专利名称：一种针对hUHRF1基因RNA干扰的重组慢病毒载体及其制备的制作方法
技术领域：
本发明属分子生物学，生物医药及基因工程技术领域，主要涉及针对hUHRFl (human ubiquitin-like protein containing PHD and RING domain I)基因的RNA干扰重组慢病毒载体(LV-sh-hUHRFl)及其制备。
背景技术：
肿瘤的发生、发展是一个多因素造成，多步骤多阶段发展的过程，基因组的不稳定性或者是染色体数量上的改变(非整倍体)、染色体异位、基因扩增等等是癌变细胞的重要特征。最新的研究发现，人类基因组约25，000个基因中大约有350个基因为癌基因。其中仅有极少一部分的功能已经有所研究，而大部分功能未知的基因有待进ー步的研究。hUHRFl基因位于人类染色体19pl3. 3上，由2，327个bp组成，含有18个外显子，ー个2. 4kb大小的cDNA,编码793个氨基酸,其结构包括N端的类泛素(ubiquitin-like)模式，一个亮氨酸拉链模式(leucine zipper motif), PHD类型的锌指模式(Zinc fingermotif of PHD finger type), SRA-YDG 结构域和 C 端的环状锋指模式(Zinc finger motifof RING finger type)，在两个锌指模式中含有序列，即ー个ATP/GTP结合位点，ー个cyclinA/E-⑶K2磷酸位点，两个RB结合部位。hUHRFl是首先被克隆作为与细胞生长有关的核蛋白基因，并可能与细胞周期循环有密切的相关。目前，有关UHRF家族成员功能的研究主要集中在mUHRFl，已有的研究报道显示mUHRFl基因具有參与细胞周期调控、DNA修复、维持基因组稳定性等功能，最近研究发现，mUHRFl基因可能是与放射敏感性有关的新基因，因为降低胚胎细胞HEK293中mUHRFl的表达，可以使细胞对X射线和紫外线的辐射敏感性明显增加。hUHRFl与mUHRFl的蛋白序列存在73. 7%的同源性，提示hUHRFl基因可能也同样具有调节胚胎细胞辐射敏感性的作用。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术是抑制基因表达的常用手段，又叫基因沉默。RNA干扰的原理是当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA吋，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。RNA干扰过程主要有两个步骤一、双链RNA被细胞源性双链RNA特异性的核酸酶切成21-23个碱基对的短双链RNA，即小干扰RNA(smallinterference RNA, siRNA) ;ニ、siRNA的反义链与核酸酶形成了沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC),该复合体具有识别结合与小干扰RNA有同源序列的mRNA，并在特异位点将该mRNA切断。RNA干扰技术目前在基因治疗及研究中得到了广泛的应用，同时那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身可以进一步开发成为RNAi药物。shRNA(short hairpin RNA)即短发夹RNA包含两个短反向重复序列，其中ー个与目的基因互补，中间loop序列分隔组成发夹结构。在体内shRNA被加工成siRNA有效降解目的基因抑制其表达。但是要将该技术应用于临床治疗，需要解决RNA干扰片段表达持续及表达效率等重要问题。目前基因治疗的载体主要有非病毒载体及病毒载体，然而非病毒载体无法满足长时间的表达，这ー缺陷无疑被病毒载体填补。近年来慢病毒介导的RNA干扰技术在研究中已经取得了良好的开端。慢病毒载体(lentivirus-based vector, LV)是逆转录病毒的ー种，具有逆转录病毒的基本结构，但又有不同逆转录病毒的组分特性，该病毒既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞。病毒基因组可以整合宿主中，使得基因长时间稳定的表达，并且慢病毒具有较低的免疫源性，这使得慢病毒成为RNA干扰的最佳载体，目前广泛用于基因表达调控，基因治疗等领域。本发明选用第三代复制缺陷型慢病毒载体是自杀性(self-inactivating, SIN)病毒,在体内可以较长期的表达且安全性高,能很好的解决RNA干扰技术基因治疗的靶向性、安全性、整合效率等问题。因此慢病毒载体介导的RNA干扰效应在靶细胞内长期存在，可为更好发挥干扰作用创造条件。
发明内容
