用于全身循环的短干扰rna基因传递系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是涉及siRNA传递及其体内全身循环（systemic circulation)的效率得 到改善的基因传递系统的发明，更具体而言，本发明是关于以聚乙二醇（PEG)和R9(精氨酸 (arginine))肽为基础的全身循环用siRNA基因传递系统的发明。
【背景技术】
[0002] 虽然作为通常的蛋白质治疗的替代方法，各种基因治疗技术得到了很大发展，但 其中还存在待解决的重要课题。基因治疗的主要课题之一是实现具有最小的细胞毒性且能 够通过细胞质膜（动物细胞）和核膜的有效的基因注入（influx)。
[0003] 基因治疗系统大体分为病毒载体介导系统和非病毒载体介导系统。利用逆转录 病毒（retrovirus)或腺病毒（adenovirus)等制作而成的病毒载体虽然具有向细胞内的 高转染（transfection)效率的优点，但还具有如体内（in vivo)的免疫原性问题和基因 重组之类的内在问题。为了克服这种病毒载体的安全性问题，各种聚合物性基因传递系统 发展为替代传统的病毒载体-现有基因传递方法的应对方案。但是，聚合物载体具有如 核内体逃逸（endosomal escape)和核定位（nuclear localization)之类的细胞内运输 (trafficking)屏障的问题。
[0004] 基于合成肽的基因传递系统，因能够在低pH下引起核内体膜内的渗漏，使DNA浓 缩，且促进核内体逃逸，所以能够克服与聚合物基因传递系统相关的上述问题。
[0005] 由于这些原因，开发了各种合成肽，用来促进在体外（in vitro)各细胞株中的基 因传递。但这对于体内（in vivo)适用同样存在毒性和血清不稳定性等问题。特别是，虽 然正在进行与其相关联的利用短的阳离子性肽的载体的研宄，但这时存在核酸在细胞外空 间不稳定的问题，且还存在核酸与复合体的稳定性和基因表达的水准等不充分的问题。
[0006] 其中，传递RNAi核酸时有如下缺点，因与核酸的复合体的稳定性低，不易向合成 肽传递，一般利用脂质或脂质体等完成，很难进行有效的体内全身循环。
[0007] 因此本发明的发明人在研宄利用肽的基因传递系统的过程中，特别是发现了将一 侧末端或两侧末端结合有Cys的R9结构的载体进行聚乙二醇化（PEGylation)能够显著提 高siRNA的体内传递效率，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0008] 本发明的主要目的在于提供一种由含有聚乙二醇（PEG)和R9(精氨酸）肽的 siRNA传递系统以及通过全身给药将其向体内传递的方法。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种含有聚乙二醇（PEG)和R9(精氨酸）肽以及目标 siRNA的复合体。
[0010] 本发明的又一目的在于提供含有所述全身循环用siRNA传递系统和siRNA的复合 体的各种用途。
[0011] 为了解决所述课题，提供以聚乙二醇（PEG)和R9(精氨酸）肽为基本结构的 (PEG-R9)的全身循环用siRNA传递系统的各种用途。特别是涉及通过全身给药向体内传递 目标疾病治疗用siRNA基因的有效方法。
[0012] 作为一个实施方式，本发明提供一种全身循环用siRNA传递系统（PEG-R9)，其特 征在于，包含聚乙二醇（PEG)和R9(精氨酸）肽。
[0013] 作为另一实施方式，本发明提供一种全身循环用复合体（PEG-R9-SiRNA)，其特征 在于，包含聚乙二醇（PEG)、R9(精氨酸）肽和目标疾病治疗用siRNA基因；并提供含有全身 循环用复合体（PEG-R9-siRNA)的全身循环用药物组合物。
[0014] 特别是，所述R9 (精氨酸）肽以一侧末端或两侧末端结合有Cys为特征，优选具有 Cys- (D-R9) -Cys 或 Gly- (D-R9) -Cys 结构。最优选具有 Cys- (D-R9) -Cys 结构。
[0015] 这时，所述由于Cys的氨基（-NH2)，具有PEG结合在肽的一侧末端或两侧末端的结 构。
[0016] 另外，聚乙二醇（PEG)优选具有500道尔顿的分子量。
