专利名称：突变型hpgg基序和hdash基序δ-5去饱和酶以及它们在制备多不饱和脂肪酸中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及制备编码突变型Λ-5脂肪酸去饱和酶(其中在细胞色素b5-样域的HPGG[SEQ ID NO: 7]基序内发生至少一个突变，并且在HDASH[SEQ ID NO:8]基序内发生至少一个突变)的核酸片段。
背景技术：
包括植物、藻类、真菌、原生藻菌(stramenopiles)和酵母在内的多种不同宿主正被研究旨在用于商业化多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生产。基因工程已展示出，一些宿主(即使是亚油酸[LA;18:2co-6]和α -亚麻酸[ALA ; 18:3 ω-3]脂肪酸生产天然受限的那些)的天然能力可被充分改变以致使高水平生产多种长链o-3/co-6PUFA。花生四烯酸[ARA ;20:4 ω-6]、二十碳五烯酸[ΕΡΑ ;20:5ω-3]和二十二碳六烯酸[DHA ;22:6 ω-3]的生产可能都需要Λ-5去饱和酶基因的表达，无论这是天然能力还是重组技术的结果。因此，本发明涉及具有高活性的新型Λ-5去饱和酶，其很好地适于整合进商用宿主细胞中的PUFA生物合成途径中。
发明内容
在第一实施方案中，本发明涉及具有Λ-5去饱和酶活性的突变多肽，其包含:
(a)如 SEQ ID N0:34[HxGx]所示的氨基酸基序，其中 SEQ ID N0:34[HxGx]与 SEQID N0:7[HPGG]不同；和(b)如 SEQ ID NO:1 [HxxxH]所示的氨基酸基序，其中 SEQ ID NO:1 [HxxxH]与 SEQID N0:8[HDASH]不同。在第二实施方案中，(a)的氨基酸基序选自:SEQ ID NO: 9 [HgGG]、SEQ IDN0:10[HhGG]、SEQ ID NO:11[HPGs]、SEQ ID NO:12[HcGG]、SEQ ID N0:13[HwGG]和 SEQ IDN0:14[HaGG];并且，(b)的氨基酸基序选自:SEQ ID NO: 15 [HDgSH]、SEQ ID NO: 16 [HDsSH]、SEQ ID N0:17[HDAaH]、SEQ ID N0:18[HDAgH]和 SEQ ID NO:19[HeASH]。在第三实施方案中，基于BLASTP比对方法在与具有选自:SEQ ID NO: 21, SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:29的序列的多肽进行比较时，所述突变多肽具有至少90%的序列同一性。在第四实施方案中，所述突变多肽的氨基酸序列选自:SEQ ID NO:139[EgD5R*-34gl57g]、SEQ ID NO:14 I[EgD5R*_34gI 58a]、SEQ ID NO:143[EgD5R*-34gl58g]、SEQ ID NO: 145[EgD5R*_34hI 58a]、SEQ ID NO:147[EgD5R*-34hl58g]、 SEQ ID NO:149[EgD5R*_36sl58a]、 SEQ IDN0:151[EgD5R*-36sl58g]、SEQ ID NO: 153 [EgD5M、密码子优化的 EgD5R*_34gl58g]、SEQ IDN0:157[EgD5Ml、密码子优化的 EgD5R*-34gl58g347s]、SEQ ID NO: 181 [EgD5S_36sl56e]、SEQ ID NO: 183 [EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:1 85 [ EgD5S-36sI 58 a ]、SEQ ID NO: 187 [EgD5S-36s 158g]、SEQ ID NO:2 I 3 [ EaD5S-35 a I 58g]、SEQ ID NO:215 [EaD5S-35al58s]、SEQ ID NO:2 17[EaD5S_35al59g]、SEQ IDN0:255[EgD5R-34gl58g]、SEQ ID NO:260[EgD5R_34gl58a]、SEQ ID NO:271[EaD5_35gl59g]和 SEQ ID NO:276[EaD5-35gl59a]。在第五实施方案中，所述突变多肽的二高-Y-亚麻酸至花生四烯酸的转化效率为亲本多肽的二高-Y -亚麻酸至花生四烯酸的转化效率的至少64%，所述亲本多肽包含与SEQ ID N0:7[HPGG]相同的氨基酸基序和与SEQ ID N0:8[HDASH]相同的氨基酸基序。