专利名称：哈克尼西棉不育胞质棉花恢复系的分子鉴定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及ー种棉花恢复系纯度鉴定和分子标记辅助育种的分子鉴定方法。
背景技术：
杂种优势的研究和利用对提高棉花的产量、改进品质、提高抗性具有显著效果。目前，我国育苗移栽地区的大部分棉农都已经栽种杂交棉；而且黄河流域棉区，甚至新疆等直播棉区也正在大力发展杂交棉。然而，棉花杂交种子的生产方式主要是人工去雄辅助授粉杂交制种法(占90%以上)。随着棉花主要生产区及其周边地区劳动カ成本逐年提高，种子生产成本已经越来越高，从而大大限制了杂交棉的进ー步大規模推广利用。与人工去雄辅助授粉杂交制种方式相比，利用“三系法”进行制种具有程序简便，成本仅为人工去雄杂交的30-40%，种子纯度高，适合大面积制种等独特优势。因而，三系杂交棉花的大面积推广，对于提高植棉效益，増加棉农收益，稳定棉花种植面积都具有重要的意义。目前，以哈克尼西棉细胞质雄性不育材料为基础的三系配套材料已经在我国得到成功应用，并已经在生产上开始应用。但是，与人工制种相比，可用的亲本资源仍然很少，特别是具有强恢复力的优良恢复系材料仍然是三系杂交棉选育的主要限制因素。因此，在三系杂交棉选育过程中，具有强恢复力的优良恢复系选育和改良一直是研究的重点和难点。而采用常规育种技术选育和改良新恢复系材料需要年限长，且每年转育后都需要进行大量的田间测交和鉴定工作，以确保恢复基因在转育和改良过程中没有丢失，从而需要耗费大量的棉田、人力和财力。因此，通过分子标记辅助选择如何稳定可靠又快速简便的进行恢复系选育和改良成为本发明的关键核心。分子标记直接从DNA水平反映出核苷酸序列的差异，它不受发育阶段、环境因素以及基因是否表达的影响，具有数量非常丰富，遗传稳定等特点。目前，随着分子生物学的飞速发展，分子标记检测技术已经发展出几十种技术可用于分子标记的筛选，比较常用的有RFLP、RAPD、ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP和SNP等，随着分子标记技术的不断发展和应用，目前，国内外已经越来越多的将各种分子标记技术应用在作物育种材料的分子标记辅助选择育种中。SSR(simple sequence repeat)也称为微卫星,是由基因组中1-6个核苷酸组成的基本単位重复多次构成的一段DNA。在所有真核生物基因组中均存在并且含量非常丰富，不仅存在于内含子中，也可以存在于编码区以及染色体的其它任何区域，具有多态性丰富、稳定性好、位点专ー性、共显性等特点。该方法对于目的基因具有很好的辅助选择效果，已成为分子标记在育种实践中直接应用的首选方法。在棉花中目前已开发的SSR引物已经超过一万对。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系选育田间鉴定检测方法所需时间长，消耗大、准确性差等的问题，提供ー种含哈克尼西棉不育胞质棉花恢复系的分子鉴定方法，从而可以加快恢复系选育和改良进程，同时保证恢复系种子纯度。为了实现上述的目的，本发明以含恢复基因的近等基因系群体和F2群体为材料，通过对7256对SSR引物的筛选，从中筛选到得到两对可以用于检测恢复基因及位点是否纯合的SSR引物C0T010 引物对正向引物5，-TCACGCTTATACCTACAATGC-3，(SEQ ID No. I)反向引物5’ -TTGGGATGAGGCTGAAC-3’ (SEQ ID No. 2)
CGR5340 引物对正向引物5’ -GGTGAACCAGTCGGAGATTT-3’ (SEQ ID No. 3)反向引物5’ -AGGCCACCGATCTTCACTC-3’ (SEQ ID No. 4)本发明还提供用于鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系的SSR标记，其为用SEQ ID No. I和2所示的引物扩增出的250bp处的特异性条带和/或SEQ ID No. 3和4所示的引物扩增出的370bp处的特异性条带。本发明的另ー个目的在于提供用所述的标记或引物在鉴定棉花恢复系纯度或新恢复系选育中的应用。本发明的还ー个目的在于提供用所述的标记或引物在鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系中的应用。在本发明ー个优选的实施方案中，用所述的SSR引物扩增待测棉花样本的基因组DNA，筛选出与恢复系具有相同特异性条带或带型的棉花样本；用上述SSR标记的引物扩增步骤I)筛选出的具特异性条带的棉花样本的基因组DNA，能扩增出与恢复系具有相同特异性条带的即为含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系材料。