一种转移柑橘胞质雄性不育性状的方法

专利名称：：一种转移柑橘胞质雄性不育性状的方法
技术领域：
：本发明属于植物新品种选育
技术领域：
，具体涉及一种转移柑橘胞质雄性不育性、创造二倍体无核柑橘新品种的方法。
背景技术：
：柑橘是世界和我国南方最重要的果树，目前我国柑橘栽培面积、产量均居世界首位。附橘产业覆盖我国南方广大山区、库区，发挥着巨大的经济、社会和生态效益。我国柑橘产业在取得突出成绩的同时，也面临着一些问题。品种方面，我国柑橘品种可分为两类，一类是引进品种，这类品种在出口方面将面临着巨大的竞争压力；另一类为我国特色品种，我国是柑橘资源大国和起源中心，有很多特色品种，但唯一不足是多数品种果实有籽，影响其品质的进一步提高和出口竞争能力进一步提升。我国柑橘特色品种的无核化改良，几十年来，一直是柑橘育种者努力的主要方向和目标。柑橘育种实践表明，通过倍性育种，即培育三倍体可以达到无核。60年代，美国Soost等开始人工培育无核柑橘品种研究，通过二倍体与同源四倍体杂交，培育了'0roblanco'葡萄柚等三倍体无核品禾中(SoostRK，CaraeronJW,1980,0roblanco，atriploidpummelo—grapefruithybrid.HortSci，15:667-669)。但柑橘天然同源四倍体较少，人丄诱变也较为困难，而且同源四倍体往往育性较低，限制了该育种途径的广泛应用，而且这一途径耗时长，Soost等培育以上品种花了近20年的时间。上世纪八十年代以来，柑橘细胞融合技术的发展和应用为柑橘无核育种提供了新思路。1985年Ohgawara等]获得了柑橘属间体细胞杂种(0hgawaraTetal.1985,Somatichybridplantsobtainedbyprotoplast.fusionbetweenCitrussinensisandPoncirustrifoliata.TheorApplGenet71:1-4)。迄今世界上已获得200余个组合的种间、属间异源四倍体体细胞杂种(GrosserJTV&FGGmitterJr.,2005.Applicationofsomatichybridizationandcybridizationincropimprovement,withcitrusasamodel.InVitroCellDevBiolPlant41:220-225)。柑橘细胞融合一般采ffl"悬浮系原生质体+叶肉原生质体"的模式，利用柑橘叶肉原生质体在目前体系下单独培养或者共培养都不能分裂再生成株的特点，是一种半筛选体系。但部分融合组合中，再生植株除预期的异源四倍体体细胞杂种和悬浮系亲本再生类型外，还再生了叶片形态类似叶肉亲本的二倍体植株(邓秀新，郭文武，余桂红，2000，柑橘细胞融合再生9个组合一倍体叶肉亲本类型植株。园艺学报，27(1):1-5)。这类植株已在近40例融合组合中出现，而且绝大多数是种间融合组合。部分融合组合的叶肉亲本型植株经分子杂交、PCR—RFLP或SSR分析鉴定'表明其核DNA来自叶肉亲本，mtDNA来自悬浮系亲本，cpDNA随机遗传，即叶肉亲本型植株实际上是杂种起源的，为胞质杂禾中(Moriguchi等1996.GenotypesandparentalcombinationinfluenceefficiencyofcybridinductioninCitrusbyelectrofusion.HortSci31:275-278;郭文武，邓秀新'2000，柑橘胞质杂种及其胞质遗传重组。园艺学报'27(增刊):487-491;Cabasson等2001.Non-randorainheritanceofmitochondrialgenomesinCitrushybridsproducedbyprotoplastfusion.PlantCellRep20:604-609;GuoW等，2006，Molecularanalysisrevealedautotetr即loid，diploidandtetraploidcybridplantsregeneratedfromaninterspecificsomaticfusioninCitrus.ScientiaHorticulturae108:162-166)。柑橘细胞对称融合可以再生二倍体叶肉亲本型胞质杂种的现象以及其分子水平上的组成特征为有针对性地选配融合组合、转移由线粒体基因组控制的胞质雄性不育性状、从而改良多籽柑橘品种提供了很好的实验体系。