细胞内microRNA检测方法原理图。
[0038] 图2为DNA分子探针在Huh7细胞内的miRNA-21实施检测的细胞荧光成像图。其 中，杂交链=l〇〇nM，燃料链=200nM。
[0039] 图3为DNA分子探针在Huh7细胞内的miRNA-122实施检测的细胞荧光成像图。其 中，杂交链=l〇〇nM，燃料链=200nM。
[0040] 图4为DNA分子探针在Huh7细胞内的miRNA-122实施检测的细胞荧光成像图。其 中，杂交链=l〇〇nM，燃料链=OnM。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合附图及实施例对本发明进一步描述：
[0042] 本实验中所使用到的Huh7的细胞购买于上海中科院细胞库。
[0043] 所有的初始原料，DNA都从生工（上海）生物工程股份有限公司或者Adamas公司 购买，试剂除非说明都没有再次提纯。所有的化学试剂都是分析纯或者更高纯度的，使用的 转染试剂是X-tremeGENEHP，胎牛血清购于ExCell公司。
[0044] 紫外可见分光光度计：Cary300。
[0045] 焚光分光光度计：F-7000(HitachiHigh-TechonologiesCorporationJapan) 〇
[0046]焚光显微镜：1X71(OlymapusJapan)〇
[0047] 本实例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了比较详细的实施方式和过 程。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于本发明保护的范围。实施例中采用的 实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步的调整，未注明的实验条件通常按照常规实验 中的条件。
[0048] 本实施例主要通过细胞成像验证级联的DNA链替换反应实现细胞内microRNA检 测的可行性，利用光学显微镜来监测反应的结果。本发明的检测步骤如下：
[0049] 第一步：DNA探针的准备：（1)基底链与信号链DNA分别溶解在10mMTris-HCl(pH 7. 5, 0. 3MNaCl，5mMMgCl2)缓冲液中，按照1:1的摩尔比例混合后退火得到双链DNA; (2) 燃料链DNA溶解在10mMTris-HCl缓冲液中。
[0050] 第二步：细胞的培养。
[0051] 第三步：利用商业转染剂将DNA探针导入到细胞内。
[0052] 第四步：细胞成像。
[0053] 在本发明中所选择的癌症细胞是Huh7细胞，被检测序列是miRNA-21。
[0054] 以下实例进一步验证级联的DNA链替换反应实现细胞内microRNA检测的可行性， 并且对Huh7细胞内的miRNA-21实施检测。
[0055] 实施例1 :
[0056] 第一步，DNA探针的准备：
[0057]①寡核苷酸溶解在 10mMTris-HCl(pH7.5,0. 3MNaCl，5mMMgCl2)缓冲液中，溶 液中单链的浓度利用260nm波长紫外吸收值进行标定；
[0058] ②基底链与信号链等摩尔浓度混合，在90°下保持15分钟，然后再逐渐降温至室 温，退火过程超过2小时。杂交双链DNA在4°保存；
[0059] 所得双链DNA浓度为10yM，燃料链DNA浓度为20yM。
[0060] 第二步，细胞培养：
[0061] 将Huh7细胞种到十二孔板中，每孔约5000个细胞，使用含有10%牛血清蛋白的 DMEM培养基在细胞培养箱中进行培养24小时，其中需要5%C02的潮湿空气，温度控制在 37。。。
[0062] 第三步，利用商业转染剂将DNA探针导入到细胞内：
[0063]a.转染混合液的准备：将5微升双链DNA，5微升双链燃料链和1微升罗氏 X-tremeGENEHP转染试剂溶解在500微升Opti-Mem中，轻轻漩涡震荡1分钟待用，混合液 杂交链浓度为l〇〇nM，燃料链浓度为200nM。
[0064]b.十二孔板中的Huh7细胞使用无菌的pH为7. 4PBS(phosphatebuffered saline)缓冲液进行冲洗三次，每次2mL。再加入a步骤中的转染混合液。
[0065] c.放置在37°细胞培养箱中培养4小时。
[0066] 第四步，细胞成像：
[0067] 1)将被转染处理4小时的Huh7细胞使用无菌的pH为7. 4PBS缓冲液进行冲洗三 次，每次2mL。再加入500微升PBS进行荧光成像试验；
[0068] 2)选择被扫描区域，拍摄细胞图像。
[0069] 对于miRNA-21的检测，
[0070] 基底链的序列（从左到右为5'一3'）为
[0071]BHQ-1-CCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQIDNO：1)
[0072] 信号链的序列（从左到右为5'一3'）为
[0073]TATCAGACTGATGTTGATTGG-FAM(SEQIDNO：2),
[0074] 燃料链的序列（从左到右为5'一3'）为
[0075] CTTATCAGACTGATGTTGATTGG(SEQ ID NO：3)
