非接触式电导法实现pcr反应过程的实时检测系统和方法

专利名称：非接触式电导法实现pcr反应过程的实时检测系统和方法
技术领域：
本发明涉及一种非接触式电导法实现聚合酶链反应(PCR)过程的实时检测系统和方法，包括聚合酶链反应(PCR)微芯片、非接触式电导电化学检测电极、高灵敏度读出电路和分析方法等，属电化学传感技术领域。
背景技术：
致病微生物的快速检测和分析是食品安全、环境监测、公共卫生等领域迫切需求的技术，实时荧光定量PCR技术为微生物的检测分析提供了有效的工具，该技术的主要优点是在核酸的扩增过程中对核酸进行定量分析，从而缩短了常规终点检测法所需要的时间。然而，目前所有的实时定量PCR均是基于光学检测方法，需要进行荧光标记同时需要复杂和昂贵的光学检测系统进行荧光检测，仪器构造复杂，难以小型化，只适合在中心实验室进行，因此目前尚缺乏适合于现场微生物快速测定的手段和仪器。电化学检测方法的原理是以脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的扩增产物为敏感对象，电化学电极为信号转换器，以电势、电流或电导等为特征检测信号，实现实时检测PCR反应过程。检测的依据在于1)DNA的一些组分在一定电势窗口下有电化学活性的 (例如鸟嘌呤)，可直接在电极表面实现电子转移；2)通过外部的一些氧化还原媒介(如亚甲基蓝、Hoechst 33258、道诺霉素和棘霉素等)来实现电子传递，借助于这些与DNA选择性结合的有电化学活性的指示剂来进行杂交检测。以纳米金颗粒做标记物不仅有更好的生物相容性，它的表面可以催化银颗粒的沉积，增加了信噪比。近年来的电化学检测法已经达到了较高的灵敏度，如灵敏度达ng/uL级或用ssDNA探针标记杂交甚至可以达到单分子检测水平。相比较于荧光法的背景光干扰多，电化学法的背景噪声较小，检测效率较高。如上所述，电化学检测具有灵敏度高、成本低、易于集成化、微型化等优点，若能将电化学检测方法与先进的微机械加工技术相匹配，具有实现大规模生产的潜力，因此采用电化学方法对PCR 过程进行实时检测，不仅能得到可与荧光定量PCR媲美的检测结果，且电化学检测所需的设备简单，操作方便，可在条件简陋的场合应用且不需要专业人员操作。虽然片上的DNA扩增分析的电化学技术已经较成熟，目前文献报道的电化学检测实时PCR过程均采用接触式电极直接测定，不管是用非标记法还是标记法，基于的原理都是检测终产物在电极表面富集或引起电极表面离子浓度变化而引起电流或电阻抗的变化。 因此电极表面会有残留物，它的二次检测远达不到第一次检测时的性能。虽然可以在二次检测前对电极进行清洗处理，但是这样的过程就复杂化了，且效果不能十分明显。若使用一次性电极，则增加了检测的成本和资源的浪费。接触法检测的优点是分辨率较高，但是表面吸附易饱和，检测范围受限，易污染，复用性不高，使用寿命短。且电极加压后对溶液中分子有电离水解作用，不利于敏感检测。在使用标记法的过程中，标记物与目标DNA杂交，其空间结构都发生了变化，发生空间阻碍效应，从而影响结合效率
发明内容
本发明的目的在于提供一种非接触式电导法实现PCR反应过程的实时检测系统和方法，本发明的特征是用非传统的非接触式电导检测方法(capacitively-coupled, contactless conductivity detection, C4D)代替传统的接触式电化学方法,实现集成芯片上的PCR过程的实时检测系统。非接触式方法因为电极不与电解液直接接触，大大小减小了背景噪声，可以达到更小的检测限。另外也无直接接触导致的电极表面产生气泡的问题。易集成，且电极和溶液都不易被污染，电极的复用性很高。目前文献报道应用于电泳芯片的非接触式电极系统可达的检测限在5X 10_8和1X10_7M之间。本发明是将非接触式概念引入到集成的PCR扩增及检测芯片中，不仅大大简化了 PCR扩增的体系(无需标记物和探针)，而且又提高了电极的使用寿命，由此减少了设备的成本。而且系统所需的设备都十分简单，易集成，可在条件简陋的现场使用及便携式应用。