即将不育品种的悬浮系原生质体与有籽品种的叶肉原生质体融合，再生出有籽品种的二倍体植株，但带有了无籽品种的雄性不育胞质基因，有望改良有籽品种，使其不育，从而生产出无籽果实，实现二倍体水平上的无籽。大量有性杂交研究表明，温州蜜柑的雄性不育性由核质基因互作引起，为细胞质雄性不育类型(CMS)(Yam咖oto等1997.AbortedanthersofCitrusresultfromgene-cytoplasmicalesterility.SciHortic70:9-14)。因此，有针对性地开展温州蜜柑与其它多籽柑橘类型间的融合研究，具有重要意义。若能获得二倍体叶肉亲本型胞质杂种，则可能实现其胞质雄性不育性状的有效转移，从而可能一步获得二倍体无核果实。在本发明做出以前，从未有人专门开展雄性不育温州蜜柑与其它多籽柑橘类型间的融合，以期培育二倍体无籽柑橘胞质杂种的研究
发明内容本发明的目的在于克服已有技术的不足，通过细胞对称融合，人工创造柑橘种间二倍体叶肉亲本型胞质杂种，在1年内实现胞质雄性不育性状的有效转移，将有核品种改良为无核品种，同时不改变原品种的其农艺性状。本发明是通过以下技术实现一种转移柑橘胞质雄性不育性状的方法，包括原生质体融合，胞质杂种培养，再生和倍性鉴定。本发明的技术方案是将雄性不育型的柑橘品种愈伤组织悬浮系原生质体与有核型柑橘品种的叶肉原生质体融合，通过再生，将雄性不育型悬浮系亲本的线粒体基因组转移到有核柑橘品种上，得到含雄性不育基因组的无核的二倍体柑橘叶肉品系。详细的技术方案如下所示1)双亲材料的选择以雄性不育温州蜜柑愈伤组织为亲本，取保存于MT固体基本培养基上的雄性不育的柑橘品种温州蜜柑胚性愈伤组织于液体悬浮培养基进行悬浮培养，以12-14天为1个继代培养周期，暗培养，温度为28。C左右，摇床转速控制在115rpin左右；继代培养3个周期后进行原生质体分离，以有核柑橘为叶肉亲本，将所述的温州蜜柑愈伤组织或有核柑橘叶肉分别用添加有缓冲液A或缓冲液B的酶液进行原生质体分离和纯化，得到原生质体；2)将步骤l)的原生质体用电融合法融合，得到融合产物；3)将步骤2)的融合产物离心，去掉上清，将沉淀转入BH3培养基，培养大约20-30天，当原生质体分裂形成多细胞团时及时降低培养基的渗透压至O.45M并扩大培养面，待细胞团长到直径为O.5-1.0cm时，转入胚状体诱导培养基上诱导培养，使其分化出球形胚或心形胚，及时将所述的球形胚或心形胚转移到胚状体增殖培养基上使其转绿和进一步发育成子叶形胚状体；选取子叶形胚状体转入生芽培养基诱导生芽，将获得的丛芽转入生根培养基诱导生根；将生根的杂种植株移栽入温室，得到胞质杂种材料；4)对步骤3)的胞质杂种材料，采用流式细胞仪进行倍性鉴定；以SSR和CAPS分子标记方法进行细胞核基因组和线粒体基因组分析；在本发明中步骤(1)所述的叶肉亲本选自沙田柚、冰糖橙，暗柳橙，红暗柳橙，杂种柚或日辉橘。培养基组成如下缓冲液A:MT基本培养基+0.7mol/L蔗糖+1500mg/LME，调pH至5.8;缓冲液B:MT基本培养基+0.6mol/L蔗糖+1500mg/LME,调pH至5.8;酶液0.6%纤维素酶R-10+0.6%离析酶R-IO+12.8%甘露醇+0.011%NaH2P04+0.12%MES+0.36%CaC12.2H20，调pH至5.8，酶液通过0.22um醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌；MT固体培养基MT基本培养基+40g/L蔗糖，调pH至5.8;;液体悬浮培养基MT基本培养基+500rag/LME+1.5g谷氨酰胺+40g/L蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8;BH3培养基配方(l升中含量)ME(酵母提取物)l.Og蔗糖51.34g甘露醇81.99g谷氨酰胺3.lgMgS047H200.37gK訓40.17gKC11.5gMT微量元素10mlMTCa+MTvit+MT铁盐各10ml水解酪蛋白0.25gYitStockA2.0mlVitStockB1.0mlKIStock1.0ml有机糖贮存液10ml有机酸贮存液10m椰子汁20ml定容到1000ml，pH5.8，过滤灭菌6#KIstock75nig/100ml#有机酸贮存液(mg/100ml)丙酮酸钠盐200柠檬酸400苹果酸400延胡索酸400弁有机糖贮存液(mg/100迈l)