一种鳜传染性脾肾坏死病毒灭活快速检验试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及一种传染性脾肾坏死病毒灭活快速检测试剂盒及检测方法，具体涉及一种基于病毒mRNA监测的ISKNV灭活快速检测荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

鳜(Siniperca chuatsi)是我国优质淡水鱼消费和出口创汇的重要品种，因其味道鲜美，蛋白质含量高而深受广大消费者的喜爱。然而严重的病害问题已成为限制鳜鱼养殖业发展的主要瓶颈。鳜传染性脾肾坏死病毒病(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)，具有发病率高、致病率高、造成经济损失大等特点，其防控技术研究成为鱼病研究者重要课题之一。疫苗接种是预防鱼类病毒病最经济有效手段，细胞灭活疫苗因具有制备简便、免疫效果稳定、研发周期短而成为最具产业前景的商品化疫苗之一。病毒灭活检验是ISKNV细胞灭活疫苗制备中重要的一环，但传统病毒灭活检测方法是通过细胞盲传3代、同时通过接种鱼体验证病毒是否灭活完全，整个过程约需30天的时间，这大大延长了疫苗生产周期，降低了疫苗的生产能力，因此急需建立一种ISKNV灭活快速检验方法。病毒在细胞增殖过程中病毒相关基因持续转录，因此可对病毒mRNA进行监测而检验病毒是否灭活。针对RNA病毒，余芬等采用链特异性RT-PCR建立了一种脊髓灰质炎病毒灭活快速验证方法；Kim等以黄瓜绿斑花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)基因组热敏感区为靶标建立了该病的热灭活RT-PCR快速检测方法；针对DNA病毒，Yuasa等通过RT-PCR监测锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus，KHV)mRNA来检测复制中的病毒。而针对鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)灭活快速检测方法尚未见报道。本发明从ISKNV感染CPB细胞系后表达谱结果中挑选表达量最高病毒早期基因为靶标基因，以该基因mRNA监测作为病毒是否灭活完全指标，建立ISKNV灭活快速检测荧光定量RT-PCR方法，旨在缩短ISKNV细胞灭活疫苗生产过程中灭活检验周期，提高疫苗生产效率。

技术实现要素：

本发明的目的在于建立一种传染性脾肾坏死病毒灭活快速检测试剂盒及检测方法。

本发明所采取的技术方案是：从ISKNV感染CPB细胞系后表达谱结果中挑选5个表达量最高病毒早期基因，经qRT-PCR确认ORF099基因表达量最高，选择其作为病毒灭活快速检测的靶标基因。设计特异性反转录引物、荧光定量PCR引物和探针，采用qRT-PCR对待测样品接种CPB细胞后7d的细胞总RNA进行检测，如检测到ISKNV mRNA则表明存在活的ISKNV，反之则无。

一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括如下组分：针对鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)特异性引物及探针、反转录酶、Taq酶、反转录反应液、荧光定量反应液。

优选的，所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的特异性引物及探针是根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ORF099基因保守区序列设计的。

优选的，所述针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的特异性引物及探针的序列如下所示：

ORF099-F:5’-ACTTGGCTTCCACACAATCC-3’(SEQ ID NO:1)；

ORF099-R:5’-ATGCTGTGCTGTCATCTTGC-3’(SEQ ID NO:2)；

ORF099-P:5’FAM+ATTGGCATCCAAGCCAATATACATGGC+TAMARA 3’(SEQ ID NO:3)，探针序列两端为发光基团和猝灭基团。

优选的，所述试剂盒中还含有阳性标准品，所述阳性标准品为鳜传染性脾肾坏死病毒。

一种鳜传染性脾肾坏死病毒灭活快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将待测的ISKNV细胞灭活疫苗成品或半成品按一定比例稀释后接种CPB细胞，同时将阳性标准品接种细胞作为对照；

