H6亚型禽流感病毒荧光定量RT‑PCR检测方法与流程

本发明涉及一种H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法。

(二)发明背景

禽流感是由正黏病毒科中流感病毒属的禽流感病毒所引起的危害禽类养殖的一种重要传染病。根据禽流感病毒的致病性强弱，可将禽流感病毒分为高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒和无致病性禽流感病毒3种。根据表面抗原的鉴定结果，从禽类分离到的流感病毒有17种不同的血凝素(HA)和10种不同的神经氨酸酶(NA)，可组合产生众多亚型。迄今为止已从禽类体内分离到上千种毒力各异的病毒株，不同亚型病毒株对宿主的致病力差异显著。H6亚型AIV为低致病力病毒株，分布范围广，该亚型病毒可与其他病原微生物协同作用导致禽类发病，目前，在我国及其他一些国家和地区的野鸟和家禽中已经广泛存在，近几年来其流行和传播呈现上升的趋势。H6禽流感病毒感染后会出现轻微的呼吸道和消化道症状，死亡率较低；但是其以通过基因重排为能感染人的高致病性禽流感病毒提供基因，从而产生无法预测致病性和传染性的新变异株，这将对禽类和人类健康存在很大的潜在威胁。近年来，也出现了H6禽流感病毒直接感染人的例子，它也成为人畜共患病的一个重要病原。

H6亚型禽流感传播范围广，危害大，一个操作简单结果精确的快速检测方法的建立就显得尤为重要。虽然根据临床症状以及病例变化能够初步诊断，但是还是需要传统实验室诊断方法进行确诊。而传统的实验室诊断方法又存在耗时较长、敏感性低、不利于快速检测等缺点。基于分子生物学技术的实时荧光RT-PCR技术，可快速、灵敏的实现病原核酸的检测，实现疫病的及时诊断和防控。目前，分子检测技术已经在流感的检测中得到了广泛的应用。

(三)

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高、操作简便的H6亚型禽流感荧光定量RT-PCR检测方法，该检测方法迅速准确，能极大缩短检测周期，为疫病的发现和防控提供宝贵时间和技术保障，并能尽量避免检测过程中可能造成的生物污染。

一种H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其步骤如下：

1、引物设计

参照GenBank中公开发表的H6亚型禽流感病毒HA基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计了特异性引物序列：

2、病毒RNA提取

①取H6亚型禽流感病毒悬液200μL，加入600μL Trizol液，混匀；

②室温放置5min，加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，混匀器上震荡离心管5秒，于4℃下12000g离心15min；

③取上层水相于一新的离心管，加入0.5ml异丙醇(-20℃预冷)，不吸出中间层，颠倒混匀；

④于4℃下12000g离心15min，小心弃去上清液，倒置于吸水纸上，再加入600μL75％乙醇，颠倒洗涤；

⑤于4℃下12000g离心10min，小心弃去上清液，倒置于吸水纸上；

⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；

⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中5000g离心5s。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增，若需长期保存须放置-70℃冰箱。

3、RT-PCR扩增

①反转录合成cDNA：反应体系包括：Random 6mers 2μl，dNTP Mixture 1μl，Template RNA 3μl，Rnase free dH₂O 5μl，混匀后65℃保温5min后，冰上迅速冷却；向其中加入5×PrimeScript Buffer 4μl，Rnase Inhibitor 0.5μl，PrimeScript RTase 1μl，加Rnase free dH₂O定容至20μl，缓慢混匀。30℃下反应10min。然后95℃5min使酶失活。

②PCR扩增：PCR总体系为25μl，其中10×Buffer 2.5μl，dNTPs 2μl，上、下游引物(H6F-1和H6R-1)各1μl，Taq DNA聚合酶0.25μl，模板2μl，余下用灭菌ddH₂O补足。反应条件为：95℃预变性3min，然后95℃30s，53℃30s，72℃2min，进行40个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，取6μl PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳。

4、质粒标准阳性模板的制备

①确定阳性质粒：PCR产物在1％琼脂凝胶中电泳后，使用胶回收试剂盒提取DNA，然后将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化到DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化的单菌落进行单克隆培养，EcoRⅠ和PstⅠ双酶切鉴定挑取的阳性质粒，并进行测序分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒。

②阳性质粒浓度的测定：将质粒提取物使用超纯水10×稀释，在260nm与280nm波长下测定质粒的含量，根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数。

注：每个碱基的平均分子量为330

5、荧光定量PCR标准曲线绘制

将上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释(10⁷～10²copies/μL)用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系20μl，其中Passive Reference Dye 0.4μl，上、下游引物(H6F-2和H6R-2)各0.4μl，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix10μl，模板1μl，超纯水7.8μl。反应条件为：94℃30s；94℃5s，60℃15s，60℃34s，40个循环。所述的荧光定量标准品为含有位于HA基因上H6F-2和H6R-2之间的基因片段(1319～1468之间)、大小约为149bp的基因片段的质粒。