果糖2500核糖2500木糖2500甘露醇2500鼠李糖2500纤维二糖2500半乳糖2500甘露醇2500#VitstockAMg/100ml生物素1核黄素10叶酸20对氨基苹果酸1氯化胆碱50VC100Caloiumpantathenase50#VitStockBMg/100ml维生素(Vit)A1维生素(Vit)D31维生素(Vit)B122胚状体诱导培养基MT基本培养基+50g/L蔗糖+500mg/LME，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8;胚状体增殖培养基MT基本培养基+50g/L蔗糖+1500mg/LME'补充蒸馏水至1L,调pH至5.8;7生芽培养基MT基本培养基+0.5mg/LKT+0.5mg/LBA+0.1mg/LIM+30g/L蔗糖，补充蒸馏水至1L,调pH至5.8;生根培养基1/2MT基本培养基+0.5mg/LNM+0.1mg/LIBA+0.5g/L活性炭+20g/L蔗糖，补充蒸馏水至lL,调pH至5.8;更详尽的技术方案参见《具体实施方式》所述。本发明的积极效果是本发明的效果是通过细胞融合技术和现代分子生物学检测技术，人工创造了一批柑橘种间二倍体叶肉亲本型胞质杂种植株，这些植株含有相应悬浮系亲本的线粒体基因组，即含有胞质雄性不育基因。本发明对改良我国有籽柑橘品种具有积极的意义。与有性杂交转移温州蜜柑的胞质雄性不育性相比，本发明具有如下优点胞质杂种在l年内就可创造再生，效率大大提高。图l:是本发明的技术流程和植株再生情况，图中a.为愈伤原生质体b.为叶肉原生质体C.为电场诱导原生质体融合。d.为融合产物再生愈伤组织团；e.为再生的胞质杂种胚状体；f.为胚状体诱导再生芽；g.再生芽诱导生根h.完整再生苗移栽；Bars=1cm(1-4)图2:采用流式细胞仪用于再生原生质体杂种进行倍性测定图中A.为二倍体对照B.为再生产物图3图中a为温州蜜柑(国庆l号)+沙田柚再生植株细胞核基因组的SSR分析；图中b为温州蜜柑(国庆l号)+冰糖橙再生植株细胞核基因组的SSR分析(a，b:引物为TAA15);图中c为温州蜜柑(国庆l号)+沙田柚再生植株的mtDNA来源分析；图中d为温州蜜柑(国庆l号)+冰糖橙国庆1号+沙田柚再生植株的mtDNA来源分析。具体实施例方式实施例l1、双亲材料的准备柑橘胚性悬浮系建立挑出保存于MT固体培养基(培养基成分参考《
发明内容》)上生长旺盛、颗粒细小、颜色淡黄及组织疏松的温州蜜柑胚性愈伤组织于液体悬浮培养基上培养(MT基本培养基+500mg/LME(Maltextract)+1.5g谷氨酰胺+40g/L蔗糖，ph为5.8)中进行液体悬浮培养。继代周期为12-14d，培养条件为暗培养，温度控制在28'C左右，摇床转速控制在115rpra左右。继代3次后用于亲本原生质体分离。叶肉亲本制备取表1所述有核柑橘品种成熟种子，先用WNaOH浸泡5-10rain,中间用玻璃棒搅拌多次以除去果胶洗净NaOH后，经l-3呢NaC10表面消毒10min，无菌蒸馏水清洗3-5次，去种皮，接种于MT基本培养基(含30g/L蔗糖和7.5克琼脂，ph为5.8)，播种后25天左右取充分展开的叶片分离原生质体。每年的5-11月份均可采集温室植株新鲜、完全展开及颜色浓绿的叶片用于叶肉原生质体分离。分离原生质体前，先将叶片在自来水下冲洗15-30min以除去表面污垢，然后用1%NaC10表面消毒15min,无菌蒸馏水洗净后存放于4'C冰箱中备用。表l有核柑-瞎叶肉亲本及其来源<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、柑橘原生质体的分离与纯化柑橘亲本原生质体分离参见郭文武等报道的方法(郭文武，邓秀新，史永忠.柑橘细胞电融合参数选择及种间体细胞杂种植株再生.植物学报，1998,40(4):417-424)。具体方法是(1)温州蜜柑愈伤组织原生质体的酶解在温州蜜柑愈伤悬浮系继代的4-7天内，用长吸管吸取约lg愈伤组织于60mmX15mm小培养皿中，将此培养皿中的液体悬浮培养基吸干后，加入1.5mL左右的缓冲液A(MT基本培养基+0.7mol/L蔗糖+1500mg/L酵母提取物(ME),ph5.8)，再加入等体积的酶液(0.6%纤维素酶R-10+0.6%离析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011%NaH2P04+0.12%2,(N-吗啡啉)-乙基磺酸(MES)+0.36%CaCl22H20，调pH为5.8，酶液通过0.22Mm醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌)，培养皿用Parifilm封口后在暗培养箱中静置酶解16-20h.。