2)接种细胞后7d，提取细胞总RNA，并去除其中残留DNA；

3)处理后总RNA经试剂盒中反转录引物和酶进行反转录后，用试剂盒中的引物、探针、Taq酶、反应液进行荧光定量PCR，同时用不加模板的反应体系作为空白对照；

4)当阳性样品出现峰，空白对照不起峰时，待测样品起峰为阳性，代表灭活不完全；待测样品不起峰为阴性，代表灭活完全。

优选的，所述检测方法中采用的试剂盒的引物为：

ORF099-F:5’-ACTTGGCTTCCACACAATCC-3’(SEQ ID NO:1)；

ORF099-R:5’-ATGCTGTGCTGTCATCTTGC-3’(SEQ ID NO:2)。

优选的，所述检测方法中采用的试剂盒的探针为：

ORF099-P:5’FAM+ATTGGCATCCAAGCCAATATACATGGC+TAMARA 3’(SEQ ID NO:3)，探针的两端链接发光基团和猝灭基团。

本发明的有益效果是：该方法灵敏度超过细胞盲传法和鱼体安全试验方法。3批次的ISKNV细胞灭活疫苗样品验证结果表明，该方法稳定性与细胞盲传法、鱼体安全试验法一致，表明本研究建立的基于病毒mRNA的qRT-PCR监测的病毒灭活快速检测方法可以替代传统的细胞盲传法和鱼体安全方法，实现ISKNV灭活的快速检测。而灭活检验周期长短对疫苗生产周期起决定性作用，本研究建立ISKNV灭活快速检验方法7天即可判断病毒是否灭活，而传统的细胞盲传法和鱼体安全试验周期至少需要24天和21天，因此，该方法可大大缩短ISKNV灭活疫苗生产周期，提高疫苗的生产效率。

附图说明

图1，ISKNV感染CPB细胞总RNA中gDNA去除验证；(a):表示稀释病毒液接种CPB细胞7天(U-A，R-A)和11天(U-B，R-B)后提取的RNA样品，U-A\U-B表示未去除gDNA的RNA，R-A\R-B表示去除gDNA后的RNA；(b)表示0.05％、0.1％和0.2％终浓度甲醛灭活ISKNV 72h后接种CPB细胞9天获得的RNA样品，U-C表示未去除gDNA的RNA，R-C表示去除gDNA后的RNA；

图2，荧光定量RT-PCR检测ISKNV感染CPB细胞后病毒基因转录数量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例

1.目标基因的筛选

根据本实验室已有的ISKNV感染CPB细胞转录谱结果，选取表达量最高的5个病毒ORF，应用Primer 5.0软件设计特异性引物和探针(见表1)。将ISKNV梯度稀释成1、10、100、1000拷贝/mL分别接种T25细胞培养瓶，接种7天后提取总RNA反转录制备cDNA模板。采用Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)试剂盒检测这些基因的表达量。反应体系：依次加入Mix 10μL、ROX 0.4μL、10μmol/L引物ISKNV FP/ISKNV RP各0.4μL、10μmol/L探针ISKNV probe0.4μL、2μL模板、补水至20μL。阴性对照组以去离子水代替待测样品。反应条件为：95℃30s，1个循环；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃时采集荧光信号。结合转录组结果筛选出一个检测灵敏度较高的基因作为灭活检验靶标基因。如表2所示，ISKNV感染CPB细胞24h的转录谱结果显示，相对表达量前5位病毒基因依次为ORF023、ORF099、ORF100、ORF032、ORF008，荧光定量RT-PCR检测结果显示，在接种1、10、100、1000拷贝/mL ISKNV细胞培养液中，ORF099转录本扩增的Ct值均较低，其中1、1000拷贝/mL接种浓度的Ct值在5个病毒早期基因中最低，表明ISKNV ORF099基因转录水平较高，以其作为灭活检验的靶标基因具有较高的灵敏度因此选择ORF099基因作为灭活快速检验靶基因。

表1 ISKNV感染CPB细胞后5个病毒早期基因转录谱及荧光定量RT-PCR验证结果

2特异性引物及探针的设计

根据的鳜传染性脾肾坏死病毒ORF099蛋白核酸序列，在基因保守片段设计用于检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的引物和探针，其序列如下：