本发明的目的是通过以下措施来达到基于微机电系统(MEMS)技术设计制造PCR 微芯片，并集成非接触式电导检测器，设计制作微米级甚至纳米级介电绝缘层，显著提高电导检测器的灵敏度；PCR微芯片同时集成温度传感电极和加热电极，基于差分信号放大原理和温度补偿原理，显著提高读出电路的分辨率和抗干扰能力；工作电极采用的是叉指电极结构，每根电极均作为工作电极，因此它感应的总体信号要远大于单电极，具有更高的检测灵敏度和分辨率；本发明采用实际样本进行分析和验证所建立PCR反应过程的非接触式电导检测方法。本发明提供了一种有效的检测实时核酸扩增过程的电化学检测方法，通过该方法可以检测待测核酸的初始浓度，且能在PC机上实时监测核酸扩增过程。用厚度为100 μ m 的盖玻片作绝缘层做初步的实验，在以纯化的DNA水溶液为检测对象的实验中，只需10 μ L 的样品体积，可达到O. Ipg/μ L的检测下限和O. 5pg/yL的分辨率，且可区分单链或双链 DNA (单链DNA的阻抗比双链DNA大，同浓度双链DNA产生的电压差大于单链DNA)。随着绝缘层厚度的减小和材料的优化(纳米级厚的氮化硅或二氧化硅)，该非接触式检测系统的灵敏度和分辨率预计可被改善到fg/ U L级以下。相应地，fg/ μ L级水平的模板初始浓度的PCR反应预计在温度循环5min以内即可定性检测到明显的扩增产物增加引起的电压变化，非常快速有效。用已知的不同初始浓度的模板进行一系列的PCR扩增反应，记录相同循环数内产生的电压差变化，制定标准曲线，即可作为定量PCR的依据。实现该方法的系统易控制，操作简便，易集成，体积小，功耗小，成本低，检测电极使用寿命长。实现该方法的集成系统因为体积小，可将多个反应腔和控制系统做在同一个装置上，实现高通量并行检测多个样本，且易便携化，可在现场应用，有非常广的应用范围。所述实时检测系统包括基于MEMS集成的PCR微芯片、交流激励电源、电流转电压及放大电路、温度传感电路、加热电路、数模/模数转换接口 DAQ及上位的Labview控制中心；其中，交流激励电源连接PCR微芯片中的电化学检测电极；加热控制电路连接PCR微芯片中的加热电极；电化学检测电极另一端则与电流转电压及放大电路连接；温度传感电路连接PCR微芯片中的温度传感电极；温度传感电路、电流转电压放大电路又与模数/数模转换接口 DAQ连接，模数/数模转换接口 DAQ分别与上位机的Labview控制中心及加热控制电路连接，所述的集成PCR微芯片集成了微反应腔、温度传感电极和加热电极以及电化学检测电极，硅基底正面刻蚀微反应腔，背面集成加热电极和温度传感电极；电化学检测电极为叉指电极，通过绝缘层与硅基底键合，与微反应腔形成密闭结构，通过控制硅基底背面的温度传感器电极和解热电极实现扩增反应所需的温度循环。本发明提供的非接触式电导检测实时核酸扩增过程的方法与传统的核酸扩增电化学检测法具有以下特点I、本发明采用非接触式电导检测，避免了检测电极和待测对象之间的相互污染， 无需电极清洗重生等复杂步骤，操作简便，电极复用性高，使用寿命长，且检测结果可靠性闻。2、本发明电化学检测电极采用叉指电极作为工作电极，检测效率远远大于普通的单工作电极。叉指电极的工作性能由叉指长度、叉指间距、叉指数、有效工作面积等多种参数决定，通过多种方式的优化都可再大大改进叉指电极的检测分辨率和灵敏度，升级方便。3、本发明采用等离子体增强化学汽相沉积(PECVD)技术溅射二氧化硅或氮化硅薄膜代替传统的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料和普通玻片来作电极的电介质层和绝缘层， 既可起到隔离作用，又可使溶液和电极非常接近，减小绝缘层本身对电化学电导的贡献，以提高灵敏度和分辨率，同时材料表面特性更适合PCR扩增过程。4、本发明的单个反应集成系统体积小、功耗小，将多个反应腔和控制系统集成，可同时扩增检测多个DNA样品，缩短检测分析的时间，提高了检测的信息通量。5、本发明的实现可采用微型化的电源和电路装置，结构简单，功耗低，电压要求低，是一种便携化检测分析设备。