叶肉原生质体的酶解取MT培养基上充分展开或采于温室的灭过菌的有核柑橘品种叶片，用无菌手术刀片将叶片切成1-2mm的条状，然后放入预先加入了1.5mL左右的缓冲液B(MT基本培养基+0.6mol/L蔗糖+1500mg/LME,ph5.8)培养基的60mmX15mm培养皿中，最后加入等体积的酶液(酶解试管苗和温室叶片所用酶液分别包括0.75%纤维素酶R-10+0.75%离析酶R-10和1%纤维素酶R-10+1%离析酶R-IO，其它组分及浓度与酶解愈伤组织原生质体所用酶液相同)，最后操作同于酶解愈伤组织原生质体。酶解完成后的原生质体通过孔径为45Wn的不锈钢筛网过滤，以除去残留材料和大细胞团，然后用CPW13(配方见表2)洗涤筛网以充分收集原生质体；将滤液倒入10mL的离心管中离心7-8min，弃上清液，将沉淀物与1.0mL的CPW13混匀，然后将此混合液用吸管轻轻地转移到预先加入了3mLCPW26(配方见表2)的10mL离心管中，经CPW13/CPW26界面密度梯度离心纯化2-3min后，用吸管将两液面间的原生质体带吸出，用电融合液离心洗涤1-2次，每次6-8min。纯化后的原生质体悬浮于电融合液(0.7mol/L甘露醇+0.25mmol/LCaCl2)中，用血球计数板将愈伤组织原生质体密度调整为1X1()6个/niL左右，叶肉原生质体调整到2XK)6个AnL左右。表2CPW盐配方<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>MgS042.5gKI0.002gCuS04_0.00003g_CPW13(100ml):CPffstockI1ml+CPWstockII1ml+13g甘露醇CPW26(100ml):CPWstockI1ml+CPWstockII1ml+26g蔗糖3、原生质体融合采用日本岛津公司SSH-2型(ShimadzuSomaticHybridizer-2，Japan)融合仪，融合小池为FTC-04(1.6mL,4:腿)，融合室为FTC-04(容积为1.6mL，电极距离为0.4cm)。柑橘亲本原生质体融合方法参见郭文武等报道的方法(郭文武，邓秀新，史永忠.柑橘细胞电融合参数选择及种间体细胞杂种植株再生.植物学报，1998,40(4):417-424)。具体方法是融合前先用无菌吸管吸取一定量的电融合液于融合小池环形槽中，洗錄1-2次，以防原生质体集聚于电极两侧的角落里。然后将调整了密度的双亲原生质体等体积混合，用长吸管吸取1.6mL原生质体混合液于环形槽中，轻轻晃动融合小池使混合液均匀分布于环形槽。槽中央加几滴融合液用于保湿，用Parifilm封口后静置5-10min。待大量原生质体处于同一平面后开始融合，融合参数为AC100V/cm,AC作用时间60s;DC1250V/cm，DC印加时间40-45Hs;脉冲间隔0.5s，脉冲5次。融合后静置15-20min,以利于融合子的圆球化。最后轻轻吸出融合产物于10mL离心管，用HB3培养基离心洗涤1-2次，原生质体沉淀用朋3液体培养基(具体配方参见文献GrosserJW,GmitterFGJr.Protoplastfusionandcitrusimprovement.PlantBreedingRev,1990,8:339-374)悬浮。4、融合产物培养本试验采用在BH3培养基中进行液体浅层培养法。具体方法为轻轻吸出融合产物于10ml离心管中离心5-6钟，原生质体培养采用液体浅层培养或固体包埋培养法。原生质体培养在暗培养箱中进行，3-10天后原生质体再生细胞壁，并开始第一次产分裂。等原生质体分裂形成多细胞团时(大约20-30天)，开始降低培养基的渗透压，具体1)各加入5-10滴0.6MBH3和0.3MEME培养基，降压至0.45M;2)7-15天后再各加入5-IO滴O.6M朋3和0.3MBH3培养基，降压至O.3M;3)此后要及时稀释，降低细胞团浓度，以利于胚状体的发生，等细胞团长到一定大小时，转入到胚状体诱导培养基上诱导胚状体的发生；4)细胞团长出球形胚、心形胚时，及时转入到胚状体增殖培养基培养基上以利于胚状体的进一步发育和转绿；5)将发育到子叶胚期的胚状体转入生芽培养基(MT基本培养基+0.5mg/L细胞分裂素(KT)+0.5mg/L硫酸腺嘌呤(BA)+0.1mg/L吲哚乙酸(IAA)+30g/L蔗糖，ph5.8)诱导生芽；6)将获得的丛芽转入生根培养基(1/2MT基本培养基+0.5mg/L萘乙酸(NAA)+0.1rag/L吲哚丁酸(IBA)+0.5§几活性炭+208几蔗糖，ph5.8)诱导生根或进行试管嫁接，具体方法参见文献(伊华林.