ORF099-F:5’-ACTTGGCTTCCACACAATCC-3’(SEQ ID NO:1)；

ORF099-R:5’-ATGCTGTGCTGTCATCTTGC-3’(SEQ ID NO:2)；

ORF099-P:5’-ATTGGCATCCAAGCCAATATACATGGC-3’(SEQ ID NO:3)；

荧光探针报告基团为FAM，淬灭基团为TAMARA。

3.病毒mRNA提取与cDNA合成

用ISKNV感染CPB细胞，在出现明显病变后用TRIzol Reagent提取细胞RNA，提取步骤：每1×10⁵细胞数量加入1mlTRIzol裂解5min，吹打混匀；加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置10min，4℃离心机12000rpm离心15min；取上清加入等体积的异丙醇，室温放置10min，4℃离心机12000rpm离心10min；弃上清，加入1ml 75％乙醇，涡旋混合，4℃离心机7500rpm离心5min；弃上清，室温自然干燥数分钟，加入适量DEPC水溶解，立即进行反转录。反转录使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒，第一步去除基因组DNA反应体系：依次加入5×gDNA Eraser Buffer 2μL、gDNA Eraser1μL、Total RNA 2μL、RNase Free dH₂O5μL，反应条件42℃2min，4℃保存；第二步反转录使用20ul体系：依次加入第一步反应液10ul、PrimeScript RT Enzyme MixI 1μL、RT Primer Mix 4μL、5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4μL、Rnase Free H₂O 1μL，反应条件37℃15min、85℃失活5s、4℃保存。

4.基于病毒mRNA荧光定量PCR检测方法建立

去除效率验证 分别取1、10、100、1000拷贝/mL ISKNV接种细胞后第7天、11天以及灭活ISKNV病毒接种细胞后第9天的细胞总RNA进行gDNA的去除，分别以去除前总RNA和去除后总RNA为模板进行qPCR，结果显示未进行gDNA去除的样品可检测到ISKNV ORF099基因，去除后检测不到ORF099基因(图1)，表明经gDNA的去除后总RNA中无DNA残留。

荧光定量PCR检测病毒mRNA的灵敏度试验 分别将1、10、100、1000拷贝/mL ISKNV接种细胞后7天、9天、11天，提取细胞总RNA进行荧光定量RT-PCR检测。如图2所示，随着病毒接种量的增加和接种时间的延长，检测到的ISKNV mRNA越多，其中1拷贝/mL病毒接种7天后即可以检测到1～2个拷贝/μL的ISKNV mRNA，因此将灭活病毒液接种CPB细胞后7天采用荧光定量RT-PCR检测病毒mRNA可检测到1个活病毒的残留，表明该方法具有极高的灵敏度。

5.该方法在检测ISKNV灭活检验中的应用

荧光定量RT-PCR检测未感染ISKNV的CPB细胞进行荧光定量RT-PCR未见起峰，表明样品中无病毒基因mRNA，表示ISKNV已完全灭活。将0.05％、0.1％和0.2％终浓度甲醛灭活ISKNV 72h后接种CPB细胞9天，qRT-PCR检测结果显示随着甲醛浓度的升高，检测到的ISKNV mRNA逐渐减少。根据本研究建立的病毒灭活快速检验方法，0.2％甲醛灭活ISKNV 72h后接种CPB细胞检测不到病毒基因mRNA，说明ISKNV在此条件下被完全灭活，而细胞盲传实验结果表明从0.1％终浓度甲醛灭活病72h接种细胞盲传三代未出现CPE(表2)，说明本研究建立的病毒灭活快速检验方法比细胞盲传法具有更高的灵敏度。采用方法对实验室制备的3批次ISKNV细胞灭活疫苗样品进行检测，结果显示3批样品均为阴性，与细胞盲传及鱼体安全试验结果一致(表2)，其中+表示阳性，出现病变或起峰；-表示检出结果为阴性，即没有检出活病毒。以上结果表明，本研究建立的基于ISKNVmRNA检测的病毒灭活快速检验方法方法是可靠的。

表2荧光定量RT-PCR检测病毒mRNA方法与鱼体安全试验法对3批次ISKNV细胞灭活疫苗灭活检验结果的比较

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种鳜传染性脾肾坏死病毒灭活快速检验试剂盒及检测方法

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<170> PatentIn version 3.5

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