6、本发明所述的温度控制系统采用Labview完成，测温电极的电阻信号转换成电压信号经放大，该电压信号通过数据采集卡进行模数转换成为数字电压信号，并由Labivew 进行数据分析生成反馈信号，经由数据卡的D/A功能输出电压控制加热电极温度的上升或下降。反馈信号可采用PID运算控制等算法，可提高温度控制的准确性和智能化。7、本发明采用同时具有数模转换和模数转换功能的多功能数据卡，将电导信号、 温度信号和温度反馈信号与PC机的通讯集成在一起，简化整个系统的结构。8、本发明由于采用了微机电系统(MEMS)技术制造微反应室、加热电极、温度传感器和非接触式电导检测器，其温度控制装置结构和温度控制程序简单，扩增反应迅速，电导检测分辨率和灵敏度高，并且可由PC机控制软件实现了整个反应过程的程序化、智能化， 图形化操作界面友好便于人机对话。


图I.本发明的系统设计结构示意图。图2.微集成芯片的结构图。其中，(A)PCR微芯片的截面示意图；(B)反应腔体结构；(C)集成的温度传感器电极加热电极结构；(D)CD4用的叉指电极结构。图3.本发明中的信号转换和调理电路。㈧温度信号转换及放大电路，Rsensor为温度传感器的电阻，Vsensor为温度信号转化并放大后的电压信号，该端直接与DAQ的模数转换输入口相连；⑶芯片加热控制电路，中间矩形框为电压调节器芯片，Vlfeatw为直接加载在加热电极两端的加热电压，V_tMl为控制电压调节器芯片电压开断的信号，与DAQ的数模转换接口相连；(C)叉指电极的输出信号转换电路，Ii为叉指电极的输出电流，V。为电流转换并放大后的电压信号，与DAQ的模数转换接口相连。图4. PC软件控制的操作界面。
具体实施例方式下面结合附图描述本发明的具体实施方式
。图I显示的为本发明的整个系统的结构装置示意图。该系统包括集成的PCR微芯片(虚线框内)、交流激励电源、电流转电压及放大电路、温度控制电路(传感器信号转换及放大和加热控制)、数模/模数转换接口(DAQ)及上位机的Labview控制中心。其中，集成的PCR微芯片结构，集成了微反应腔(B)、温度传感器电极和加热电极 (C)、电化学检测电极⑶等模块(如图2所示)。图2中，㈧为结构示意图，该尺寸并非实际的尺寸，实际的集成的PCR微芯片平面尺寸为15_X12mm。各层中检测电极、PCR反应所在的腔体和集成的温度控制电极的实际结构和尺寸分别对应(B)、(C)、(D)。(B)中反应腔中心面积约为50mm2,2个圆形进样口半径为Imm,微流体管道宽50μηι。(C)中的电极材料为金属钼。⑶中的叉指电极材料为金属金，叉指宽3mm, 60mm长,相邻叉指间距为9mm,圆形进样口半径为2mm，键合时与⑶中的进样口对准。图㈧显示共有两层基底构成。制作的方法是首先在双抛光氧化的硅基底一面用光刻胶AZ4620将掩模板图形化，显影后用HF 溶液溶解裸露的SiO2,同时用胶或者蓝膜保护未光刻的另外一面SiO2层；将腔体图形表面的Si基底暴露出来，再用50% KOH在50°C恒温水浴槽中刻蚀出具有一定深度的腔体。用丙酮除胶并重新干净硅基底，另外一面用lift-off工艺制作Pt金属电极(C)，作为集成的加热电极和温度传感电极，用于实时精确的温度控制。在电极支撑物(例如普通玻璃片) 表面用同样的lift-off工艺制作金电极作为电化学检测电极(D)并打孔作为进出样口，然后用标准工艺在此电极表面生长很簿的Si3N4或SiO2层作为绝缘层。叉指电极面与硅基底的微反应腔体面通过紫外胶键合，两基底的圆形进样口分别对准，这样就可与微反应室形成密闭结构。(C)和(D)中电极通过焊接点上的金属引线与外围控制电路相连。在实际检测中，两个微集成芯片同时进行PCR扩增反应并实时检测两路的电导信号。如图I中所示，交流激励源产生35kHz、IOV的正弦电压，接入叉指电极使其产生感应电流。此感应电流不能直接被数据卡采集，因此需要通过简单的运算放大器电路(图3C) 转换成电压信号。因为电容耦合产生的电流较小，转换成的电压信号也较微弱，不能直接测量。