专利名称：：包含编码metargidin的解联蛋白结构域(RDD)的序列的质粒的制作方法包含编码metargidin的解联蛋白结构域(RDD)的序列的质粒本发明涉及包含编码在强巨细胞病毒启动子控制下的完整或部分metargidin的解联蛋白(disintegrin)结构域(RDD)或其衍生物的序列的pORT质粒，特别地具有SEQIDNO2中显示的序列的质粒。所述质粒具有体内抗肿瘤活性，从而提供用于治疗癌症的有前景的治疗剂。血管发生，新毛细血管从先前存在的血管的发生，是原发性实体瘤的生长和发展所必需的。因此已提出了目的在于抑制此类肿瘤内新生血管形成(neovascularization)的策略(Folkman，NatMedl995；1:27_31)。抗血管生成治疗对于限制癌症显示至少两个明显的有利方面(a)应用于众多种癌症，因为血管发生对于所有恶性肿瘤来说是共同的现象；和(b)肿瘤新生血管形成的限制和消退应当阻止肿瘤细胞进入循环，从而降低转移的危险。adamalysin蛋白(也称为解联蛋白和金属蛋白酶蛋白(ADAMs))的家族包含位于金属蛋白酶结构域上的解联蛋白结构域。解联蛋白区域包含与整联蛋白相互作用并且可介导细胞-细胞相互作用的整联蛋白结合序列(Wolfsberg，JCellBiol1995;131:275-8)。Metargidin(金属蛋白酶-RGD-解联蛋白蛋白)，也称为人ADAM-15，是由平滑肌细胞、肾小球膜细胞以及由被激活的生成血管的内皮细胞(angiogenicendothelialcell)(以更高的水平)表达的跨膜adamalysin(KratZSChmar等人，JBiolChem1996；271:4593_6；Ham等人，ExpCellRes2002；279:239_47；Herren等人，FASEBJ1997；11173-80；Martin等人，JBiolChem2002；277:33683_9)。AMEP(抗血管生成Metargidin肽)是metargidin的重组解联蛋白结构域(RDD)。AMEP肽通过RGDC整联蛋白结合序列结合整联蛋白，例如α5β1和ανβ3(Zhang等人，JBiolChem1998;273:7345_50;Nath等人，JCellSci1999;112:579_87)，这表明此类整联蛋白和metargidin的功能可能是相互依赖的。表达为可溶性重组蛋白的AMEP可能阻止该相互作用的假说导致探索RDD对血管发生和肿瘤生长的作用。之前证明RDD在体外抑制内皮细胞在毛细管样结构中的增殖、迁移、侵入和组织化。在四环素诱导型系统中将被插入质粒的RDDcDNA电转移入小鼠骨骼肌。RDD产物在转基因电转移入肌肉并且用多西环素(doxycycline)诱导后第14天，在体内抑制皮下(s.c.)人乳腺MDA-MB-231肿瘤生长达78%。该抗肿瘤效应与显著减少的肿瘤血管形成相关。此夕卜，在RDD存在的情况下，在1周的治疗后，在小鼠肺中，B16F10黑素瘤转移被抑制了74%(Trochon-Joseph等人，CancerRes2004；64:2062_2069)。然而，该四环素诱导型系统需要三种质粒(pBi-RDD质粒以及Tet-On和Tet_tTS载体)的共转染和多西环素的联合施用。因此，考虑进一步发展更简单且有效的体内表达RDDcDNA的方法。用包含驱动转基因的组成型表达的人巨细胞病毒(CMV)启动子和卡那霉素抗性基因的PVAX质粒(Invitrogen，V260-20)进行了初步尝试。然而，该载体在转基因表达和体外抗增殖活性方面未获得十分令人满意的结果。将RDDcDNA进一步克隆入由CobraBiomanufacturing提供的用于人的临床应用的缺乏任何抗生素抗性基因的质粒pORT-RDD质粒。该新型质粒的特征还在于强组成型启动子(CMV-内含子A)、人分泌信号(人尿激酶uPA信号)、数目减少的免疫刺激性CpG序列(在pORT-RDD中150个)、较小的大小和高拷贝数。意外地发现pORT-RDD载体在体外获得与强抗增殖活性相关的高水平的RDD转基因的表达。已在体内进行了在黑素瘤的动物模型中证明抗肿瘤和抗转移活性的进一步实验。因此，pORT-RDD载体提供了用于癌症和转移的抗血管生成治疗的有前景的治疗剂。