在第六实施方案中，所述发明涉及编码所述突变多肽中的任一种的分离的核酸分子。优选地，所述分离的核酸分子具有选自以下的核苷酸序列:SEQ ID NO:138[EgD5R*-34gl57g]、SEQ ID NO:140[EgD5R*_34gl58a]、SEQ ID NO:142[EgD5R*-34gl58g]、SEQ ID NO: 144[EgD5R*_34hI 58a]、SEQ ID NO:146[EgD5R*-34hl58g]、 SEQ ID NO:148[EgD5R*_36sl58a]、 SEQ IDN0:150[EgD5R*-36sl58g]、SEQ ID NO: 152 [EgD5M、密码子优化的 EgD5R*_34gl58g]、SEQ IDN0:156[EgD5Ml、密码子优化的 EgD5R*-34gl58g347s]、SEQ ID NO: 180[EgD5S_36sl56e]、SEQ ID NO: 182 [EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:1 84 [ EgD5S-36sI 58 a ]、SEQ ID NO: 186 [EgD5S-36s 158g]、SEQ ID NO:2 I 2 [ EaD5S-35 a I 58g]、SEQ ID N0:214[EaD5S-35al58s]、SEQ ID NO:216[EaD5S_35al59g]、SEQ IDNO:254[EgD5R-34gl58g],SEQ ID NO:259[EgD5R_34gl58a]、SEQ ID NO:270[EaD5_35gl59g]和 SEQ ID N0:275[EaD5-35gl59a]。在第七实施方案中，本发明涉及表达所述突变多肽中的任一种的转化的宿主细胞。优选地，所述转化的宿主细胞选自:微生物，最优选含油酵母；以及植物，最优选油料种子植物。在第八实施方案中，所述转化的宿主细胞产生选自ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸的多不饱和脂肪酸。牛物保藏下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA20110-2209),并具有下
列名称、保藏号和保藏日期。
生物材料保藏号保藏曰期
解脂耶氏酵母(Yarrowia ATCC PTA-100262009 年 5 月 14 日
Upolytica) Y8412上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。根据如美国专利申请公布2010-0317072-A1所述的方法，解脂耶氏酵母Y9502来源于解脂耶氏酵母Y8412。
和序列表图1A和图1B示出了 ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应被视为是一起的。图2是小眼虫(Euglena gracilis) Δ-5去饱和酶的预测拓扑模型。图3A、3B、3C和3D示出了来自小眼虫的野生型Λ-5去饱和酶基因(B卩，EgD5 [SEQID NO: 20])与变体野生型小眼虫(E.gracilis) Δ-5去饱和酶基因的DNA序列比对，所述突变野生型基因包含一个S347R突变(B卩，EgD5R[SEQ ID NO: 24])。图4A、4B和4C示出了质粒pDMW367_M4的构建。图5示出了来自小眼虫的变体野生型Λ-5去饱和酶基因(B卩，EgD5R[SEQ IDNO: 24])的5’部分与合成突变型Λ-5去饱和酶的前204bp的序列比对，后者来源于小眼虫并经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达，并且包含HgGG[SEQ ID NO:9]和HDAgH[SEQ IDNO: 18]基序(B卩，EgD5M[SEQ ID NO: 152])。图6提供了以下的质粒图谱:(A)pEgD 5M和(B)pDMW367-5M。图7示出了解脂耶氏酵母菌株Z1978的发育。图8提供了以下的质粒图谱:(A)pZKUM和(B)pZKL3_9DP9N。图9示出了解脂耶氏酵母菌株Z8001至Z8054的发育。图1OA示意性地示了与pYPS234的同源重组反应，而图1OB提供了 pYPS234的质粒图谱。图1lA示意性地示了与pYPS233的同源重组反应，而图1lB提供了 pYPS233的质粒图谱。