本发明采用SSR标记对含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系材料进行了分子水平的多态性检测，从本研究的结果中可以看出，两标记鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠，因此该方法非常适用于含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系材料真实性的室内鉴定和新恢复系材料的分子标记辅助选育。本发明与现有技术相比，有益效果为I)速度快SSR标记鉴定对辅助选育哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系选育和保证恢复系种子纯度具有重要作用。棉花三系杂交种制种过程中，如果发生恢复系混杂将在杂交后代中产生不育棉株，从而对棉花产量造成重大影响，并严重影响棉农受益。此外，常规恢复系的选育过程涉及大量的测交等试验，并且需要调查大量的外部性状，需要投入大量的时间、人力和物力，且易受环境因素影响，因此，常规手段并不能完全准确、真实地反映恢复系的遗传情況。本发明只需提供棉花材料的种子或叶片，提取DNA后，用SSR引物对进行分子标记鉴定，利用相应分子鉴定体系可以很快地鉴定出恢复系种子的真实性，同时利用本发明可以在恢复系分子标记辅助选择过程中可以有效跟踪恢复基因的存在与否并通过共显性带型能很快鉴定恢复基因位点是否纯合，从而极大加快恢复系选育和改良过程。2)准确率高SSR标记具有简单、稳定可靠、重复性好等优点，很容易通过PCR快速扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本发明利用两对SSR引物对恢复系进行鉴定，増加了鉴定的可靠性，且分子鉴定不受环境因素的影响，真正从DNA水平上鉴定恢复系的遗传情況，提高了准确性。3)实用简单本发明鉴定哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系真实性和分子标记辅助选择育种的整个程序只是几次机械式的加样过程，易于操作，具有很好的商业化应用前景。 总之，本发明提供的SSR标记及其引物能够快速鉴定哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系，其鉴定方法简单实用，其鉴定结果准确可靠，所以本发明提供的SSR标记及其引物能够快速有效的辅助棉花育种，对推动育种进程起了决定性的作用。
图I为本发明棉花细胞质雄性不育恢复系和其它常规亲本SSR分析。其中，M marker, 1-6分别为恢复系中恢46，恢复系中恢80，常规棉品种中棉所12、中棉所41、中棉所45和中棉所69。其中两个恢复系亲本以marker为标准的250bp(A，以C0T010引物对(SEQID No. I和2)进行扩增)和370bp (B,以CGR5340引物对(SEQ ID No. 3和4)进行扩增)位置能检测到与恢复系相关的特异性条带(图中箭头所示位置)。图2为本发明以C0T010引物对对140份种子DNA进行扩增的結果。其中，图2A，1-50，中恢 46 ;图 2B, 51-100,中恢 80 ;图 2C，101-110，中棉所 12 ;图 2C，111-120，中棉所41 ;图 2C，121-130，中棉所 45 ;图 2C，131-140，中棉所 69。图3为本发明以CGR5340引物对对140份种子DNA进行扩增的結果。其中，图3A，1-50，中恢 46 ;图 3B, 51-100,中恢 80 ;图 3C，101-110，中棉所 12 ;图 3C，111-120，中棉所41 ;图 3C，121-130，中棉所 45 ;图 3C，131-140，中棉所 69。图4为本发明以CGR5340引物对对自交群体50粒种子的分析結果。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式