因为其缺乏任何抗生素抗性基因，因此根据涉及基因转移药品的临床方面的另外的指导方针(GuidelineEMEACPMP/BWP/3088/99；Directive2001/18/CE)，该载体也是特别适当的。定义“Metargidin”是指也称为MDC-15或ADAM-15的人金属蛋白酶-RGD-解联蛋白蛋白。Kratzschmar等人(JBiolChem1996；271:4593-6)描述了metargidin的克隆。“RDD”是指人metargidin的解联蛋白结构域。RDD的cDNA序列作为SEQIDNO1示于所附序列表中。“AMEP”或“抗血管生成Metargidin肽”是指重组RDD肽。术语“衍生物”是指其中从上述序列置换、添加或缺失1个或多个核苷酸的RDD的cDNA序列的变体，只要其保持野生型RDD的生物活性，例如在体外和/或体内对内皮细胞增殖的抑制和/或对血管发生的抑制。优选，这样的变体具有序列，所述序列与上述cDNA序列SEQIDN01具有至少80%，优选至少85%，至少90%，更优选至少95%，或至少98%的同一性。可以例如通过在不断增加的量的RDD的衍生物的片段存在的情况下或在其不存在的情况下培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，进行例如96小时，以及通过进行细胞增殖测定以定量细胞增殖的抑制来估量内皮细胞增殖的抑制。可通过本领域内技术人员已知的任何适当的方法例如通过MTT测定法(例如细胞增殖试剂盒I，RocheDiagnostics,Germany)来估量细胞增殖。血管发生的抑制可以例如通过测定小管样结构(由培养在支持基质例如基质胶(Matrigel)上的内皮细胞形成)的形成来估量.术语“肽”无差别地指二肽、寡肽或多肽，即其中无论其长度，单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。“质粒”是通常能够在它们的宿主例如细菌中自主复制的染色体外双链DNA(dsDNA)分子。如本文中所使用的，术语“载体”和“质粒”无差别地指借助于其可将RDDcDNA序列导入宿主细胞以转化宿主并且促进RDD序列表达(例如转录和翻译)的媒介物。"pORT质粒”是指包含易于被反式表达的阻抑物结合的操纵子的质粒。所述操纵子可以是例如lac操纵子、A操纵子、trp操纵子、gal操纵子、ara操纵子、Arg操纵子和Tet操纵子。pORT质粒已描述于Williams等人，NucleicAcidsRes.1998May1；26(9)2120-4；Cranenburgh^A,NucleicAcidsRes.2001Mar1；29(5):E26；Cranenburgh^人，JMolMicrobiolBiotechnol.2004；7(4):197_203中和国际专利申请W09709435中。pORT-RDD质粒和其产生0RT技术使用质粒介导的阻抑物滴定法Oppressortitration)来激活宿主选择标记，从而消除对质粒携带的标记基因的要求。例如，可对包含在Iac操纵子/启动子(lacO/P)的转录控制下的必需基因例如dapD基因的细菌株系进行基因工程改造。在诱导剂例如乳糖不存在的情况下，该株系由于dapD表达的抑制(因LacI阻遏蛋白结合IacO/P)而不能生长。通过滴定来自操纵子的LacI，使用高拷贝数目的包含Iac操纵子(IacO)的质粒进行的转化有效地诱导dapD表达。必需基因的调控确保细菌的生长以及包含IacO和复制起始区的重组质粒的维持(Williams等人，NucleicAcidsRes.1998Mayl；26(9)2120-4；Cranenburgh^A,NucleicAcidsRes.2001Marl；29(5):E26；Cranenburghφ人，JMolMicrobiolBiotechnol.2004；7(4)197-203)。已设计了编码RDD基因的表达质粒pORT-RDD。更特别地，将包含由人尿激酶分泌信号驱动的RDD基因的表达盒插入pORTlaCMV，即包含强真核组成型启动子(CMV-内含子A)的0RT质粒。因而RDD表达盒在强巨细胞病毒(CMV)启动子的控制之下并且被置于牛生长激素(bGH)多聚苷酸化信号的上游。