专利名称：一株嗜乙酰乙酸棒杆菌及其产丁二酸的方法
技术领域：
本发明涉及利用基因工程技术构建嗜乙酰乙酸棒杆菌工程菌，以及利用该基因工程菌生产丁二酸，属于生物工程技术领域。
背景技术：
丁二酸(butanedioic acid),又称琥拍酸(succinic acid)广泛存在于动植物和微生物体内，是TCA循环的中间产物之一。因其最早从琥珀中分离得到而得名。丁二酸是工业上一种重要的四碳化合物，它作为有机合成原材料、中间产物或专用化学品广泛应用于食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和材料工业。目前，丁二酸的生产方法主要有化学合成法和生物法。以化学法获得丁二酸，不仅要消耗大量不可再生的石化原料，且转化率低，成本高，易污染环境。生物法能够避免传统化学方法中所使用石化原料的消耗，生产过程环境友好，而且还能够固定CO2,缓解温室效应，为丁二酸的工业化生产开辟了一条新的途径。目前微生物发酵法生产丁二酸研究所涉及的高产微生物，主要有天然产琥珀酸的微生物和一些基因工程菌，前者如琥珀酸厌氧螺菌(ArmGrobiospiriIlum succiniciproducens)、玻拍酸放线杆菌(ActinobaciIlussuccinogenes )和玻拍酸曼氏杆菌(Mannheimia succini ciproducens ) 美国专利US5573931公开了一株琥珀酸放线杆菌130Z(ATCC 55618)，在100g/L葡萄糖、80g/L碳酸镁的培养基中产琥珀酸可达到80 g/L以上，但发酵过程大量使用镁盐增加了发酵的成本，当改用钠盐替代镁盐时，由于菌株对钠离子的耐受能力有限，产酸显著下降。许多学者报道了E. coli基因工程发酵生产丁二酸的方法，如美国专利US5770435和中国专利CN1886516A提供含有Idhk突变(即磷酸转移酶系统、丙酮酸甲酸裂解酶系统和乳酸脱氢酶系统不作用)的疋工程菌AEP111，在通气培养6小时后，关闭通气施加厌氧条件，发酵144小时，产琥珀酸盐59. 35 g/L，其发酵周期较长；中国专利CN1268972A公布了利用基因工程技术构建一种乙酸和乳酸形成途径缺陷的疋coli工程菌SS373，将好氧培养的SS373转入厌氧条件培养，但产酸不高(仅2. 7 g/L);中国专利CN 101029316A公开了缺失丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶基因的工程菌NTN111，采用先好氧培养，后厌氧发酵的方法生产丁二酸，产量也较低，厌氧发酵41小时产丁二酸为25g/L。另外，在谷氨酸棒杆菌生产琥珀酸研究方面，中国专利CN1989238A、CN1989239A和CN1389752A分别公布了用基因工程技术构建乙酰辅酶A水解酶活性降低、丙酮酸氧化酶活性降低和增强2-氧代戊二酸脱氢酶活性的棒杆菌突变株，但其操作过程较复杂；中国专利CN101084946A公布了以谷氨酸棒杆菌C glut ami cum ATCC 13032为出发菌株，对其进行诱变处理，筛选到一株不产乳酸且高产丁二酸的C. glutaniicuniCQmC No. 3991，该菌厌氧发酵36 h，其丁二酸产量可达到35. 8g/L,但其缺点仍是产量不高。本发明针对上述微生物发酵生产丁二酸存在的缺陷，基于嗜乙酰乙酸棒杆菌在缺氧条件下，菌体不生长但能够利用葡萄糖分泌大量的乳酸，而在补充碳酸盐条件下，又能同时分泌丁二酸的特点(生物加工过程，2011，9:22-26 )，提供了一株不产生副产物L-乳酸的新的丁二酸生产菌株，在一定程度上有效地克服了上述微生物发酵生产丁二酸存在的缺陷，具有产琥珀酸浓度较高，生产周期短，易操作的特点。
发明内容
本发明的目的是提供一株嗜乙酰乙酸棒杆菌及 其产丁二酸的方法，所要解决的技术问题是提供一株高产丁二酸又不产生副产物L-乳酸的嗜乙酰乙酸棒杆菌，以及利用其生产丁二酸的方法。本发明的技术方案通过基因为反向筛选标记的同源重组染色体基因敲除系统，敲除嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870的编码乳酸脱氢酶基因7過，经筛选得到一株消除副产物L-乳酸，且丁二酸产量提高的菌株嗜乙酰乙酸棒杆菌iCorynebacteriumacetoacidophilum) YF/ AIdh,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年2月29日，保藏号CCTCC N0:M2012041，为乳酸脱氢酶基因7過缺失菌株。所述CCTCC NO:M2012041在好氧条件下生长，然后转入在以葡萄糖为底物，碳酸盐为二氧化碳供体的缺氧环境培养，培养液中积累丁二酸。以下是本发明方法的详细描述