通过调节图3C的电阻R阻值实现合适倍数的放大，这样转化后的电压才能控制在数据采集卡的采样范围和采样精度之内。为避免高频交流信号之间互相干扰，叉指电极的激励信号线与信号读出线尽量远离并相互隔离。调理后的电压信号通过高性能接口 DAQ(采样频率至少为500kHz,幅度-IOV 10V)采样被传输至上位机的Labview控制中心,进行去噪、滤波、波形检测等数字处理，最后以极微小的延时显示当前的微芯片中溶液的电导变化引起的电压变化。检测样品中，PCR扩增的进行同时引起各种离子的释放，从而引起溶液电导的变化，产生感应电流的差值。所以上位机的Labview控制中心显示的信号差实时反应了 PCR扩增情况。图I中的温度控制模块实现信号转换和信号调理功能，由图3A的桥式电路及信号放大电路组成。随着芯片温度的变化，芯片上的Pt温度传感器电阻也产生线性变化，该电阻变化通过桥式电路转化成电压信号。但是该电压信号较微弱，不能直接测量，因此电压信号同样需要放大到DAQ的采样范围和精度之内；上位机的Labview控制中心对经DAQ 采集的温度信号进一步通过低通滤波电路去除背景噪声，提高了电压信号的信噪比；最终将处理过的数字电压将信号还原成温度传感器检测的温度信号，从而实现对芯片温度的测定。接着上位机的Labview控制中心以此温度信号为输入反馈信号，根据标定的温度循环的要求计算，通过脉冲调制算法(PWM)得到电极加热的控制信号，经过DAQ形成模拟信号供给电压调节器(图3B);电压调节器控制加载在加热电极两端的电压开断时间，从而调节功率，实现不同速率的温度升降。PWM算法可以保证温度的快速升温，防止温度过冲并稳定温度。直流电源由集成的DC/DC模块直接供电。系统的模拟电路部分(图3)都集成在一个约15cmX IOcm大的PCB板上，并通过屏蔽盒与外界隔离，有效抵制外界干扰。图4显示的是本发明中上位机的Labview控制中心操作界面。叉指电极的信号流与温度调控信号通过同一个多路DAQ与上位机相连,并由Labview控制中心对数据采集卡实现分时复用功能，保证多通道工作的前提下又能在单通道实现较高采样率。数字信号的滤波、计算等处理都在Labview程序后端平台进行，并未在操作界面显示。控制界面用于温度控制的启动、实际温度的显示和PCR过程电压变化的实时显示及存储等操作，非常直观且操作非常简便。系统操作步骤I、微反应腔体先用O. 5% (质量)的BSA溶液注满半封闭I小时，可以减少PCR反应物的被吸附，提高芯片PCR的反应效率。2、将BSA抽取干净，用气动进样方式将反应混合物注入微反应腔，进出口用石蜡油或PDMS密封，防止温度循环过程中样品的挥发。一个微芯片加入带有模 板的PCR反应混合物。另外一个微芯片加不带模板的PCR反应混合物，作为阴性对照样本。进样品用石蜡油或矿物油密封。3、运行Labview程序，看到稳定的温度和电压波形显示后，选择存储的文件地址， 然后启动温度控制功能，即可进行PCR扩增反应，并将实时检测的电导信号变化显示及存储。PCR扩增反应无需标记物和探针。4、可根据反应结果自主选择反应结束的时间。停止温度控制后，将反应混合物从微腔体中抽取，再用缓冲液和去离子水多次清洗微腔。因为电极不与检测样本直接接触，所以电极的性能一直保持不变，则腔体清洗后的芯片即可用于下一次的检测。
权利要求
1.一种非接触式电导法实现PCR过程的实时检测系统，其特征在于包括基于MEMS集成的PCR微芯片、交流激励电源、电流转电压及放大电路、温度传感电路、加热电路、数模/模数转换接口 DAQ及上位的Labview控制中心；其中，交流激励电源连接PCR微芯片中的电化学检测电极；加热控制电路连接PCR微芯片中的加热电极；电化学检测电极另一端则与电流转电压及放大电路连接；温度传感电路连接PCR微芯片中的温度传感电极；温度传感电路、电流转电压放大电路又与模数/数模转换接口 DAQ连接，模数/数模转换接口 DAQ分别与上位机的Labview控制中心和加热控制电路连接，所述的集成PCR微芯片集成了微反应腔、温度传感电极和加热电极以及电化学检测电极，硅基底正面刻蚀微反应腔，背面集成加热电极和温度传感电极；电化学检测电极为叉指电极，通过绝缘层与硅基底键合，与微反应腔形成密闭结构，通过控制硅基底背面的温度传感器电极和加热电极实现扩增反应所需的温度循环。
