专利名称：具有cmv启动子的可表达egfp的重组杆状病毒的构建方法
技术领域：
本发明涉及可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。
背景技术：
随着分子生物学技术和方法的发展及应用，杆状病毒已被开发成为高效的真核表达载体系统，用于各种外源基因的表达，并作为一种新型的疫苗、基因治疗载体受到人们的高度重视。目前筛选重组杆状病毒的方法有很多，诸如酵母-昆虫细胞、大肠杆菌-昆虫细胞的穿梭载体的开发、杆状病毒DNA线性化和体外定点酶促重组等。但是这些方法的重组效率较低、重组病毒筛选的周期较长、很难同时分离多个重组杆状病毒、基因表达的效率也很低。
发明内容
本发明的目的是提供具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，按以下步骤进行一、用限制性内切酶Nru I和BstZ17I对质粒pcDNA3. I (-)进行双酶切；二、用限制性内切酶SnaB I和Hpa I对质粒pFastBacl进行双酶切；三、将双酶切后的质粒pcDNA3. I (-)和质粒pFastBacl进行平末端连接，连接产物经鉴定后获得重组转移载体pFastBacl-pcDNA3. 1(-)；四、以pEGFP-C3为模板，pEGFP_u和pEGFP_d为弓丨物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后于T-Vector进行连接，获得pMD-EGFP ；五、用KpnI 和 Xho I 对重组转移载体 pFastBacl_pcDNA3. I (-)和 pMD-EGFP 分别进行双酶切，分别回收pFaStBacl-pcDNA3. I㈠重组转移载体和EGFP基因的目的条带，并分别进行纯化，然后纯化产物pFastBacl-pcDNA3. I (-)与纯化产物EGFP进行连接，获得pFastBacl-pcDNA3. 1(-)-EGFP ；六、pFastBacl-pcDNA3. I (-) -EGFP转化DHlOBac细胞并筛选白色单菌落，然后提取重组Bacmid DNA，然后以IOOng重组Bacmid DNA为模板，以pEGFP-u和pEGFP-d为引物进行PCR扩增，将含有EGFP基因的重组Bacmid命名重组Bacmid-EGFP ；七、利用脂质体介导转染法将重组Bacmid-EGFP转染sf9细胞，获得重组杆状病毒CN-EGFP,即完成具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建；其中步骤四和步骤六中引物pEGFP-u序列均为5' -CTACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3';引物 pEGFP-d 序列均为 5' -AGCGGTACCTCAATCTGAGTACTTGTACAGC-3;。本发明首次利用杆状病毒表达载体系统在OL细胞中导入并表达外源基因，拓宽了杆状病毒可转导的哺乳动物细胞范围。而且，本发明利用CellProfiler 软件对重组 杆状病毒介导的EGFP在OL细胞中表达的数字图像进行数量分析，确定出重组杆状病毒对OL细胞的最佳转导条件与外源基因的最佳表达条件40M0I重组杆状病毒转导细胞并添加IOmM 丁酸钠，转导时间为12h，培养时间为72h，表达效率最高达95. 25%。因此，本发明为EGFP在哺乳动物细胞中表达的数量分析提供一种全新、科学和准确的方法，填补了国内外该领域的空白。
图I为具体实施方式
一中重组杆状病毒CN-EGFP的转导时间及培养时间对EGFP表达效率的影响的图，其中▲表不72h, ■表不48h, 表不24h ；图2为具体实施方式
一中转导时间及培养时间对EGFP平均表达强度的影响的图； 图3为具体实施方式
一中转导时间及培养时间对EGFP最高表达强度的影响的图；图4为具体实施方式
一中感染复数及培养时间对EGFP表达效率的影响的图，其中▲表示72h, ■表示48h, 表示24h ；图5为具体实施方式
一中感染复数及培养时间对EGFP平均表达强度的影响的图；图6为具体实施方式
一中感染复数及培养时间对EGFP最高表达强度的影响的图；图7为具体实施方式
一中丁酸钠浓度及培养时间对EGFP表达效率的影响的图，其中▲表示72h, ■表示48h, 表示24h ；图8为具体实施方式
一中丁酸钠浓度及培养时间对EGFP平均表达强度的影响的图；图9为具体实施方式
一中丁酸钠浓度及培养时间对EGFP最高表达强度的影响的图；图10为具体实施方式
一中EGFP阳性细胞及阴性细胞表达强度的分布图；图11为具体实施方式
一中重组杆状病毒CN-EGFP侵染OL细胞12小时后EGFP的表达情况图；图12为具体实施方式
一中重组杆状病毒CN-EGFP侵染OL细胞24小时后EGFP的表达情况图；图13为具体实施方式
一中重组杆状病毒CN-EGFP侵染OL细胞48小时后EGFP的表达情况图；图14为具体实施方式
一中重组杆状病毒CN-EGFP侵染OL细胞72小时后EGFP的表达情况图；图15为具体实施方式
一中重组杆状病毒CN-EGFP侵染OL细胞96小时后EGFP的表达情况图；图16为具体实施方式