作进ー步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I哈克尼西棉不育胞质棉花恢复系的分子鉴定方法2. IDNA 提取含哈克尼西棉不育胞质的恢复系中恢46(保藏号CGMCC5166)和中恢80(保藏号CGMCC5167)、常规棉品种中棉所12、中棉所41、中棉所45和中棉所69共6个材料的去壳，每粒种子单独粉碎后转入2ml的离心管中；加入1000 μ IDNA提取液(O. 05Μ Tris-Cl,O. 01MEDTA,2% SDS, I % PVP，O. 5 % 山梨醇，O. 705M NaCl，调整 pH 值为 8. O,高压灭菌；使用前加入1% β -巯基こ醇，体系中的1^代表体积比)，漩涡混匀后，65°C水浴30min，间隔IOmin左右轻摇下；水浴結束后，加入800 μ I苯酚氯仿异戊醇(体积比25 : 24 : I)，上下颠倒混勻至不分层(动作轻缓时间充分)，12000rpm离心IOmin ;吸取上清液(约800 μ I)转移到另ー 2ml离心管中，加入2 μ IRNase酶(10mg/ml)，混匀后37°C水浴30min ；取出后加入1000 μ I的苯酚氯仿异戊醇(体积比25 24 I)，上下颠倒混匀至不分层(动作轻缓时间充分)，12000rpm离心IOmin ;用剪ロ枪头吸取上清液转移(约700 μ I)到另ー 2ml离心管中，加入O. 7倍体积(5001)异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出；用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70%乙醇的2ml硅化离心管中，浸泡两次，每次十分钟，无水乙醇浸泡过夜；倒掉乙醇，倒置管壁晾干后(约30min)，加入200 u IddH2O，温室溶解2h，测定浓度后稀释到25ng/iil，_20°C保存备用。2. 2SSR标记SSR :将上述 DNA 样品 I ii I 与 I PCR 反应液(10X PCR Bufferl. 0 y I，IOmM dNTPs 0. 2u l,25mM MgCL2O. 8 u I, IOmM SSR 引物对各 0. 5 y 1，2U/y I TaqDNA 聚合酶
0.2u I, ddH20 5. 8 u I)混合，进行 PCR 反应95°C 预变性 2min，94°C 变性 30sec，55°C 退火 45sec，72°C延伸 45sec，30 个循环；72°C延伸 10min，4°C保存。扩增结束后，在扩增产物中加入2 U I溴酚蓝混匀，加样与6%的聚丙烯酰胺凝胶中，在IXTBE的电泳缓冲液中电泳检测，电泳电压为220伏，电流164毫安，时间50分钟。电泳结束后采用银染的方法进行染色，具体步骤如下固定液(95%乙醇40ml+100% 乙酸2ml+358ml蒸馏水)中固定10分钟；染色液(0. 6g硝酸银+300ml蒸馏水)中染色12 分；用蒸懼水快速洗两遍，在显色液(6g氢氧化钠+5ml甲醒+3ml 0. 2%硫代硫酸钠(最后力口)+400ml蒸馏水)中显色约5分钟，直至条带清晰为止；蒸馏水速洗两遍，放入终止液(3g 碳酸钠+400ml蒸馏水)中终止反应。结果如图I所示。2个恢复系亲本和4个常规棉品种分别以C0T010引物对(SEQ ID No. I和2)和以CGR5340引物对(SEQ ID No. 3和4)进行扩增，两对引物分别在250bp (C0T010)和370bp (CGR5340)位置有特征带，其他不含恢复基因的材料不能扩增得到相应特征带。实施例2恢复系种子纯度鉴定利用筛选出的SSR引物对含哈克尼西棉不育胞质的恢复系中恢46和中恢80各 100粒种子纯度进彳丁鉴定，以常规棉品种中棉所12、中棉所41、中棉所45和中棉所69各10 粒种子作为对照。分别以C0T010引物对(SEQ ID No. I和2)和CGR5340引物对(SEQ ID No. 3和4)对140份种子DNA进行扩增，其中COTO10弓丨物对能在以marker为标准的250bp位置处检测到恢复系的特异性条带(图2A，1-50，中恢46 ;图2B，51-100，中恢80)，不含恢复基因的中棉所12 (图2C，101-110)、中棉所41 (图2C，111-120)、中棉所45 (图2C，121-130) 和中棉所69 (图2C，131-140)亲本材料在250bp位置处不能检测到相应特征带。CGR5340 引物对能在以marker为标准的370bp位置处检测到恢复系的特异性条带(图3A，1-50,中恢46 ;图3B，51-100，中恢80)，不含恢复基因的中棉所12(图3C，101-110)、中棉所41 (图 3C, 111-120)、中棉所 45 (图 3C, 121-130)和中棉所 69 (图 3C, 131-140)亲本材料在 370bp 位置处不能检测到相应特征带实施例3恢复系选育分子鉴定 为了达到改良恢复系的目的，以含哈克尼西棉不育胞质恢复基因的恢复系中恢46 为父本与具有优异性状的亲本材料P5 (中棉所52母本)杂交，然后以P5作为回交亲本进行目标性状的改良(P5X中恢46) XP5)，并最终通过自交获得恢复基因位点纯合的改良恢复系。