试管嫁接提高柑桔三倍体组培苗成苗率试验.中国果树，2000(4):2829)将再生苗移植于温室中。5、胞质杂种的鉴定l)倍性分析:倍性分析由德国Partec公司生产的流式细胞仪完成。操作程序参照Guo等(GuoWW,ChengYJ'ChenCL,DengXX(2006)Molecular腿lysisrevealedautotetr即loid，diploidandtetraploidcybridplantsregeneratedfromaninterspecificsomaticfusioninC/tr"s.ScientiaHorticulturae10108:162-166);2006)报道的方法，本发明略有修改，具体是将新鲜少量的原生质体杂种叶片或0.05g温州蜜柑愈伤组织置于一个干净的55mm塑料培养皿中，加入400HL细胞裂解液(购置PartecHR-A公司)，用刀片切碎后放置30s，接着通过含有30Wn微孔滤膜的过滤器(购自Partec公司，货号:Celltrics)将样品过滤到测试管，加入1.0mLDNA染色液Partec服-B(购自Partec公司)，染色30-60秒后，上样于Partec倍性分析仪，测定样品单个细胞核的DNA总量。DNA含量的分布曲线由倍性分析仪自动生成。2)原生质体胞质杂种分子标记鉴定具体方法参见文献(CaiXD，FuJ，DengXX，Guo冊.ProductionandmolecularcharacterizationofpotentialseedlesscybridplantsbetweenpollensterileSatsu腿隱darinandtwoseedyCitruscultivars.PlantCellTissOrg,2007,90:275-283)。分另ij应用SSR、CAPS和cpSSR等分于标记对获得的原生质体杂种核基因组、线粒体基因组进行分析。总DNA制备总DNA提取及检测所有样品均采用CTAB法微量提取DNA,具体方法参见《分子克隆试验指南》(第三版)。CTAB提取缓冲液的组成为:0.1mol/LTris-HCl(pH8.0);1.5mol/LNaCl;0.05mol/LEDTA(pH8.0);1%PVP;2.0%CTAB;1.O呢的巯基乙醇。(1)取O.15g左右幼嫩叶片、愈伤组织或胚状体，置于1.5mL离心管底；(2)用镊子夹住离心管置于液氮中15s后，用事先灭过菌的尖头玻璃棒将材料戳到管底，先压后碾磨；(3)碾碎后加入600uL预热到65"C的CTAB提取液，再继续碾磨片刻使其悬浮均匀；(4)在65'C水浴锅中温浴60-90min，每隔30min取出上下轻轻颠倒几次；(5)水浴之后，加入700uL氯仿异戊醇(体积比为24:1)，上下颠倒晃动10min以上，台式离心机10000-12000rpm离心8min;(6)将上清液转至另一1.5mL离心管，重复步骤5)—次；(7)吸取上层液至另一1.5mL离心管，加入60"L5mol/LNaCl和1inL预冷冻的无水乙醇，轻轻颠倒15次，混合均匀后置于-2(TC冰冻30min或过夜沆淀DNA;(8)在8000-10000rpm离心5min，使DNA紧贴在管底上；(9)弃酒精后加入lmL70%酒精，浸泡2h后换一次酒精，然后浸泡过夜；(10)弃去酒精，在超净工作台上风干后加50uL1XTE充分溶解，然后每管加5uL5mg/mLRnase，37'C水浴6h或过夜。DNA检测采用UV-1601型紫外分光光度计测定DNA原液浓度及样品DNA质量，取DNA原液5uL，用超纯水稀释到3.0ml，测定280nm、260nra及230nm的吸光值，按公式DNA浓度(ng/u1)=30000X0D260计算DNA原液浓度，此外OD260/0D280的比值在1.7-2.0的范围认为DNA样品纯度较高，而0D260/0D230大于2.0则认为样品DNA含盐类少；用1XTAE作为缓冲液，将3-5uLDNA样品在0.8%琼脂糖凝胶上稳压2V/cm电泳30min进行质量检测，如果有明显的主带，没有拖尾现象，则DNA可用于以后的实验。