pORT-RDD质粒的序列示于SEQIDNO:2。因此，本发明涉及包含编码完整或部分metargidin的解联蛋白结构域或其衍生物的序列的PORT质粒，其中插入所述序列，使之在强巨细胞病毒(CMV)启动子的控制之下。特别地，pORT质粒可包含编码序列SEQIDNO1的metargidin的解联蛋白或其变体的序列，在所述变体中，从SEQIDNO:1置换、添加、缺失一个或多个核苷酸，并且所述变体与SEQIDNO1具有至少80%的序列同一性，并且保持在体外和/或体内抑制内皮细胞增殖和/或抑制血管发生的能力。本发明的质粒可包含metargidin的解联蛋白结构域的“部分”。在这样的情况下，优选，metargidin的解联蛋白结构域的部分(其还可称为“片段”)保持野生型RDD的生物活性，例如在体外和/或体内抑制内皮细胞增殖和/或抑制血管发生的生物活性。特别地，包含编码metargidin的解联蛋白结构域(RDD)的序列的质粒具有SEQIDNO2中所示的序列。所述质粒，也称为pORT-RDD质粒，可按照任何适当的方法特别地重组DNA技术产生。例如，可在适当的宿主细胞，例如细菌宿主细胞特别地大肠杆菌(Escherichiacoli)细菌，更特别地经基因工程改造而包含在lac操纵子/启动子(lacO/P)的转录控制下的必需染色体基因例如dapD的大肠杆菌中扩增pORT-RDD质粒。此外，pORT-RDD质粒是使得可能在被转染入适当的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞，特别地肿瘤细胞时表达RDD肽的表达质粒。因此，本发明还提供了用pORT-RDD质粒转化的宿主细胞。术语“宿主细胞”是指以任何方式选择、修饰、转化、培养或使用或操作以用于通过细胞产生物质，例如通过细胞扩增pORT-RDD质粒或用于通过细胞表达RDD肽的任何生物的任何细胞。pORT-RDD质粒至宿主细胞的离体或体内导入可通过本领域内技术人员熟知的任何标准方法例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、基因枪的使用或脂质转染来进行。本发明还提供了a)产生pORT-RDD质粒的方法，该方法包括由培养用所述pORT-RDD质粒转化的宿主细胞组成的步骤，和b)从培养的宿主细胞回收pORT-RDD质粒的方法。为了产生和扩增pORT-RDD质粒，可特别地使用由Cranenburgh等人(Nuc1eicAcidsRes.2001Mar1；29(5):E26)描述的大肠杆菌DH1株系，即包含在lac操纵子/启动子控制下的dapD染色体基因的株系。这些株系可通过CobraBio-manufacturing获得。可容易地分离和繁殖转化的宿主细胞，因为，除非在补充有IPTG(其诱导dapD的表达)或DAP的培养基中培养，否则通过阻抑物滴定选择，只有转化体可在任何培养基中生长。pORT-RDD质粒可由本领域技术人员，例如通过用转化的0RT-株系接种适当的培养基，例如LB培养基(即蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl5g/l)，然后进行培养来容易地产生。在实验室规模上，这可通过在常规的实验室培养瓶中在37°C下，优选在振荡(例如200rpm)的条件下温育来进行。pORT-RDD质粒还可在发酵罐中以更大的规模产生。有利地，可按照由Varley等人(Bios印aration.1999;8(1-5):209_17)描述的方案，或按照其改进方案进行发酵。用于进行发酵的适当的培养基包含KH2P043g/l、Na2HP046g/l、NaCl0.5g/l、聚丙二醇丽2025g0.2%、微量元素溶液、CaCl2、2H200.03g/l、FeS04.7H200.04g/l、柠檬酸0.02g/l和MgS040.5g/l、维生素溶液、四环素12mg/l。培养基还可包含蛋白胨2g/l、酵母提取物20g/1、(NH4)2S0410g/l、甘油2.8%。备选地，可连续地将蛋白胨、酵母提取物、(NH4)2S04和甘油加入发酵容器。优选在37°C、pH6.8和50%的空气饱和度的溶解氧设定点下进行发酵。通常将培养收获物进行离心以沉淀细胞。然后可冷冻细胞沉淀并且在纯化之前于-70°C下贮存。