养鸭业的两种重要病原，引起雏鸭混合感染，导致大批雏鸭染病死亡，造成严重的损失。目前对这两种病毒通常需要分别进行检测，费时费力，成本较高。多重PCR(multiplex PCR)又称多重引物PCR或复合PCR，是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，可用于同时鉴定多种微生物。授权公告号为CN104450939B的发明专利公开了一种粉大蕉枯萎病菌的二重PCR分子快速检测方法，可同时对粉蕉枯萎病和大蕉枯萎病的病菌进行检测。灵敏度高、方便快捷、省时省力。因此，如果能开发出一种同时检测I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的方法，将会大大节约人力和时间成本。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供了一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括如下步骤：

(1)选取I型鸭肝炎病毒中高度保守的基因为目标片段I，设计并合成相应的特异性引物对I，所述特异性引物对I的序列如下：

上游引物P1：5'AGCTTAAGGCCCGGTGCCCCGTTCT 3'(如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物P2：5'GGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAA 3'(如SEQ ID NO.2所示)；

(2)选取鸭瘟病毒中高度保守的基因为目标片段Ⅱ，设计并合成相应的特异性引物对Ⅱ，所述特异性引物对Ⅱ的序列如下：

上游引物P3：5'TGGGAAGGCTTTCGGTCGC 3'(如SEQ ID NO.3所示)；

下游引物P4：5'CATTCGCGCCTTTGCTAAATTCTCT 3'(如SEQ ID NO.4所示)；

(3)分别对I型鸭肝炎病毒的基因组RNA和鸭瘟病毒的基因组DNA进行提取；

(4)将步骤(3)中得到的DNA和RNA混合作为模板，联合使用特异性引物I和特异性引物Ⅱ进行二重PCR扩增；

(5)用琼脂糖凝胶电泳对步骤(4)中得到的二重PCR产物进行分析。

上述方法可以同时对DNA病毒(鸭瘟病毒)和RNA病毒(I型鸭肝炎病毒)进行扩增和检测，从一套实验中同时得到两份结果，大大减少分别检测所花费的时间和人力成本；特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ均具有良好的特异性，能够扩增出高度特异的片段，并且杂质极少，也为后续的鉴定操作提供了便利。

进一步地，所述二重PCR的反应体系中包括如下组分：

I型鸭肝炎病毒基因组RNA≥2.65ng/mL、鸭瘟病毒基因组DNA≥1.35ng/mL、特异性引物对I0.15～0.4μM、特异性引物对Ⅱ0.15～0.4μM、dNTP 0.4mM、M-MLV 1U/μL、RNA酶抑制剂2U/μL、DNA聚合酶0.05U/μL以及体积份数为10～30％的10×PCR反应液。

进一步地，所述反应体系中所述特异性引物对I和所述特异性引物对Ⅱ的浓度均为0.35μM。

进一步地，所述反应体系中所述I型鸭肝炎病毒基因组RNA的浓度为2.65*10-3～2.65μg/mL，所述鸭瘟病毒基因组DNA的浓度为1.35*10-3～1.35μg/mL。

进一步地，所述二重PCR的反应条件如下：

45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，54～60℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

上述反应体系和反应条件均经过优化，使用其对I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒同时进行PCR扩增，可以在同一条件下、一次实验中同时获得两种获得产量较高、特异性好、纯度高的产物，操作简单、省时省力；RNA酶抑制剂可以抑制环境中存在的微量RNA酶的活性，防止模板RNA被降解，有助于后续实验的顺利进行。

进一步地，所述目的片段I的长度为399bp，所述目的片段Ⅱ的长度为232bp。

本发明的有益效果是：本发明提供的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法操作简单、省时省力，可以在同一个反应体系中进行PCR和RT-PCR，同时对DNA病毒(鸭瘟病毒)和RNA病毒(I型鸭肝炎病毒)进行扩增和检测，从一套实验中同时得到两份结果，大大减少分别检测所花费的时间和人力成本；根据I型鸭肝炎病毒RNA和鸭瘟病毒DNA的保守序列设计的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ均具有良好的特异性，能够扩增出高度特异的片段，并且产物杂质极少，适合推广使用。

附图说明

图1为不同引物用量的二重PCR扩增电泳图；

其中：M:DL2000DNA Marker；1:0.3μL；2:0.4μL；3:0.5μL；4:0.6μL；5:0.7μL；6:0.8μL；

图2为不同退火温度的二重PCR扩增电泳图；

其中：M:DL2000DNA Marker；1:54℃；2:55℃；3:56℃；4:57℃；5:58℃；6:59℃；7:60℃；

图3为不同模板浓度的二重PCR扩增电泳图；

其中：M：DL2000DNA Marker；1:2.65μg/mL DHV+1.35μg/mL DEV；2:0.265μg/mL DHV+0.135μg/mL DEV；3:26.5ng/mL DHV+13.5ng/mL DEV；4:2.65ng/mL DHV+1.35ng/mL DEV；5:0.265ng/mL DHV+0.135ng/mL DEV；6:26.5pg/mL DHV+13.5pg/mL；