将DNA样品稀释至25ng/uL，贮存于-2(TC冰箱中备用。原生质体杂种核基因组分析原生质体杂种核基因组的SSR分析按照Cheng等(2003)的方法进行(ChengYJ,GuoWW,DengXX.MolecularcharacterizationofcytoplasmicandnucleargenomesinphenotypicallyabnormalValenciaorange(Citrussinensis)+Meiwakumquat(Fortunellacrassifolia)irvterge匿icsomatic,hybrids.PlantCellR印，2003,21:445-451),并做适当修改。本实施例中所用的SSR引物参见表5，该引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR扩增采用20uL反应体系，包括100ng总DNA，1.5咖ol/LMgC12，0.2mmol/LdNTP，1.0UTaqDNA聚合酶(试剂盒由Promega公司生产)，0.1nmol/L正向引物，0.1umol/L反向引物，1Xbuffer及灭菌超纯水(表5)，扩增前每小管中加一滴矿物油。PCR扩增程序如下94。C变性5iiiin;接着是32个循环94'C，1min，55'C，30s，72°C,1miri;最后72'C延伸4min，4'C保存。扩增反应结束后，取4uLPCR扩增产物在O.8%琼脂糖胶上检测扩增效果，如果产物为一条横跨溴酚兰的Smear，则可以进行下一步实验。1)扩增产物92-95'C变性3-5min后，在6%(W/V)聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶)上电泳1.5-2h，变性胶显色参照Promega公司的产品说明书进行银染；2)或者在1XTAE缓冲液中，扩增产物在3%MetaPhore琼脂糖胶上稳压2V/cm电泳l.5-2h，随后在UV下观察并拍照。具体操作方法参照MetaPhore琼脂糖胶参照说明书。_表31XTAE缓冲液的配制(1L):_Tris-HCl4.084gEDTA-Na2.H200.744g冰醋酸1.142ml加水定容到1L，调ph为8.5表4本发明应用的柑橘原生质体核基因组SSK引物的序列引物代号引物序列参考文献LocuscodePri鹏rsequenceReferenceTAA15,GACAACATCMCAACAGCMGAGC3'Kijas等，19975'MGMGMGAGCCCCCATTAGC3'TM155'G嵐GGGTTACTTGACCAGGC3，Kijas等，19975'CTTCCCAGCTGCCACMGC3'TM275'GGATGAMMTGCTCAAAATG3，Kijas等，19975'TAGTACCCACAGGGMGAGAGC3'TM335'GGTACTGATAGTACTGCGGCG3，Kijas等，19975'GCTAATCGCTACGTCTTGGC3'TM415'AGGTCTACATTGGCATTGTC3'Kijas等，19975'ACATGCAGTGCTATMTGMTG3'TM455'GCACCTTTTATACCTGACTCGG3'Kijas等，19975'TTCAGCATTTGAGTTGGTTACG3'具体文献为(KijasJMH，ThomasMR,FowlerJCS,RooseML.Integrationoftrinucleotidemicrosatellitesintoalinkagemapofcitrus.7ear粉/fe威，1997'94:701-706)表5SSR反应体系成分Gomponent工作液浓度Workconcentration体积/管(Hi)Volume/tube模板DNA20ngM4Buffer10X2.0藩P2咖ol/L2.0MgCl225mmol/L1.2Taq酶5,0.2正向引物10Wnol/L0.2反向引物10(%ol/L0.2ddH2010.2总体积20胞质基因组分析胞质基因组分析采用CAPS标记分析杂种线粒体DNA的遗传方式，操作程序参照Cheng等(2003)的方法(ChengY丄GuoWW,DengXX.MolecularcharacterizationofcytoplasmicandnucleargenomesinphenotypicallyabnormalValenciaorange(Citrussinensis)+Meiwakumquat(Fortimellacrassifolia)intergenericsomatichybrids.PlantCellR印，2003，21:445-451),并适当修改釆用3个线粒体基因组通用引物对(表6)对总DNA进行PCR扩增，PCR反应在PTC-200Thermocycler(USA)中进行。