一中重组杆状病毒CN-EGFP侵染OL细胞添加ImM 丁酸钠培养48小时后EGFP的表达情况图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，按以下步骤进行一、用限制性内切酶Nru I和BstZ17I对质粒pcDNA3. I (-)进行双酶切；二、用限制性内切酶SnaB I和Hpa I对质粒pFastBacl进行双酶切；三、将双酶切后的质粒pcDNA3. I (-)和质粒pFastBacl进行平末端连接，连接产物经鉴定后获得重组转移载体pFastBacl-pcDNA3. 1(-)；四、以pEGFP-C3为模板，pEGFP_u和pEGFP_d为弓丨物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后于T-Vector进行连接，获得pMD-EGFP ；五、用Kpn I 和 Xho I 对重组转移载体 pFastBacl_pcDNA3. I (-)和 pMD-EGFP 分别进行双酶切，分别回收pFaStBacl-pcDNA3. I㈠重组转移载体和EGFP基因的目的条带，并分别进行纯化，然后纯化产物pFastBacl-pcDNA3. I (-)与纯化产物EGFP进行连接，连接产物经鉴定后获得 pFastBacl-pcDNA3. I (-) -EGFP ；六、pFastBacl-pcDNA3. I (-) -EGFP转化DHlOBac细胞并筛选白色单菌落，然后提取重组Bacmid DNA，然后以IOOng重组Bacmid DNA为模板，以pEGFP-u和pEGFP-d为引物进行PCR扩增，将含有EGFP基因的重组Bacmid命名重组Bacmid-EGFP ；七、利用脂质体介导转染法将重组Bacmid-EGFP转染sf9细胞，获得重组杆状病毒CN-EGFP,即完成具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建；其中步骤四和步骤六中引物pEGFP-u序列均为5' -CTACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3';引物 pEGFP-d 序列均为 5' -AGCGGTACCTCAATCTGAGTACTTGTACAGC-3;。本实施方式步骤三中连接产物的鉴定将DH5 α感受态细胞从_70°C取出，在冰上融化后加入2μ I连接产物，冰中放置30min，42°C热休克90s，冰浴2_3min，加入37°C预热的S. O. C培养基900 μ 1，37°C振荡培养Ih (160-200rpm)，然后4000rpm离心3min,弃上清，保留200 μ l培养基，将沉淀重新混匀后，涂布于LB琼脂平板上(含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml氨苄青霉素)，37 °C培养过夜。采用碱裂解法小量制备质粒DNA :随机挑取生长于LB琼脂平板上的数个白色菌落分别接种于含100 μ g/mLAmp的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜。取I. 5ml培养液于离心管中，13000r/min室温离心Imin,弃上清,将沉淀重悬于100 μ I冰预冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mMTris-HCI，IOmM EDTA，pH8. O)中，振荡，加入 200 μ I 新配制的溶液 II (O. 2MNa0H,1% SDS)，混匀后置冰浴5min，然后加入150 μ I溶液III (5Μ乙酸钾60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml配制而成),混勻，冰浴IOmin后于13000r/min室温离心IOmin0取上清,加等体积室温酚/异戊醇(25/1)溶液，抽提一次。取上清，加等体积室温氯仿/异戊醇(24/1)溶液，抽提一次。取上清，加等体积预冷异丙醇，混匀后冰浴IOmin ;13000r/min，室温离心IOmin,弃去上清液，沉淀用预冷75%乙醇洗涤一次，室温干燥，使乙醇挥发。沉淀溶于25 μ LddH20中，加入IyL RNaseA酶后混匀，37°C水浴30min。用限制性内切酶EcoR I对质粒进行单酶切以鉴定提取的质粒。本实施方式步骤四中引物pEGFP-u和pEGFP_d，如表1所示
权利要求
1.具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，按以下步骤进行 一、用限制性内切酶NruI和BstZ17I对质粒pcDNA3. I㈠进行双酶切； 二、用限制性内切酶SnaBI和Hpa I对质粒pFastBacl进行双酶切； 三、将双酶切后的质粒pcDNA3.1(_)和质粒pFastBacl进行平末端连接，连接产物经鉴定后获得重组转移载体pFastBacl-pcDNA3. 1(-)； 四、以pEGFP-C3为模板，pEGFP-u和pEGFP-d为引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后于T-Vector进行连接，获得pMD-EGFP ； 五、用KpnI和Xho I对重组转移载体pFastBacl-pcDNA3. I (-)和pMD-EGFP分别进行双酶切，分别回收pFaStBacl-pcDNA3. 1(_)重组转移载体和EGFP基因的目的条带，并分别进行纯化，然后纯化产物pFastBacl-pcDNA3. I (-)与纯化产物EGFP进行连接，获得pFastBacl-pcDNA3. 1(-)-EGFP ； 六、pFastBacl-pcDNA3.I (-) -EGFP转化DHlOBac细胞并筛选白色单菌落，然后提取重组Bacmid DNA，然后以IOOng重组Bacmid DNA为模板，以pEGFP-u和pEGFP-d为引物进行PCR扩增，将含有EGFP基因的重组Bacmid命名重组Bacmid-EGFP ； 七、利用脂质体介导转染法将重组Bacmid-EGFP转染sf9细胞，获得重组杆状病毒CN-EGFP,即完成具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建； 其中步骤四和步骤六中引物pEGFP-u序列均为5' -CTACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3/ ;引物 pEGFP-d 序列均为 5' -AGCGGTACCTCAATCTGAGTACTTGTACAGC-3;。