图4为不同病毒种类的二重PCR扩增电泳图；

其中：M：DL2000DNA Marker；1.DHV+DEV；2.DHV；3.DEV；4.AIV；5.ARV；6.AEV；7.EDSV；8.GPV；9.MDPV；10.NDV；11.DTMUV。

具体实施方式

实施例1

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括如下步骤：

(1)选取I型鸭肝炎病毒中高度保守的基因为目标片段I，设计并合成相应的特异性引物对I，所述特异性引物对I的序列如下：

上游引物P1：5'AGCTTAAGGCCCGGTGCCCCGTTCT 3'；

下游引物P2：5'GGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAA 3'；

(2)选取鸭瘟病毒中高度保守的基因为目标片段Ⅱ，设计并合成相应的特异性引物对Ⅱ，所述特异性引物对Ⅱ的序列如下：

上游引物P3：5'TGGGAAGGCTTTCGGTCGC 3'；

下游引物P4：5'CATTCGCGCCTTTGCTAAATTCTCT 3'；

(3)分别对I型鸭肝炎病毒的基因组RNA和鸭瘟病毒的基因组DNA进行提取；

(4)将步骤(3)中得到的DNA和RNA混合作为模板，联合使用特异性引物I和特异性引物Ⅱ进行二重PCR扩增；

(5)用琼脂糖凝胶电泳对步骤(4)中得到的二重PCR产物进行分析。

实施例2

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例2所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.3μL、2×PCR缓冲液6.0μL、10mmol/L的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、200U的反转录酶1.0μL、40U/μL的RNA酶抑制剂0.5μL，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例3

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例3所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(0.265μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(0.135μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.4μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例4

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例2所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(26.5ng/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(13.5ng/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.5μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例5

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例3所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65ng/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(1.35ng/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.6μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例6

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例2所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例7

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例3所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(0.265μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(0.135μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.8μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例8

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例2所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例9

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例3所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例10

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例3所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例11

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例2所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例12

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例3所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例13

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例2所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

实施例14

一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法，包括实施例3所述的各步骤，其中二重PCR的反应体系和反应条件如下：

反应体系：I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA 1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U，，用ddH₂O水补足至20μL。

反应条件：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸40s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。

对照例1

对I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒进行二重PCR扩增，采用的模板浓度为I型鸭肝炎病毒RNA0.265ng/ml、鸭瘟病毒DNA0.135ng/ml，反应体系和反应条件同实施例14。

对照例2

对I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒进行二重PCR扩增，采用的模板浓度为I型鸭肝炎病毒RNA26.5pg/ml、鸭瘟病毒DNA13.5pg/ml，反应体系和反应条件同实施例14。

对照例3

以I型鸭肝炎病毒(DHV)的基因组RNA为模板，采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。

对照例4

以鸭瘟病毒(DEV)的基因组DNA为模板，采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。

对照例5

以禽流感病毒(AIV)的基因组RNA为模板，采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。

对照例6

以鸭黄病毒(ARV)的基因组RNA为模板，采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。

对照例7

以禽传染性脑脊髓炎病毒(AEV)的基因组RNA为模板，采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。

对照例8

以减蛋综合征病毒(DESV)的基因组DNA为模板，采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。

对照例9

以小鹅瘟病毒(GPV)的基因组DNA为模板，采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。

对照例10

以番鸭细小病毒(MDPV)的基因组DNA为模板，采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。

对照例11

以新城疫病毒(DESV)的基因组RNA为模板，采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。

对照例12

以鸭坦布苏病毒(DESV)的基因组RNA为模板，采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。

实验例1

二重PCR反应条件的优化

(1)最适引物用量的确定

以实施例2～7为实验例1～6，分别按照所述反应体系和反应条件进行二重PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳并用紫外灯扫描拍照，比较各条带的清晰度和宽度。

如图1所示，当退火温度控制在58℃时，10μmol/L的引物用量在0.3～0.8μL范围内均可以获得明亮、清晰的条带、达到较好的PCR效果，其中引物用量达到0.7μL时，两条条带的清晰度和亮度均达到最适效果。因此，反应体系中引物的最适用量为0.7μL，即引物的最适浓度为0.35μM。

(2)最适退火温度的确定

以实施例8～14为实验例1～7，分别按照所述反应体系和反应条件进行二重PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳并用紫外灯扫描拍照，比较各条带的清晰度和宽度。

如图2所示，当10μmol/L的引物用量控制在0.7μL、退火温度在54～60℃时范围内梯度变化时，均可以获得明亮、清晰的条带、达到较好的PCR效果，其中引物用量退火温度达到58℃时，两条条带的清晰度和亮度均达到最佳效果。因此，反应条件中最适的退火温度为58℃。

实验例2

敏感性试验

以实施例2～5中得到的PCR产物为实验组2～5，以对照例1～2中得到的PCR产物为对照组1～2，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳电压120V、时间20min，比较条带情况。

如图3所示，经过二重PCR后能扩增出肉眼可见的条带的最低浓度为2.65ng/mL和1.35ng/mL，低于该浓度则无法扩增。因此，该二重PCR方法最低能检测2.65ng/mL的I型鸭肝炎病毒RNA和1.35ng/mL的鸭瘟病毒DNA。

实验例3

特异性试验

以实施例12中得到的扩增产物为实验例1，分别以对照例3～12中得到的扩增产物作为对照组1～10，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳电压120V、时间20min，比较条带情况。

如图4所示，DHV扩增条带为399bp，DEV扩增条带为232bp，均与实施例14中的扩增条带大小相符；而AIV，ARV，REV，EDSV，GPV，MDPV，NDV，DTMUV病毒均未扩增出条带。这表明该二重PCR扩增方法具有高度特异性。

实验例4

临床试验

从江苏徐州地区的鸭群中随机抽取166份肛拭子，依照实施例20提供的检测方法对样品中的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒同时进行检测。结果显示，检出I型鸭肝炎病毒2份，阳性率为1.2％；鸭瘟病毒43份，阳性率为26％；未检测出其他常见病毒。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120> 鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcttaaggc ccggtgcccc gttct 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtagggtag ggaatagtaa agtaa 25

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgggaaggct ttcggtcgc 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cattcgcgcc tttgctaaat tctct 25