纯化pORT-RDD质粒的适当方法的选择在本领域技术人员的能力之内。优选，可通过下列步骤来进行纯化(a)碱性裂解培养的宿主细胞，然后进行中和；(b)网袋过滤；(c)阴离子交换层析；(d)浓缩；(e)离子对反相和尺寸排阻层析，和(f)过滤o因此，本发明还提供了产生pORT-RDD质粒的方法，该方法包括步骤a)培养用pORT-RDD质粒转化的宿主细胞；b)从培养的宿主细胞回收pORT-RDD质粒；和c)通过⑴碱性裂解培养的宿主细胞，然后中和；(ii)网袋过滤；(iii)阴离子交换层析；(iv)浓缩/渗滤；(V)离子对反相和尺寸排阻层析，和(Vi)过滤来纯化所述pORT-RDD质粒。本发明还涉及从转化的宿主细胞纯化pORT-RDD质粒的方法，该方法包括步骤(a)碱性裂解宿主细胞，然后进行中和；(b)网袋过滤；(c)阴离子交换层析；(d)浓缩；(e)离子对反相和尺寸排阻层析，和(f)过滤。产生和/或纯化pORT-RDD质粒的方法进一步描述于下列实施例1中。当宿主细胞是哺乳动物细胞时，本发明还提供了体外或体内在细胞中表达RDD肽的方法，该方法包括用pORT-RDD质粒转化所述细胞，由此在细胞中表达RDD肽(或AMEP，因为其是重组RDD肽)。哺乳动物细胞特别地是肿瘤细胞。RDD肽的表达可用于其中将要抑制血管生成活性的情况，例如癌症中。此外，本发明者已意外地证明RDD肽在体外展示直接的抗肿瘤活性。特别地，已证明pORT-RDD质粒在用该质粒转染的黑素瘤细胞的培养物中抑制肿瘤细胞的增殖。下面进一步详细描述治疗性应用。用于p0RT-RDD质粒批次的表征的体外功效测定为了能够比较或标准化pORT-RDD质粒的不同批次的功效(potency)，本发明者开发了体外测定pORT-RDD质粒的功效的方法。因而本发明提供了测定pORT-RDD质粒对肿瘤细胞增殖的抑制功效的体外方法，该方法包括步骤a)提供肿瘤细胞系的亚汇合(sub-confluent)培养物；b)分别用不断增加的量的根据本发明的pORT-RDD质粒或用对照转染步骤a)的细胞培养物；c)在适合于获得用对照转染的细胞的增殖的条件下培养步骤b)的被转染的细胞；d)对于每一个特定量的被转染的pORT-RDD质粒，测定与步骤a)中提供的细胞培养物中的细胞的数目相比，存活细胞的百分数，所述细胞培养物被提供用于用所述特定量的pORT-RDD质粒进行的转染；e)对于用对照转染的细胞，测定与步骤a)中提供的细胞培养物中的细胞的数目相比，存活细胞的百分数，所述细胞培养物被提供用于用所述对照进行的转染；由此如果步骤d)中计算的存活细胞的百分数低于步骤e)中计算的存活细胞的百分数，则pORT-RDD质粒被确定为具有抑制功效。可按照本发明的方法使用的肿瘤细胞系可以特别地是黑素瘤细胞系，例如B16F10细胞、C9细胞或451Lu细胞。优选，以50-80%的汇合、更优选以50%的汇合提供肿瘤细胞系的培养物。可以例如通过在24孔多孔板中每孔接种15000个B16F10细胞或30000个C9细胞或30000个451Lu细胞来制备肿瘤细胞系的亚汇合培养物。可由本领域技术人员容易地确定可用于转染的pORT-RDD质粒的不断增加的量。例如，可使用0.1至2.0μgpORT-RDD质粒的量转染15000个B16F10细胞或30000个C9细胞或30000个451Lu细胞。可通过脂质转染，例如使用Lipofectamine和Plus试剂(例如由Invitrogen销售的)来提高体外转染率。在本发明的方法中，“对照”存在于另外用于与不同量的pORT-RDD质粒一起转染细胞的转染混合物中。使对照不具有任何质粒。转染通常可通过在无血清培养基(包含例如用于脂质转染的试剂并且不含质粒DNA(对照)或含有不同量的质粒DNA)中，于37°C，5%CO2下温育细胞，进行例如4小时来进行。然后常规地，即在37°C、5%C02T于完全培养基(即支持细胞生长的培养基)中，培养细胞，进行例如72至120小时，优选进行96小时。在培养期结束时，通过本领域技术人员已知的任何适当的方法，例如使用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)试剂或台盼蓝来估量细胞存活。