本发明的ー个目的是提供一种针对hUHRFl基因RNA干扰的重组慢病毒载体，该载体是自身失活的第三代慢病毒载体SIN，其特征在于，所述的载体SIN含有pGCSIL-GFP/U6-ShhUHRFl重组载体，所述的pGCSIL_GFP/U6_ShhUHRFl重组载体是在pGCSIL-GFP载体的 多克隆位点中连接了双链DNA片段；所述的双链DNA片段的序列为以下序列中的ー种(其中S代表正义链，AS代表反义链)(l)hUHRFl-homo-704 hUHRFl-homo-704-S 5 ’ -GATCCAGGAGGACGTCATTTACCATTCAAGAGATGGTAAATGACGTCCTCCTTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-704-AS 5，-AATTCAAAAAAAGGAGGACGTCATTTACCATCTCTTGAATGGTAAATGACGTCCTCCTG-3，(2) hUHRFI-homo-1766 hUHRFl-homo-1766-S 5， -GATCCGCGCAATGTCAAGGGTGGCTTCAAGAGAGCCACCCTTGACATTGCGCTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-1766-AS 5， -AATTCAAAAAAGCGCAATGTCAAGGGTGGCTCTCTTGAAGCCACCCTTGACATTGCGCG-3，(3) hUHRF I-homo-1984 hUHRFl-homo-1984-S 5，-GATCCCAGTATCCAGAAGGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCCTTCTGGATACTGTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-1984-AS 5， -AATTCAAAAAACAGTATCCAGAAGGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCCTTCTGGATACTGG-3，本发明的另ー个目的是提供所述的针对hUHRFl基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，根据hUHRFlmRNA序列，设计合成了双链DNA片段，所述的双链DNA片段为以下序列中的一种(l)hUHRFl-homo-704 hUHRFl-homo-704-S 5， -GATCCAGGAGGACGTCATTTACCATTCAAGAGATGGTAAATGACGTCCTCCTTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-704-AS 5， -AATTCAAAAAAAGGAGGACGTCATTTACCATCTCTTGAATGGTAAATGACGTCCTCCTG-3，(2)hUHRFI-homo-I766
hUHRFl-homo-1766-S
5-GATCCGCGCAATGTCAAGGGTGGCTTCAAGAGAGCCACCCTTGACATTGCGCTTTTTTG-3’h UHRFl-homo-1766-AS 5， -AATTCAAAAAAGCGCAATGTCAAGGGTGGCTCTCTTGAAGCCACCCTTGACATTGCGCG-3，(3) hUHRF I-homo-1984 hUHRFl-homo-1984-S5， -GATCCCAGTATCCAGAAGGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCCTTCTGGATACTGTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-1984-AS 5， -AATTCAAAAAACAGTATCCAGAAGGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCCTTCTGGATACTGG-3，然后将所述的DNA片段连接到pGCSIL-GFP载体的多克隆位点中构建成pGCSIL-GFP/U6-Sh hUHRFl 重组载体；再将 pGCSIL_GFP/U6_Sh hUHRFl 重组载体、pHelperl. O、pHelper 2. O三种载体共转染293T细胞培养，获得所述的重组慢病毒载体。