2.根据权利要求I所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤一中用限制性内切酶Nru I和BstZ17I对质粒pcDNA3. I (-)进行双酶切的体系如下 成分用量质粒 pcDNA3.1(-)ΙΟμNru I2.5μ BstZll I2.5μ NEBuffer 35μL 无菌水30μ 酶切反应条件为37°C水浴2h。
3.根据权利要求I所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤二中用限制性内切酶SnaB I和Hpa I对质粒pFastBacl进行双酶切的步骤如下先用SnaB I单酶切，酶切体系如下成分体积质粒 pFastBacl10|iL SnaB I2.5μιNEBuffer 4+BSA5μL 无菌水32.5pL、 37°C水浴作用2h，酶切结束后加入5 μ L醋酸钠溶液3mol/L和50 μ L异丙醇沉淀DNA，再用体积浓度为70%的乙醇洗一遍，用42. 5 μ L ddH20溶解，再用Hpa I进行酶切，酶切体系如下 成分体积SnaB I单酶切产物42.5μ Hpa I2.5μ NEBuffer 45μL 、 37 °C水浴作用2h。
4.根据权利要求I所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤三中连接的体系如下 成分用量IOxLigation Buffer (含 ATP)2μL双酶切后的pFastBacl2.5μ 双酶切后的pcDNA3.1(-)5 μL T4 DNA LigaseΙμ 无菌水0.6μ 连接反应条件为16°C连接过夜。
5.根据权利要求I所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤四中PCR扩增的反应体系如下药品加入体终浓度积10><7叫DNA聚合酶缓冲液5μ IxIOmM dNTP Mixture4 μι0.8mmol/pL20μΜ pEGFP-上游引物Ιμ 0.4μιηο1/μ 20μΜ pEGFP-下游引物Ιμ 0.4μιηο1/μpEGFP-C3 模板2μ 5U/|iL Taq DNA 聚合酶0.5μ 0.5U/|iL 无菌水36.5|iL PCR扩增条件为94°C预变性 5min，94°C 30s、55°C 30s、72°C Imin 循环 40 次，最后 72°C延伸IOmin0
6.根据权利要求I所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤五中用KpnI和Xho I对重组转移载体pFastBacl-pcDNA3. I (-)进行双酶切的体系如下 成分用量 重组转移载体 ΙΟμ pF astB ac I -pcDNA3.1 (-) Kpn I2.5μXho I2.5μ NEBuffer 35μL 无菌水30μ 酶切反应条件为37°C水浴2h。
7.根据权利要求I所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤五中用KpnI和Xho I对pMD-EGFP进行双酶切的体系如下成分用量pMD-EGFPΙΟμ Kpn I2.5μ Xho I2.5μ NEBuffer 35μL无菌水30μ 酶切反应条件为37°C水浴2h。
8.根据权利要求I所述具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤五中连接的体系如下 成份体积IOXLigation Buffer (含 ATP)2|iL纯化产物 pFastBacl-pcDNA3.1(-)2.5μ 纯化产物EGFP5 μι Τ4 DNALigase\μL 无菌水9.5μ 连接反应条件为16°C连接过夜。
全文摘要
具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，涉及可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。方法酶切pcDNA3.1(-)；酶切pFastBac1；二者连接得pFastBac1-pcDNA3.1(-)；pEGFP-C3进行扩增，产物经纯化后于T-Vector连接得pMD-EGFP；pFastBac1-pcDNA3.1(-)和pMD-EGFP分别酶切，再连接，得pFastBac1-pcDNA3.1(-)-EGFP；制Bacmid-EGFP；转染sf9细胞，得CN-EGFP即完成。本发明首次利用杆状病毒表达载体系统在OL细胞中导入并表达外源基因，拓宽了杆状病毒可转导的哺乳动物细胞范围。
文档编号C12N15/66GK102618580SQ20121009320
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者凌宏志, 唐晓艳, 安琪, 宋刚, 平文祥, 楼庄伟, 葛菁萍, 金丽颖, 高冬妮 申请人:黑龙江大学