[0017] 而且，本发明的全身循环用复合体由于具有200nm以下直径的纳米大小，因此作 为siRNA传递系统具有尺寸小的优点，由于具有6:1~15:1的电荷比率（+/-)，因此具有优 异的转染效率。这时，具有12:1电荷比率（+/_)时转染效率最好。
[0018] 所述复合体增加用于治疗目标疾病的SiRNA的体内循环时间，能够显示出出色的 治疗效果。
[0019] 本发明的一实施例中使用siVEGF作为癌症治疗基因 siRNA。
[0020] 如此，本发明的PEG-R9-siRNA能够作为具有高转染效率、低细胞毒性、高目标基 因表达效率的体内循环体有效的siRNA传递系统使用。
[0021] 本发明的PEG-R9尤其能够成为由SiRNA的全身给药引起的显著提高体内传递效 率的siRNA传递系统的基础。在各种蛋白质传递结构域种类中，特别将本发明的在一侧 末端或两侧末端结合有Cys的R9结构体的末端聚乙二醇化（PEGylation)，能够显著提高 siRNA的体内（systemic)的传递效率，因此作为有效的全身给药用siRNA基因传递系统非 常有用。
【附图说明】
[0022] 图1是利用本发明的聚乙二醇（PEG)与寡聚精氨酸（R9)的合子的核酸传递系统 模式图。
[0023] 图2是确认PEG-R9的合子形成和确认其稳定性的结果。
[0024] 图3是测定PEG-R9_siVEGF复合体（polyplexes)形成后的大小和电动电位的结 果。
[0025] 图4是比较在PEG-R9具有的C-(D-R9)-C结构与其他结构的D-R9比较转染效率 的结果。
[0026] 图5是为了寻找最佳PEG分子量，利用PEG500与PEG1000进行荧光素酶分析的结 果。
[0027] 图6是对细胞内基因传递效率的荧光素酶分析（a)和对细胞毒性的MTT分析结果 (b) 〇
[0028] 图7是对利用cys-R9-cys、PEG-R9、PEG-cys-R9-cy的各种情况的传递系统的大小 和电动电位的分析结果。
[0029] 图 8 是对利用 PEG-cys-R9_cys、PEG-TAT、PEG-cys-TAT-cys 的各种情况的传递系 统的大小和电动电位的分析结果。
[0030] 图9是比较根据PEG-R9-SiVEGF复合体（polyplexes)给药的癌症细胞成长速度 的曲线图。
[0031] 图10是对移植了癌细胞的裸鼠给药10日后观察癌症细胞生长抑制的照片。
【具体实施方式】
[0032] 对本发明中使用的用语的定义如下。
[0033] "基因"表示蛋白质编码或转录时或调节其他基因的表达时具有功能作用的任意 核酸序列或其一部分。基因可由编码功能蛋白质的全部核酸或者编码或表达蛋白质的核酸 的一部分组成。核酸序列可包含外显子、内含子、起始或终止区域、启动子序列、其他调节序 列或与基因邻接的特有序列内的基因异常。
[0034] 所谓〃多聚核苷酸（polynucleotide) 〃的用语不止表示核糖核苷酸，还表示脱氧 核苷酸等所有长度的核苷酸聚合物。
[0035] "核酸"表示任意的DNA或RNA，例如，包含组织样品中存在的染色体、线粒体，病毒 和/或细菌核酸。包含双链核酸分子的一条或2条，包含无损伤核酸分子的任意片段或一 部分。本发明中传递的代表核酸是siRNA。
[0036] 所谓〃载体（vector) 〃的用语表示能够将其他核酸搬运至与其相关的地方的核酸 分子。所谓〃表达载体（expression vector)"的用语包含能够合成由载体搬运的由各个 重组基因密码化的蛋白质的质粒、黏粒（cosmid)或菌体（phage)。优选的载体能够进行 相关核酸的自我复制与表达。
[0037] 〃转染（transfection) 〃表示将核酸（DNA、RNA等）直接导入培养动物细胞，在细 胞内表达遗传性状的方法。就导入的核酸而言，一般方法是将目标基因放入质粒等介质进 行导入。导入的基因在细胞内稳定时，大部分是因为嵌入染色体中。导入核酸的细胞被称 为性状导入体。由于性状导入效率非常低，为了提高效率开发了各种方法。其中有磷酸钙 共沉淀法、DEAE-葡聚糖处理法、电穿孔法、再分布法（将被称为脂质体的人工膜与制作DNA 复合体的细胞进行融合的方法）等方法。
[0038] 〃电动电位（zeta potential)"表示附着在带电粒子表面的不可动水与能够轻易 从粒子上脱离的可动水的扩散双层的正电荷密度差引起