为了比较批次，可以以百分数存活细胞作为被转染的质粒DNA的量的函数来对测定的细胞存活的百分数作图，例如图12-14中所显示的。pORT-RDD质粒的冷冻干燥本发明还提供了制备冷冻干燥的pORT-RDD质粒的方法，该方法包括步骤a)将pORT-RDD质粒的溶液冷冻至_40V至_60V；b)升华步骤，其通过在200至300iibar的压力下将温度增加至+5°C至+15°C的温度，进行10至20小时的时间来进行；和c)第二干燥步骤，其在室温优选在+20°C下，在200至300iibar下进行，直至pORT-RDD质粒达到室温(+20°C)，然后在30-70ubar下进行直至20小时。冷冻步骤可通过在1至2小时内将pORT-RDD溶液的温度从室温(特别地+20°C)降低至-40°C至-60°C，并且保持该温度2小时来进行。优选，进行冷冻步骤，使温度下降至-50°C。优选通过在250iibar压力下，在3小时内将温度从_50°C升高至+10°C，然后在+10°C(工作台温度(tabletemperature))下进行12小时来进行升华步骤。优选通过在50ubar下，在+20°C下进行直至20小时来进行第二干燥。有利地，在进行冷冻干燥法的过程中可将甘露醇和葡萄糖用作冷冻保护剂。因此，可将pORT-RDD质粒配制于包含甘露醇和葡萄糖的溶液中。可在冷冻之前将例如2%的甘露醇(以100mg/ml)和1%的葡萄糖(以500mg/ml)(百分数以甘露醇或葡萄糖溶液的体积对质粒溶液的体积来表示)加入pORT-RDD质粒溶液，特别地在10mMTrisUmMEDTApH7.5中配制的pORT-RDD质粒的溶液。因此，用于冷冻的pORT-RDD质粒溶液优选包含1.9-2.0mg/ml甘露醇和4.8-4.9mg/ml葡萄糖。药物组合物和治疗性应用本发明还提供了pORT-RDD质粒用于制备意欲用于治疗肿瘤的药剂的用途。本发明还涉及pORT-RDD质粒用于治疗肿瘤的用途。还提供了治疗肿瘤的方法，该方法包括对需要其的受试者施用治疗有效量的pORT-RDD质粒。在本发明的说明书中，术语“治疗”或“医治”是指逆转、减轻此类术语所用于的病症或状况或此类疾病或状况的一个或多个症状、抑制其进展或预防其。“治疗有效量”是在受体受试者中，特别地在癌症治疗方面，有效地产生有益结果的量。这样的量可通过回顾已出版的文献，通过进行体外试验或通过在健康实验动物中进行代谢研究来初步测定。如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如啮齿目动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。优选，根据本发明的受试者是人。因为RDD肽具有抗血管生成活性，因此使用pORT-RDD质粒的治疗可用于众多种癌症并且可阻止肿瘤细胞进入循环，即阻止转移的发生和/或发展。根据本发明，肿瘤可以是任何肿瘤，例如原发性或转移性肿瘤、实体瘤或软组织肿瘤、或血液恶性肿瘤。事实上，不断增加的证据表明血管发生也在血液恶性肿瘤中起着重要作用(Dong等人，CritRevOncolHematol.2006Dec21)。实体瘤或软性肿瘤(softtumor)的实例包括膀胱癌、乳腺癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肝癌、肺癌、神经系统癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和皮肤癌，特别地黑素瘤。血液恶性肿瘤包括例如急性或慢性白血病，例如急性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病(acutelymphoblasticleukaemia)、慢性髓性白血病或慢性淋巴细胞性白血病；淋巴瘤；多发性骨髓瘤；和骨髓增生异常综合征。根据实施方案，根据本发明的药剂、质粒或治疗方法意欲用于预防和/或治疗转移瘤。虽然pORT-RDD质粒可以被单独施用，但优选以药物组合物的形式提供pORT-RDD。因而，本发明还提供了包含pORT-RDD质粒和药学上可接受的载体的药物组合物。