本发明的有益效果主要体现在：

⑴灵敏度高：通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测得出检测的最低浓度为35.84copies/reaction。

⑵特异性强：除H6亚型的毒株均能检测到阳性的荧光信号外，而其他亚型流感病毒H1、H3、H5、H7等均为阴性，新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒等均为阴性。

⑶重复性好：选择不同浓度的5个质粒标准品进行荧光定量PCR检测，每个标准品在同一反应条件下重复3次作为同一批次内重复试验，然后在另一时间再重复一次作为不同批次间重复试验，通过计算得出，批次内变异系数的mean±S.D.为0.82±0.51％，批次间变异系数的mean±S.D.为1.15±0.26％。

附图说明：

图1是H6亚型禽流感病毒荧光定量PCR标准品扩增曲线

图2是H6亚型禽流感病毒荧光定量PCR标准曲线

图1、2说明：本发明所建立的H6亚型禽流感病毒荧光定量PCR标准曲线灵敏度较高符合相关要求。

具体实施方式：

参照GenBank中公开发表的H9亚型禽流感病毒HA基因序列，设计了特异性引物序列：

实施例1：以已知H6亚型禽流感病毒为检测材料，并以超纯水为阴性对照。

1、H6亚型禽流感病毒RNA提取

①取H6亚型禽流感病毒悬液200μL，加入600μL Trizol液，混匀；

②室温放置5min，加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，混匀器上震荡离心管5秒，于4℃下12000g离心15min；

③取上层水相于一新的离心管，加入0.5ml异丙醇(-20℃预冷)，不能吸出中间层，颠倒混匀；

④于4℃下12000g离心15min，小心弃去上清液，倒置于吸水纸上，再加入600μL75％乙醇，颠倒洗涤，；

⑤于4℃下12000g离心10min，小心弃去上清液，倒置于吸水纸上；

⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；

⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中5000g离心5s。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增，若需长期保存须放置-70℃冰箱。

2、反转录合成cDNA

反应体系包括：Random 6mers 2μl，dNTP Mixture 1μl，Template RNA 3μl，Rnase free dH₂O 5μl，混匀后65℃保温5min后，冰上迅速冷却；向其中加入5×PrimeScript Buffer 4μl，Rnase Inhibitor 0.5μl，PrimeScript RTase 1μl，加Rnase free dH₂O定容至20μl，缓慢混匀。30℃下反应10min。然后95℃5min使酶失活。

3、荧光定量PCR检测

将上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释(10⁷～10²copies/μL)用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系20μl，其中Passive Reference Dye 0.4μl，上下游引物(H6F-2和H6R-2)各0.4μl，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix10μl，模板1μl，超纯水7.8μl。反应条件为：94℃30s；94℃5s，60℃15s，60℃34s，40个循环。最后根据标准曲线分析被检材料中的病毒核酸量(copies)。

结果说明本方法能有效地检测H6亚型禽流感病毒核酸量。

实施例2：待检病料(病禽咽喉拭子和泄殖腔拭子)中H6亚型禽流感病毒的荧光定量PCR检测。

1、样品制备：

病禽咽喉拭子和泄殖腔拭子在混合器上进行充分混合，用灭菌镊子将棉拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，编号备用。

2、病毒RNA提取

①取样品病毒悬液200μL，加入600μL Trizol液，混匀；

②室温放置5min，加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，混匀器上震荡离心管5秒，于4℃下12000g离心15min；

③取上层水相于一新的离心管，加入0.5ml异丙醇(-20℃预冷)，不能吸出中间层，颠倒混匀；

④于4℃下12000g离心15min，小心弃去上清液，倒置于吸水纸上，再加入600μL75％乙醇，颠倒洗涤，；

⑤于4℃下12000g离心10min，小心弃去上清液，倒置于吸水纸上；

⑥小心弃去上清液，然后室温干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；

⑦然后将RNA溶于无RNA酶水中5000g离心5s。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增，若需长期保存须放置-70℃冰箱。

3、反转录合成cDNA

反应体系包括：Random 6mers 2μl，dNTP Mixture 1μl，Template RNA 3μl，Rnase free dH₂O 5μl，混匀后65℃保温5min后，冰上迅速冷却；向其中加入5×PrimeScript Buffer 4μl，Rnase Inhibitor 0.5μl，PrimeScript RTase 1μl，加Rnase free dH₂O定容至20μl，缓慢混匀。30℃下反应10min。然后95℃5min使酶失活。

4、荧光定量PCR检测

取上述反转录获得的cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测，同时制定标准曲线，反应体系20μl，其中Passive Reference Dye 0.4μl，上下游引物(H6F-2和H6R-2)各0.4μl，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix10μl，模板1μl，超纯水7.8μl。反应条件为：94℃30s；94℃5s，60℃15s，60℃34s，40个循环。最后根据标准曲线分析被检材料中的病毒核酸量(copies)。

结果说明本方法能敏感地检测病料中H6亚型禽流感病毒核酸量。