反应体系为25uL:模板DNA100ng,0.2mmol/LdNTP,2鹏ol/LMgC12'1Xbuffer，1.0UTaqDNA聚合酶(Promega),正反向引物各O.2Umol/L以灭菌的超纯水(表7)。扩增程序为94'C变性3min;接着94。C变性1min,55。C退火40s，72'C延伸2min，32个循环；最后72。C延伸10min，4'C保存。取4nL扩增产物在O.8%的琼脂糖凝胶上检测后，将扩增产物进行酶切，20uL酶切体系为扩增产物8uL，10U/uL内切酶0.5uL，buffer2uL，灭菌双蒸水9.5uL。37。C水浴3-4h后，在2.0%琼脂糖胶(含0.5ug/mLEB)中2.5V/cm电泳l-1.5h，在紫外灯下观察并拍照。表6线粒体基因组通用引物的序列和来源引物l引物2参考文献Primer1Primer2Referencenad1exonB(mt)nad1exonC(mt)D柳ssurs等，5'-GCATTACGATCTGCAGCTCA-3'5'-GGAGCTCGATTAGTTTCTGC-3'199518Sr腿(mt)5SrRNA(mt)Al-Janabi等，5,-GTGTTGCTGAGACATGCGCC-3'5'-ATATGGCGCAAGACGATTCC-3'簡nad4exonl'(mt)nad4exon2(mt)D6I116SUr6等，5'-CAGTGGGTTGGTCTGGTATG-3'5'-TCATATGGGCTACTGAGGAG-3'簡具体文献为(A1-JanabiSM，McclellandM，PetersenC，SobralBWS.PhylogeneticanalysisoforganellarDNAsequences'intheAndropogoneae:Saccharinea.TheoApplGenet，1994，88:933-944;DemesureB，SodizN，PetitRJ".AsetofuniversalprimersforamplificationofpolymorphicnoncodingregionsofmitochondrialandcpDMinplants.MolecEcol，1995,4:129-131)表7CAPS反应体系成分Component工作液浓度Workconcentration体积/管(W)Volume/tube模板DNA25ngM4Buffer10X2.5d鮮2mmol/L2.5MgCl225mmol/L1.5Taq酶5,0.2正向引物10Wnol/L0.2反向引物10Wnol/L0.2ddH2013.9总体积25表8本发明获得的无核柑橘二倍体叶肉亲本型胞质杂种融合组合(学名)育成年份温州蜜柑(国庆l号)+杂种柚(Satsumamandarin+Hybridpummelo)2004温州蜜柑(国庆1号)+日辉橘(Satsumamandarin+Sunbursttangerine)2004温州蜜柑(国庆l号)+李橘(Satsumamandarin+Leetangerine)2004温州蜜柑(国庆l号)+沙田柚(Satsumamandarin+Shatianpummelo)2007温州蜜柑(国庆1号)+冰糖橙(Satsumamandarin+Bingtangorange)2007温州蜜柑(国庆1号)+佩奇橘柚(Satsumamandarin+Pagetangelo)2008温州蜜柑(国庆1号)+红暗柳橙(Satsumamandarin+redAnliuorange)2008与已有技术相比，本发明优点如下1)与非对称方法相比，方法简单、易再生；2)与有性杂交相比，胞质杂种在1年内可创造再生，效率大大提高。1权利要求1、一种转移柑橘胞质雄性不育性状的方法，包括原生质体融合，胞质杂种培养，再生和倍性鉴定，其特征在于，将雄性不育型的柑橘品种愈伤组织悬浮系原生质体与有核型柑橘品种的叶肉原生质体融合，通过再生，将雄性不育型悬浮系亲本的线粒体基因组转移到有核柑橘品种上，得到雄性不育二倍体叶肉品系。