图12A示意性地示了与PYPS241的同源重组反应，而图12B提供了 pYPS241的质粒图谱。图13 提供了以下的质粒图谱:(A)pZR5AU-555 和(B)pZR5AU-555M。根据下面的详细描述和附带的序列描述可更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本专利申请的一部分。下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则”)，并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25 (1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5 (a-bis)以及行政指令(AdministrativeInstructions)的208节和附录C)。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。SEQ ID NO: 1-311是编码基因或蛋白质(或其部分)的0RF、引物或质粒的0RF，如表I所鉴定的。表1:核酸和蛋白质SEQ ID号的汇总
权利要求
1.具有Λ-5去饱和酶活性的突变多肽，包含: (a)如SEQ ID N0:34[HxGx]所示的氨基酸基序，其中 SEQ ID N0:34[HxGx]与 SEQ IDN0:7[HPGG]不同；和 (b)如SEQ ID NO:l[HxxxH]所示的氨基酸基序，其中 SEQ ID NO:l[HxxxH]与 SEQ IDN0:8[HDASH]不同。
2.根据权利要求1所述的突变多肽，其中: (a)所述(a)的氨基酸基序选自:SEQID N0:9[HgGG]、SEQ ID N0:10[HhGG]、SEQ IDNO:ll[HPGs]、SEQ ID NO: 12 [HcGG]、SEQ ID N0:13[HwGG]和 SEQ ID N0:14[HaGG];并且 (b)所述(b)的氨基酸基序选自:SEQID N0:15[HDgSH]、SEQ ID NO: 16[HDsSH]、SEQID N0:17[HDAaH]、SEQ ID N0:18[HDAgH]和 SEQ ID NO:19[HeASH]。
3.根据权利要求2所述的突变多肽，其中基于BLASTP比对方法在与具有选自:SEQIDNO:21, SEQ ID N0:25和SEQ ID NO:29的序列的多肽进行比较时，所述突变多肽具有至少90%的序列同一性。
4.根据权利要求3所述的突变多肽，所述突变多肽具有选自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:139[EgD5R*-34gl57g]、SEQ ID NO:141[EgD5R*_34gl58a]、SEQ ID NO:143[EgD5R*-34gl58g]、SEQ ID NO: 145[EgD5R*_34hI 58a]、SEQ ID NO:147[EgD5R*-34hl58g]、 SEQ ID NO:149[EgD5R*_36sl58a]、 SEQ IDNO:151[EgD5R*-36sl58g]、SEQ ID NO: 153 [EgD5M、密码子优化的 EgD5R*_34gl58g]、SEQ IDNO:157[EgD5Ml、密码子优化的 EgD5R*-34gl58g347s]、SEQ ID NO: 181 [EgD5S_36sl56e]、SEQ ID NO: 183 [EgD5S-36s157 g]、SEQ ID NO:1 85 [ EgD5S-36sI 58 a ]、SEQ ID NO: 187 [EgD5S-36s 158g]、SEQ ID NO:2 I 3 [ EaD5S-35 a I 58g]、SEQ ID NO:215 [EaD5S-35al58s]、SEQ ID NO:2 17[EaD5S_35al59g]、SEQ IDNO:255[EgD5R-34gl58g]、SEQ ID NO:260[EgD5R_34gl58a]、SEQ ID NO:271[EaD5_35gl59g]和 SEQ ID NO:276[EaD5-35gl59a]。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的突变多肽，其中所述突变多肽的二高-Y-亚麻酸至花生四烯酸的转化效率为亲本多肽的二高-Y -亚麻酸至花生四烯酸的转化效率的至少64%，所述亲本多肽包含与SEQ ID NO: 7 [HPGG]相同的氨基酸基序和与SEQ ID NO:8[HDASH]相同的氣基酸基序。