基因敲除载体pK19mohsaci -的构建
根据 Gene Bank 中 C. glutamicum ATCC 13032 全基因组序列(Gene BankNo:Nc_006958. I)设计引物。抽提嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870的基因组，以其为模板，以设计的上游片断SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2为引物，在Taq酶作用下，通过PCR扩增Idh基因上游片段(7過基因起始密码上游约500bp) JBSEQ ID No. 5所示。以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870的基因组为模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4为引物，在Taq酶作用下，PCR扩增Idh基因下游片段(7過基因终止密码下游约500bp)，如SEQ ID No. 6所示。扩增的上下游片段混合后作为模板，再以SEQ ID No. I和SEQ ID No. 4为引物，通过重叠PCR扩增，将7過基因上下游片断连接起来。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，约1000 bp大小的片段为形成的7過基因缺失片段。并将此片段插入PMD18-T载体。插入连接片段的PMD18-T载体，通过酶切和电泳回收连接片段(1000 bp),并将此片段连接到万.coli/C. glutamicum穿梭载体pK19mohsaci 上，得到基因敲除载体命名为pK19mohsaci -Idh基因缺失的嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/ 的制备
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870接入含1%-3% (质量体积比)甘氨酸和0. 1%-0. 5% (体积比)Tween 80 的 30 mL LB 培养基中，25_37°C，100_300r/min 培养 6-20 小时，使起始 0D_达到0. 8-0. 9。菌液冰浴后离心收集菌体，重复洗涤2-4次，用预冷的10%-15% (体积百分t匕)甘油悬浮细胞，得到感受态细胞，置于_70°C冰箱保存或直接用于电击转化。将预冷pK19mohsaM-A7t*载体与感受态细胞混匀，移至电击杯中，于I. 2_1. 8kv，2-5ms下在电击仪上电击，然后立即加入LBHIS培养基(酵母膏2.5 g/L，蛋白胨5 g/L,NaCl 5 g/L，脑心浸粉18. 5 g/L，山梨醇91 g/L)，于50_30°C水浴0. 2-1. 5小时，将菌体涂布在含50ii g/mL卡那霉素的固体LBHIS培养基上，28_37°C培养24-48小时。挑选出卡那霉素抗性克隆，涂布在含5%-20% (质量体积比)蔗糖的固体LB培养基上培养24-72小时，挑选生长克隆。通过提取其基因组，以P1/P4为引物PCR扩增，验证阳性克隆，得到Idh基因缺失克隆，命名为 C. ace toacidophiIumW/ N Idh。
嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/A 7過的培养与发酵生产丁二酸
从嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/A 7過新鲜斜面，挑取一环接种于装有好氧培养基的三角瓶中，在25-37°C，100-300 r/min条件下培养12-36 h，按接种量1%_10%进行扩大培养，培养12-48 h离心收集菌体。湿菌体或固定化细胞浓度按10%-70% (重量/体积)转入装有缺氧环境培养基的带盖瓶子中，25-37°C培养30-100 h，期间补加NaHCO3和葡萄糖，维持pH
6.5~8. 50