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于如下步骤-1)双亲材料的选择以雄性不育温州蜜柑愈伤组织为亲本，取保存于MT固体基本培养基上的雄性不育的柑橘品种温州蜜柑胚性愈伤组织于液体悬浮培养基进行悬浮培养，以12-14天为l个继代培养周期，暗培养，温度为28i:左右，摇床转速控制在115rpm左右；继代培养3个周期后进行原生质体分离，以有核柑橘为叶肉亲本，将所述的温州蜜柑愈伤组织或有核柑橘叶肉分别用添加有缓冲液A或缓冲液B的酶液进行原生质体分离和纯化，得到原生质体；2)将步骤l)的原生质体用电融合法融合，得到融合产物；3)将步骤2)的融合产物离心，去掉上清，将沉淀转入BH3培养基，培养大约20-30天，当原生质体分裂形成多细胞团时及时降低培养基的渗透压至0.45M并扩大培养面，待细胞团长到直径为0.5-1.0cm时，转入胚状体诱导培养基上诱导培养，使其分化出球形胚或心形胚，及时将所述的球形胚或心形胚转移到胚状体增殖培养基上使其转绿和进一步发育成子叶形胚状体；选取子叶形胚状体转入生芽培养基诱导生芽，将获得的丛芽转入生根培养基诱导生根；将生根的杂种植株移栽入温室，得到胞质杂种材料；4)对步骤3)的胞质杂种材料，采用流式细胞仪进行倍性鉴定；以SSR和CAPS分子标记方法进行细胞核基因组和线粒体基因组分析；其中缓冲液A:MT基本培养基+0.711101^蔗糖+1500mg/LME，渗透调节剂0.7mol/LEME，调pH至5.8;缓冲液B:MT基本培养基+0.611101/1>蔗糖+1500mg/LME,渗透调节剂0.6mol/LEME，调pH至5.8;酶液0.6%纤维素酶R-10+0.6%离析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011%NaH2P04+0.12%MES+0.36%CaC12.2H20，调pH至5.6，酶液通过0.22ym醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌；MT固体培养基MT基本培养基+40g/L蔗糖，调pH至5.8;液体悬浮培养基MT基本培养基+500mg/LME+1.5g谷氨酰胺+40g/L蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8;胚状体诱导培养基MT基本培养基+50§化蔗糖+500mg/LME，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8;胚状体增殖培养基MT基本培养基+50§1蔗糖+1500mg/LME，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8;生芽培养基MT基本培养基+0.5mg/LKT+0.5mg/LBA+0.1mg/LIAA十30g/L蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8;生根培养基1/2MT基本培养基+0.5mg/LNAA+0.1mg/LIBA+0.5g/L活性炭+20g/L蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8;3、根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所述的叶肉亲本选自沙田柚、冰糖橙，暗柳橙，红暗柳橙，杂种柚或日辉橘。全文摘要本发明属于植物新品种选育
技术领域：
，具体涉及一种转移柑橘胞质雄性不育性状的方法。其特征在于，根据柑橘细胞对称融合可以再生二倍体叶肉亲本型胞质杂种的现象及其分子水平上的组成特征，提出了通过融合组合选配、经培养获得胞质杂种、转移由线粒体基因组控制的胞质雄性不育性状、从而改良二倍体有核或多核柑橘品种。发明了胞质雄性不育温州蜜柑与中国特色有核或多核柑橘类型之间的对称融合，成功地创造了一批二倍体胞质杂种，实现了温州蜜柑线粒体基因组的有效转移，为二倍体无核柑橘选育提供了新方法及新种质材料。文档编号C12N15/05GK101475933SQ20081023743公开日2009年7月8日申请日期2008年12月26日优先权日2008年12月26日发明者婧付,程运江,蔡小东,邓秀新,郭文武申请人:华中农业大学