[0076] 通过细胞图像可以得到验证。在图2中可以清楚的看到细胞呈现绿色，本实例的 操作简单，现象非常的明显。
[0077] 实施例2 :
[0078] 采用同实施例1相同的操作步骤，只是设计的DNA分子探针是为了检测Huh7细胞 中miRNA-122的表达，各种DNA链的序列发生变化，信号链的末端修饰有Cy5。同样可以在 细胞图像中看到明显的颜色，见图3。
[0079]对于miRNA-122 的检测，
[0080] 基底链的序列（从左到右为5'一3'）为
[0081] BHQ-2-CTACCAAACACCATTGTCACACTCCA(SEQ ID NO：4)
[0082] 信号链的序列（从左到右为5'一3'）为
[0083] TGTGACAATGGTGTTTGGTAG-Cy5(SEQ ID NO：5)
[0084] 燃料链的序列（从左到右为5' 一 3'）为[0085] AGTGTGACAATGGTGTTTGGTAG(SEQ ID NO：6)
[0086] 通过图像可以验证该检测策略适合检测细胞内各种类型的miRNA分子。
[0087] 实施例3 :
[0088] 采用同实施例2相同的操作步骤，只是DNA分子探针中的燃料链DNA浓度为OnM。 在细胞图像中只能看到非常微弱的颜色，见图4。
[0089] 基底链的序列（从左到右为5' 一 3'）为
[0090] BHQ-2-CTACCAAACACCATTGTCACACTCCA(SEQIDNO：4)
[0091] 信号链的序列（从左到右为5' 一3'）为
[0092] TGTGACAATGGTGTTTGGTAG-Cy5(SEQIDNO：5)
[0093] 燃料链的序列（从左到右为5' 一 3'）为
[0094] AGTGTGACAATGGTGTTTGGTAG(SEQIDNO：6)
[0095] 通过图像可以验证该检测策略在检测细胞内各种类型的miRNA分子中，参数设计 的重要性。
[0096] 上述实例只为说明本发明的技术构思以及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或者修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种DNA分子探针组合，所述DNA分子探针组合包括双链DNA寡核苷酸和单链DNA 寡核苷酸两部分，所述双链DNA寡核苷酸由一端带有荧光基团修饰的信号链与一端修饰有 淬灭基团的基底链按照1:1的比例杂交而成，并且基底链比信号链在未修饰淬灭基团端多 5个碱基，形成裸露端。2. 根据权利要求1所述的DNA分子探针组合，所述荧光基团为FAM或Cy5,淬灭基团为 BHQ-I 或 BHQ-2。3. -种检测生物体内非编码RNA分子的方法，所述方法包括以下步骤： 1) 根据待测非编码RNA分子设计互补的信号链和基底链，以及与基底链部分互补配对 的单链DNA分子，即燃料链，其中，待测非编码RNA分子与基底链部分互补，且信号链在一端 修饰有荧光基团，基底链在一端修饰有淬灭基团，并且基底链比信号链在未修饰淬灭基团 端多5个碱基，形成裸露端； 2) 将互补的信号链和基底链按照1:1的比例杂交形成双链； 3) 将步骤2)中形成的双链与所述燃料链一起转入细胞； 4) 成像并观察。4. 根据权利要求3所述的方法，所述非编码RNA分子为miRNA，优选为miRNA-21、 miRNA-122〇5. 权利要求1或2所述的DNA分子探针组合用于靶分子及靶分子所在细胞在生物体内 成像的用途。6. 根据权利要求5所述的用途，所述细胞为肿瘤细胞，优选为Huh7细胞。7. 根据权利要求5所述的用途，其中所述靶分子为非编码RNA分子，优选为miRNA分 子，更优选为 miRNA-21、miRNA-122。8. -种非编码RNA分子的检测试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的DNA分 子探针组合。9. 一种靶分子成像试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的DNA分子探针组合。10. 根据权利要求9所述的试剂盒，所述靶分子为非编码RNA分子，优选为miRNA分子， 更优选为 miRNA-21、miRNA-122。
【专利摘要】本发明公开了一种利用级联的DNA链替换反应的细胞内非编码RNA检测方法，其是一种新型的细胞内非编码RNA，尤其是microRNA(miRNA)的检测方法。其特征在于合理设计DNA分子探针，使细胞内的目标链能够触发级联的DNA链替换反应的发生，进而有效的释放具有荧光基团修饰的信号链，通过荧光显微镜观察肿瘤细胞的成像，最终实现基于级联的DNA链替换反应的细胞内miRNA检测。本发明具有操作简单，高效率的特点，同时也是在细胞内miRNA检测中一种新型方法。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104962555
【申请号】CN201510319343
【发明人】梁好均, 王晓静, 宋廷结
【申请人】中国科学技术大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月10日