其中好氧培养基组分为(g/L):葡萄糖20-60，尿素0.5-5，酵母膏0. 1-5，酪蛋白卜 10，(NH4)2SO4 2-20，KH2PO4 0. 1-1. 5，K2HPO4O. 1-1. 5，MgSO4 7H20 0. 1-1. 5，MnSO4 H2O 0. 0004-0. 005，FeSO4 7H20 0. 001-0. 06，硫胺素 0. 00005-0. 0005，生物素0. 00002-0. 0005, pH 7. 0 7. 2。缺氧环境的培养基组分为(g/L):葡萄糖50-400，碳酸盐30-500，KH2PO4 0. 1-1. 5，K2HPO4O. 1-1. 5，MgSO4 7H20 0. 1-1. 5，MnSO4 H2O 0. 0004-0. 005，FeSO4 7H20 0. 001-0. 06，硫胺素 0. 00005-0. 0005，生物素 0. 00002-0. 0005，pH 7. 0
7.2。所述菌体细胞，是好氧培养后的菌体，或好氧培养后离心的菌泥制成的固定化细胞。固定化细胞的方法采用以卡拉胶或壳聚糖或海藻酸钙等为载体的固定化方法，如《生物固定化技术及应用》(P137-157，化学工业出版社，2009)所述。有机酸产物检测方法，按中国专利ZL 200610038113. 6所述的方法。本发明的有益效果本发明所得到的缺失7過基因嗜乙酰乙酸棒杆菌，具有产丁二酸浓度较高，可用钠盐代替镁盐作为二氧化碳供体和PH调节剂，生产周期短，易操作的特点。与化学法相比，不需要使用不可再生的石化原料，且转化率高，成本低，污染小。生产过程环境友好，而且还能够固定CO2,缓解温室效应。与其它丁二酸产生菌相比，具有食品安全性、产酸能力强、生长迅速，细胞浓度高、培养条件简单的优势。
图I :pK19mohsaci 质粒图。图2 :基因敲除质粒 pK19mohsaci -图3 :缺氧条件下产酸的液相图。ia') C. acetoacidophilum ATCC 13870 ； (b)C. ace toaci dophi Ium A Idh。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述
实施例I、基因敲除载体pK19mohsadA7t*的构建
1)PCR扩增7過基因上、下游片段用基因组DNA提取试剂盒(sangon公司产品)提取嗜乙酸乙酸棒杆菌C ace toaci dophi Ium ATCC 13870的基因组。根据Gene Bank中Cr.glutamicum ATCC 13032 全基因组序列(Gene Bank No:Nc_006958. I)设计引物。以抽提的基因组为模板，Pl (SEQ ID No. I)和P2 (SEQ ID No. 2)为引物，在Taq酶(广州东盛公司产品)作用下PCR扩增Idh基因上游片段(7過基因起始密码上游503bp，即SEQ ID No. 5)。以P3 (SEQ ID No. 3)和P4 (SEQ ID No. 4)为引物，PCR扩增7過基因下游片段(7過基因终止密码下游500bp，即SEQ ID No. 6)。上述引物序列分别为
Pl AAGCTTAACTAGCTCTGCAATGACCTG (下划线为历idIII 酶切位点)
P2 -.GTCGA TAA TGTGA TTCCA TGACGTTGC (斜体序列为互补序列)
P3 -.GCAACGTCA TGGAA TCACA TTA TCGAC (斜体序列为互补序列)P4 AAGCTTTGTGAGTTTGTGTCACCTCATC(下划线为历idIII 酶切位点)
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到Idh基因上、下游片段，然后用胶回收试剂盒(sangon公司产品)进行割胶回收。2)重叠PCR连接7過基因上、下游片段以I)扩增的上下游片段混合后为模板，Pl和P4为引物PCR扩增。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，大小为1000 bp，并割胶回收。将回收片段和PMD18-T (Takara公司产品)混合连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态，挑取氨苄抗性克隆，菌落PCR鉴定pMD18-T中是否插入回收的PCR片段。通过测序(sangon公司测定)鉴定插入的PCR片段确实为Idh基因上、下游连接片段。3)基因敲除载体pK19mohsad 的构建将2)中插入连接片段的pMD18_T载体用历'/ dIII(Takara公司产品)酶切，37°C保温，将切出的连接片段(1000 bp)进行电泳回收。同时将载体pK19m0hsaM用历酶切，37°C保温，电泳回收，用碱性磷酸酶(CIAP)(Takara公司)进行去磷酸化反应后，与连接片段过夜连接，转化大肠杆菌JM109感受态，挑取卡那抗性克隆，菌落PCR初步鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒，酶切进一步鉴定(见图