作为优选，在所述的双链DNA片段末端引入BamH I和EcoR I酶切位点。作为优选，用BamH I和EcoRI酶将pGCSIL-GFP载体酶切，回收大片段后将其与所述双链DNA片段连接后转化感受态菌，挑取重组阳性克隆。该载体转染细胞后能特异性降低hUHRFl基因的表达，从而可能应用于基因治疗或基因功能研究。本发明提供的LV-sh-hUHRFl最重要特征在于提供靶向性hUHRFl基因抑制效应，并用重组慢病毒载体作为载体，使得干扰效果得到持续性作用。整个制备过程全部使用质粒，避免传统方法腺病毒污染。本发明通过筛选最有效hUHRFl干扰序列，合成其双链DNA，连接到慢病毒骨架质粒载体中，与辅助质粒共转染工具细胞293T细胞，制备出hUHRFl干扰重组慢病毒载体LV-sh-hUHRFl。本发明的有益之处是I、本发明采用的pGCSIL-GFP载体含有U6启动子，能够在宿主细胞中持续表达有干扰作用的小RNA。同时该质粒能表达由CMV启动子驱动的荧光蛋白GFP，方便病毒包装时转染效率，以及感染宿主细胞的感染效率的检测。pHelper I. O质粒中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2. O质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSVg基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白。将以上三种载体共转入293T细胞能高效组装自身失活的第三代慢病毒载体(SIN)，増加了两个安全特性其一构建了自身失活(SIN)的慢病毒载体，即删除了 U3区的3’LTR，使载体失去HIV-I增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA。第二个特点是去除了 tat基因代之以异源启动子序列，这样原始的HIV基因，组中的9个基因在构建的HIV慢病毒载体中只保留了 3个(gag、pol和rev)。因此第三代HIV慢病毒载体系统更加安全。2、本发明针对hUHRFl靶基因根据在线原则设计出四个有效干扰序列，通过重组的慢病毒干扰载体系统构建包装获得LV-sh-hUHRFl，通过检测靶细胞中hUHRFl基因mRNA表达水平，筛选出最有效干扰片段，不仅克服非病毒载体的低转染效率，也避免了重组腺病毒产生的免疫原性，表达时间较短等缺点，能整合到宿主的基因组中并稳定表达，不会导致插入失活，使得干扰作用更加持续，具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小等优点，为有关hUHRFl基因的进ー步研究奠定良好实验基础，并能广泛用于体内基因治疗及基因功能研究。
图I为慢病毒骨架质粒pGCSIL-GFP载体结构示意图。图2为LV-sh-hUHRFl病毒感染MCF-7细胞72h后对hUHRFl基因表达干扰效果图片。阴性对照组，加阴性对照病毒感染的细胞组样品；hUHRF I-homo-704 组，加 hUHRF I-homo-704 病毒感染的细胞组样品；hUHRFl-homo-1615 组，加 hUHRFl-homo-1615 病毒感染的细胞组样品；hUHRFl-homo-1776 组，加 hUHRFl-homo-1776 病毒感染的细胞组样品；hUHRF I-homo-1984 组，加 hUHRF I-homo-1984 病毒感染的细胞组样品。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进ー步的说明。实施例I :针对基因hUHRFl的慢病毒载体构建I、寡核苷酸的设计及合成利用Invitrogen公司的在线RNAi系列设计软件BLOCK-iT RNAi Designer,设计针对hUHRFl基因mRNA序列(ΝΜ_001048201)的4个干扰靶序列(參见下表)，并合成相应的双链DNA (上海生エ生物工程技术服务有限公司)。LV3-shRNA模板中的loop结构选用了 TTCAAGAGA以避免形成终止信号。正义链模板的5’端添加了 GATCC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了 AATTC，与EcoRI酶切后形成的粘端互补。
权利要求
1.一种针对hUHRFl基因RNA干扰的重组慢病毒载体，该载体是自身失活的第三代慢病毒载体SIN，其特征在于，所述的载体SIN含有pGCSIL-GFP/U6-Sh hUHRFl重组载体，所述的pGCSIL-GFP/U6-ShhUHRFl重组载体是在pGCSIL_GFP载体的多克隆位点中连接了双链DNA片段；所述的双链DNA片段的序列为以下序列中的ー种(1)hUHRFl-homo-704hUHRFトhomo-704-S 5，-GATCCAGGAGGACGTCATTTACCATTCAAGAGATGGTAAATGACGTCCTCCTTTTTTTG-3，hUHRFトhomo-704-AS 5，-AATTCAAAAAAAGGAGGACGTCATTTACCATCTCTTGAATGGTAAATGACGTCCTCCTG-3，(2)hUHRFI-homo-I766hUHRFトhomo-1766-S 