6.分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码权利要求1所述的多肽。
7.根据权利要求6所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子具有选自以下的核苷酸序列:SEQ ID NO:138[EgD5R*-34gl57g]、SEQ ID NO: 140 [EgD5R*_34gl58a]、SEQ ID NO:142[EgD5R*-34gl58g]、SEQ ID NO: 144[EgD5R*_34hI 58a]、SEQ ID NO:146[EgD5R*-34hl58g]、 SEQ ID NO:148[EgD5R*_36sl58a]、 SEQ IDN0:150[EgD5R*-36sl58g]、SEQ ID NO: 152 [EgD5M、密码子优化的 EgD5R*_34gl58g]、SEQ IDNO:156[EgD5Ml、密码子优化的 EgD5R*-34gl58g347s]、SEQ ID NO: 180[EgD5S_36sl56e]、SEQ ID NO: 182 [EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:1 84 [ EgD5S-36sI 58 a ]、SEQ ID NO: 186 [EgD5S-36s 158g]、SEQ ID NO:2 I 2 [ EaD5S-35 a I 58g]、SEQ ID NO:214[EaD5S-35al58s]、SEQ ID NO:216[EaD5S_35al59g]、SEQ IDNO:254[EgD5R-34gl58g],SEQ ID NO:259[EgD5R_34gl58a]、SEQ ID NO:270[EaD5_35gl59g]和 SEQ ID N0:275[EaD5-35gl59a]。
8.转化的宿主细胞，所述转化的宿主细胞表达权利要求1所述的多肽。
9.根据权利要求8所述的转化的宿主细胞，所述转化的宿主细胞选自微生物和植物。
10.根据权利要求9所述的转化的宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞是含油酵母。
11.根据权利要求10所述的转化的宿主细胞，其中所述含油酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowia IipolyticaX
12.根据权利要求9所述的转化的宿主细胞，其中所述细胞包含基因构建体，所述基因构建体包含选自以下的基因:SEQ ID NO: 152, SEQID NO: 156, SEQ ID N0:182和SEQ IDN0:212。
13.根据权利要求9所述的转化的宿主细胞，其中所述细胞表达蛋白质，所述蛋白质具有选自以下的序列:SEQ ID NO: 153、SEQ IDN0:157、SEQ ID NO: 183 和 SEQ ID NO: 213。
14.根据权利要求8或11中任一项所述的转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生选自ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸的多不饱和脂肪酸。
15.根据权利要求9所述的转化的宿主细胞，其中所述植物宿主细胞是油料种子植物细胞。
全文摘要
本发明公开了突变型Δ-5去饱和酶，其能够将二高-γ-亚麻酸[DGLA；20:3ω-6]转化成花生四烯酸[ARA；20:4ω-6]和/或将二十碳四烯酸[ETA；20:4ω-3]转化成二十碳五烯酸[EPA；20:5ω-3]，并且在细胞色素b5-样域的HPGG(SEQ ID NO:7)基序内具有至少一个突变，以及在HDASH(SEQ ID NO:8)基序内具有至少一个突变。还公开了分离的核酸片段和包含此类编码Δ-5去饱和酶的片段的重组构建体，以及制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的方法。
文档编号C12N15/54GK103080317SQ201180040815
公开日2013年5月1日 申请日期2011年8月26日 优先权日2010年8月26日
发明者M.W.博斯蒂克, M.D.多伯特, H.何, S-P.洪, D.M.W.波拉克, P.L.夏普, Y.J.王, Z.薛, N.S.亚达夫, H.张, Q.朱 申请人:纳幕尔杜邦公司