2)。将构建好的基因敲除载体命名为pK19mohsadA7t*。实施例2、基因缺失的C ace toaci dophi Ium的制备
l)C.感受态的制备挑取新鲜平皿上 C ace toaci dophi Ium ATCC
13870，接种入含1%葡萄糖的液体LB培养基中，30°C、200r/min过夜培养，再转接到含1%(质量体积比)甘氨酸和0. 5% (体积比)Tween 80的30 mL LB培养基中，使起始OD6tltl达到
0.5，在37°C、100r/min继续培养20小时至OD6tltl达到0. 9。菌液冰浴后离心收集菌体，重复洗涤4次，用预冷的15% (体积百分比)甘油悬浮细胞，用I. 5mL离心管分装，每管100 u L。将感受态细胞放_70°C冰箱保存或直接用于电击转化。2)电击转化质粒pK19mohsaM-A7t* :将感受态细胞从冰箱中拿出并于冰水中融化，添加I U L预冷质粒pK19mohsaM- A Idh入感受态细胞中，混匀。将混合液转移至0. 2cm预冷电击杯(BioRad公司产品)中，于I. 2 kv，5ms条件下在电击仪(BioRad公司产品)上电击，然后立即加入I mL液体LBHIS培养基，轻轻混匀。将混合液转入I. 5 mL离心管中，50°C水浴I. 5小时，离心浓缩菌体至200 UL0将菌体混匀后涂布在含50 y g/mL卡那霉素的固体LBHIS培养基上，37°C培养48小时。3) 7過基因缺失的嗜乙酰乙酸棒杆菌的制备从上述培养基上挑选出的抗性克隆，接入含卡那的液体LB培养基中培养过夜，将过夜菌涂布在含20% (质量体积比)蔗糖的固体LB培养基上培养72小时。挑取在含蔗糖培养基上长出的克隆，并提取其基因组，以P1/P4为引物通过PCR扩增验证阳性克隆，即得到Idh基因缺失克隆，命名为Cacetoaci dophiIum YF/匕Idh。实施例3-4、嗜乙酰乙酸棒杆菌产丁二酸的方法
(I)好氧培养基(g/L):葡萄糖20，尿素I. 2，酵母膏4，酪蛋白4，(NH4)2SO4 IOjKH2PO4
1.5，K2HPO4 I. 5，MgSO4 7H20 I. 5，MnSO4 H2O 0. 005，FeSO4 7H20 0. 06，硫胺素 0. 0004，生物素 0. 0004，pH 7. 0 7. 2，115°C灭菌 20 min。(2)缺氧环境的培养基(g/L):葡萄糖80，碳酸盐60，KH2PO4 I. 5，K2HPO4 I. 5，MgSO4WH2O I. 5, MnSO4 -H2O 0. 005，FeSO4 7H20 0.06，硫胺素 0.0004，生物素 0.0004。pH
7.0 7. 2，115t灭菌 20 min。取嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870和YF/A7必新鲜斜面，分别各挑取一环接种于装有好氧培养基的三角瓶中，在35°C，300 r/min条件下培养36 h，按接种量1%进行扩大培养，培养48 h离心收集菌体。湿菌体按20% (重量/体积)转入装有缺氧环境培养基的带盖瓶子中，37°C培养36 h，期间补加NaHCOjP葡萄糖，维持pH 8. 5。通过高效液相色谱测定产物的含量，HPLC图谱如图3，前者丁二酸和乳酸的浓度分别为30. 7g/L和65. 7 g/L (图3a);后者丁二酸和乳酸浓度分别为54. 4g/L和0 g/L (图3b)。 实施例5、G ace toaci dophi lumYF/ Lldh 产丁二酸实验
按实施例4的方法，延长G ace toaci dophi lumXV/ Mdh在缺氧环境中培养转化135 h，期间补加NaHCO3、葡萄糖和取样测定，结果如表I所示45. 5小时，可积累丁二酸98 g/L, 94小时可积累丁二酸136g/L，而135 h，琥珀酸浓度达到142 g/L。表I C. acetoacidophilum NldhYY 产了二後实验错柴
权利要求
1.一株嗜乙酸乙酸棒杆菌(Corynebac teri um ace toaci dophi lum') YF/ Δ ldh,已于2012年2月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO :M2012041，其特征为乳酸脱氢酶基因Idh缺失菌株。