5，-GATCCGCGCAATGTCAAGGGTGGCTTCAAGAGAGCCACCCTTGACATTGCGCTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-1766-AS 5，-AATTCAAAAAAGCGCAATGTCAAGGGTGGCTCTCTTGAAGCCACCCTTGACATTGCGCG-3，(3)hUHRFI-homo-I984hUHRFトhomo-1984-S 5，-GATCCCAGTATCCAGAAGGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCCTTCTGGATACTGTTTTTTG-3，hUHRFトhomo-1984-AS 5，-AATTCAAAAAACAGTATCCAGAAGGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCCTTCTGGATACTGG-3，。
2.权利要求I所述的针对hUHRFl基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，根据hUHRFlmRNA序列，设计合成了双链DNA片段，所述的双链DNA片段为以下序列中的ー种(1)hUHRFl-homo-704hUHRFトhomo-704-S 、 5，-GATCCAGGAGGACGTCATTTACCATTCAAGAGATGGTAAATGACGTCCTCCTTTTTTTG-3，hUHRFトhomo-704-AS 、5，-AATTCAAAAAAAGGAGGACGTCATTTACCATCTCTTGAATGGTAAATGACGTCCTCCTG-3，、(2)hUHRFI-homo-I766hUHRFトhomo-1766-S 、、5，-GATCCGCGCAATGTCAAGGGTGGCTTCAAGAGAGCCACCCTTGACATTGCGCTTTTTTG-3，hUHRFl-homo-1766-AS 、5，-AATTCAAAAAAGCGCAATGTCAAGGGTGGCTCTCTTGAAGCCACCCTTGACATTGCGCG-3，(3)hUHRFI-homo-I984hUHRFトhomo-1984-S 、 5，-GATCCCAGTATCCAGAAGGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCCTTCTGGATACTGTTTTTTG-3，hUHRFトhomo-1984-AS 、 5，-AATTCAAAAAACAGTATCCAGAAGGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCCTTCTGGATACTGG-3，然后将所述的DNA片段连接到pGCSIL-GFP载体的多克隆位点中构建成pGCSIL_GFP/U6_Sh hUHRFl重组载体；再将pGCSIL-GFP/U6-ShhUHRFl重组载体、pHelperl. 0、pHelper 2. O三种载体共转染293T细胞培养，获得所述的重组慢病毒载体。
3.根据权利要求2所述的针对hUHRFl基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，在所述的双链DNA片段末端引入BamH I和EcoRI酶切位点。
4.根据权利要求2所述的针对hUHRFl基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，用BamH I和Eco RI酶将pGCSIL-GFP载体酶切，回收大片段后将其与所述 双链DNA片段连接后转化感受态菌，挑取重组阳性克隆。
全文摘要
本发明涉及一种针对hUHRF1基因RNA干扰的重组慢病毒载体及其制备。实验构建了针对hUHRF1基因的ShRNA的慢病毒载体，将合成的针对ShRNA的DNA片段通过慢病毒载体介导，还与pHelper 1.0、pHelper 2.0两种载体共转染293T细胞培养，获得重组慢病毒载体后，转染目的细胞，实现针对hUHRF1基因的RNA干扰。采用的自身失活的第三代慢病毒载体(SIN)，具有安全可靠、可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小等优点，是一种理想载体。本发明的慢病毒载体，对人乳腺癌细胞MCF-7干扰效果达70-85％，因此本发明重组慢病毒载体为有关hUHRF1基因的进一步研究奠定良好实验基础，并能广泛用于体内基因治疗及基因功能研究。
文档编号C12N15/113GK102643860SQ20121009390
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者殷浩金 申请人:常熟市常福有机复合肥有限公司