2.按权利要求I所述的系统，其特征在于电化学检测电极与硅基体的微反应腔体通过紫外胶键合，两基底的圆形进口分别对准，叉指电极通过焊接点上的金属引线与外围电流转电压放大电路相连。
3.按权利要求I所述的系统，其特征在于①交流激励电源产生35KHz、10V的正弦电压，接入叉指电极产生感应电流；感应电流信号通过电流转电压电路转换并放大成可被数据采集卡检测的电压信号；②所述的接口DAQ采样频率至少为500KHz，幅度为-IOV 10V。
4.按权利要求I所述的系统，其特征在于(a)所述的集成的PCR微芯片尺寸为15mmX12mm ；(b)所述的微反应腔的面积为50mm2,微流体管道宽50μ m。
5.按权利要求I或2所述的系统，其特征在于所述的叉指电极材料为金，叉指宽为 3mm,长为60mm,相邻叉指间距为9mm,圆形进样口半径为2mm,键合时与反应腔体进样口对准。
6.按权利要求3所述的系统，其特征在于检测的电压信号被送入上位机的Labview控制中心，进行去噪、滤波、波形检测处理，最后以极微小的延时显示当前的微芯片中溶液的电导变化引起的电压变化；检测中，PCR扩增的进行同时引起各种离子的释放，从而引起溶液电导的变化，产生感应电流的差值，上位机的Labview控制中心显示的信号差实时反应了 PCR扩增情况。
7.按权利要求I或6所述的系统,其特征在于上位机的Labview控制中心采集到温度信号后，根据标定的温度循环的要求，通过PWM脉冲调制算法，给出加热电极的电压控制； PWM算法保证温度的快速升温，防止温度过冲并稳定温度。
8.使用按权利要求1-6中任一项所述的系统的方法，其特征在于操作步骤是(1)微反应腔胶体先用O.5%的BSA注满半封闭I小时，减少PCR反应物的被吸附，提高芯片PCR的反应效率；(2)将BSA抽取干净，用气动进样方式将反应混合物注入微反应腔，进出口用石蜡油或 PDMS密封，防止温度循环过程中样品的挥发；一个微芯片加入带有模板的PCR反应混合物； 另外一个微芯片加不带模板的PCR反应混合物，作为阴性对照样本；进样品用石蜡油或矿物油密封；(3)运行上位机的Labview控制中心，当显示稳定的温度和电压波形后，选择存储的文件地址，然后启动温度控制功能，即可进行PCR扩增反应，并将实时检测的电导信号变化显示及存储；(4)根据反应结果自主选择反应结束的时间；停止温度控制后，将反应混合物从微腔体中抽取，再用缓冲液和去离子水多次清洗微腔；因为电极不与检测样本直接接触，所以电极的性能一直保持不变，则腔体清洗后的芯片即可用于下一次的检测。
9.按权利要求8所述的系统使用方法，其特征在于步骤(3)中PCR扩增反应无需标记物和探针。
全文摘要
本发明涉及非接触式电导法实现PCR过程的实时检测系统和方法，其特征在于所述系统包括基于MEMS集成的PCR微芯片、交流激励电源、电流转电压及放大电路、温度传感电路、加热电路、数模/模数转换接口DAQ及上位的Labview控制中心；所述的集成PCR微芯片集成了微反应腔、温度传感电极和加热电极以及电化学检测电极，硅基底正面刻蚀微反应腔，背面集成加热电极和温度传感电极；电化学检测电极为叉指电极，通过绝缘层与硅基底键合，与微反应腔形成密闭结构，通过控制硅基底背面的温度传感电极和加热电极实现扩增反应所需的温度循环。本发明所述的检测系统的灵敏度和分辨率可达fg/μL以下，电极复用性高，使用寿命长、检测结果可靠性高。
文档编号C12M1/34GK102604827SQ20121009310
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者张洹千, 方新心, 景奉香, 赵建龙, 金庆辉 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所