2.根据权利要求I所述的7過基因缺失菌株，其特征是使嗜乙酰乙酸棒杆菌缺失A*基因的方法包括以下步骤 (a)以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870基因组为模板，利用PCR法分别扩增基因上、下游片断，其中，上游片断的引物SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2，下游片断的引物SEQ IDNo. 3和SEQ ID No. 4，再采用重叠PCR法，以SEQ ID No. I和SEQ ID No. 4为引物，以基因上、下游片断为摸板，将7過基因上下游片断连接起来，形成7過基因缺失片段，7過上游片段序列为SEQ ID No. 5，Idh下游片段序列为SEQ ID No. 6 ； (b)将此7過基因缺失片段插入载体pK19mohsaM，构建基因敲除载体，命名为pK19mohsaci - Δ Idh ； (c)将构建的7過基因敲除载体导入嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870，分别通过卡那抗性和蔗糖抗性筛选培养基的筛选，得到缺失Idh基因的嗜乙酰乙酸棒杆菌的克隆菌YF/&ldh。
3.一种利用嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/生产丁二酸的方法，其特征是在好氧条件下，25-37°C培养12-48小时，然后将所得的菌体细胞转入以葡萄糖为底物，碳酸盐为二氧化碳供体的缺氧环境中，于25-37°C下继续培养30-100小时。
4.根据权利要求3所述的嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/A7i*生产丁二酸的方法，其特征是YF/Mc/ 的好氧条件，培养基组分为以g/L计葡萄糖20-60，尿素O. 5_5，酵母膏O. 1-5,酪蛋白 1-10，(NH4)2SO4 2-20，KH2PO4 O. 1-1. 5，K2HPO4 O. 1-1. 5，MgSO4 · 7H20 O. 1-1. 5，MnSO4 · H2O O. 0004-0. 005，FeSO4 · 7H20 O. 001-0. 06，硫胺素 O. 00005-0. 0005，生物素O.00002-0. 0005，pH 7. O 7. 2。
5.根据权利要求3所述的嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/A7i*生产丁二酸的方法，其特征是嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/Λ 7過的缺氧环境，培养基组分为以g/L计葡萄糖50-400，碳酸盐30-500，KH2PO4 O. 1-1. 5，K2HPO4O. 1-1. 5，MgSO4 · 7H20 O. 1-1. 5，MnSO4 · H2O O. 0004-0. 005，FeSO4 · 7H20 O. 001-0. 06，硫胺素 O. 00005-0. 0005，生物素 O. 00002-0. 0005，pH 7. O 7.2。
6.根据权利要求3所述的嗜乙酰乙酸棒杆菌YF/生产丁二酸的方法，其特征是所述菌体细胞，是好氧培养后的菌体，或好氧培养后离心的菌泥制成的固定化细胞。
全文摘要
一株嗜乙酰乙酸棒杆菌及其产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明公开了一株嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)YF/Δldh，以及用其生产丁二酸的方法。该菌株为通过基因敲除技术构建的乳酸脱氢酶基因(ldh)缺失菌，已于2012年2月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NOM2012041。该菌株具有产酸高，对钠离子耐受性和食品安全性好的特点，在葡萄糖为底物，碳酸氢钠为二氧化碳供体的缺氧环境中培养48小时，可积累丁二酸95g/L以上，培养94小时可积累丁二酸136g/L。
文档编号C12N1/21GK102634474SQ20121009474
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者于芳, 杨倩, 郑璞 申请人:江南大学