在这一过程中，为确保恢复基因不会丢失，从回交世代开始都需要与不育系进行测交， 从而需要耗费大量的人力和物力。在恢复系改良过程中，利用筛选出的SSR引物对含哈克尼西棉不育胞质恢复基因的中恢46转育群体材料((P5X中恢46) XP5)进行分子鉴定。从回交群体中选择以C0T010 引物对(SEQ ID No. I和2)能在以marker为标准的250bp位置处检测到恢复系的特异性条带和CGR5340引物对能(SEQ ID No. 3和4)在以marker为标准的370bp位置处检测到恢复系的特异性条带的单株，淘汰没有目标条带的单株。回交4代以上，然后选择具有特异性条带的单株自交，利用CGR5340引物对对自交群体50粒种子的分析，共得到3种不同带型的单株(图4)。其中恢复基因位点纯合单株在以marker为标准的370bp位置处检测到恢复系的特异性条带等共4个条帯，恢复基因位点杂合单株在以marker为标准的370bp位置处检测到恢复系的特异性条带等共5个条帯，不含恢复基因的单株在在以marker为标准的370bp位置处不能检测到恢复系的特异性条带。为了验证标记选择的效果，对自交群体中分子标记检测到的3种单株类型，分别选取了 10个恢复基因纯合单株、5个恢复基因杂合单株和5个不含恢复基因的单株与不育系进行了测交，其中恢复基因纯合单株共得到测交后代302株，恢复基因杂合单株共得到测交后代148株，不含恢复基因的单株共得到测交后代152株。测交后代育性调查结果表明，恢复基因纯合单株的302株测交后代中，有2株不育株(其产生的原因可能是棉花为常异花授粉植物，因此，在测交过程中可能发生不含恢复基因的花粉窜粉等现象)；在148株恢复基因杂合单株的测交后代中有78株可育株，70株不育株，符合I : I的分离比例；而不含恢复基因的单株的152株测交后代全部不育。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作ー些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围
权利要求
1.用于鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系的SSR标记的引物，其为核苷酸序列如SEQ ID No. I和2所示的引物和/或SEQ ID No. 3和4所示的引物。
2.用于鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系的SSR标记，其为用SEQID No. I和2所示的引物扩增出的250bp处的特异性条带和/或SEQ ID No. 3和4所示的引物扩增出的370bp处的特异性条带。
3.权利要求I所述的引物或权利要求2所述的标记在鉴定棉花恢复系纯度或新恢复系选育中的应用。
4.权利要求I所述的引物或权利要求2所述的标记在鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系中的应用。
5.一种鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系的方法，其包括 1)用权利要求I所述的引物扩增待测棉花样本的基因组DNA，筛选出与恢复系具有相同特异性条带的棉花样本； 2)用权利要求2所述的SSR标记的引物扩增步骤I)筛选出的具特异性条带的棉花样本的基因组DNA，能扩增出与恢复系具有相同特异性条带的即为含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系材料。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及棉花恢复系纯度的分子鉴定方法，具体提供了用于鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系的SSR标记的引物，其为核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示的引物和/或SEQ ID No.3和4所示的引物。本发明采用SSR标记对含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系材料进行了分子水平的多态性检测。该方法鉴定速度快、准确率高、操作简单，非常适用于棉花恢复系的室内鉴定和分子标记辅助选择育种。
文档编号C12Q1/68GK102618647SQ20121009277
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者吴建勇, 戚廷香, 邢朝柱, 郭立平 申请人:中国农业科学院棉花研究所