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的”和其语法变型，当它们指组合物、媒介物、载体、稀释剂和试剂时，它们可互换使用并且表示能够对或在受试者上施用所述材料而不产生不期望的生理效应例如恶心、眩晕、心嘈(gastricupset)等。本领域内已知的适当的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水、生理盐溶液、葡萄糖、右旋糖(dextrose)或缓冲溶液。载体可包括助剂(auxiliaryagent)，包括但不限于稀释剂、稳定剂(S卩，糖和氨基酸)、防腐剂、湿润剂、乳化剂、PH缓冲剂、增稠添加剂(viscosityenhancingadditive),着色剂等。可通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、损伤内(intralesionally)、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、经直肠、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、囊内(intravesicularly)、经粘膜、心包内、口服、局部、局部性途径和/或使用气雾剂(aerosol)、注射、输注、连续输注、直接地或通过导管局部灌注水浴靶细胞(bathingtargetcell)和/或灌洗来施用包含pORT-RDD质粒的药物组合物。例如，可配制用于胃肠外施用的，例如配制用于通过静脉内、肌内或皮下途径注射的本发明的pORT-RDD组合物(然而可使用其他途径例如气雾剂来施用)。根据本公开内容，包含本发明的pORT-RDD质粒和/或另外的试剂作为活性成分的水性组合物的制备对于本领域内技术人员来说将是已知的，如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,MackPublishingCompany,1980中举例说明的。一般地，此类组合物被制备为可注射的液体溶液或悬浮液；还可制备适合用于在注射前通过加入液体而制备溶液或悬浮液的固体形式。还可乳化制剂。特别地，可将药物组合物配制为固体剂型，例如胶囊、片剂、丸剂、粉剂、锭剂或颗粒剂。无菌注射液可通过将质粒以需要的量与其他上面例举的组分(如果需要的话)一起整合入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备。如果需要，应当对液体介质进行适当的缓冲，并且在注射前首先用充足的生理盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。还涉及用于直接注射的高度浓缩的组合物的制备，其中预期DMSO用作溶剂可导致极其快速的渗透，从而将高浓度的活性剂递送至小区域。组合物将是无菌的，其流动性达到可被容易地注射的程度，其在制造和贮存的条件下是稳定的，并且进行了防腐处理以抗微生物的污染作用。可用于制备可注射组合物的适当的溶剂的实例包括由IOmMTrisImMEDTA、150mMNaCl，pH7.5或生理血清(NaCl0.9%)组成的TENaCl溶液。可通过药学领域内熟知的任何方法以单位剂型的形式制备制剂。此类方法包括使PORT-RDD质粒与组成一种或多种配合剂的载体结合的步骤。一般地，通过使pORT-RDD质粒与液体载体或精细的固体载体或两者均勻且密切地结合，然后如果需要，给产物塑形来制备制剂。用于给受试者施用的本发明的pORT-RDD质粒组合物(和/或另外的试剂)的实际剂量可根据物理和生理因素例如受试者的体重、肿瘤体积、状况的严重度、特发病和基于施用的途径来确定。通过考虑这些因素，可容易地确定用于特定受试者和/或疗程的脂质组合物的剂量。取决于被治疗的受试者和特定的施用模式，治疗可发生变化。例如，在本发明中，pORT-RDD质粒的剂量范围可以是大约0.05mg/kg体重至大约500mg/kg体重。当对动物进行治疗时，术语“体重”是可应用的。当治疗分离的细胞时，本文中使用的“体重”应当理解为表示“总细胞重量”。术语“体重”可以应用于分离的细胞和动物的治疗。然而，本领域技术人员将承认多种剂量范围，例如0.05mg/kg体重至300mg/kg体重、0.lmg/kg体重至lOOmg/kg体重、0.2mg/kg体重至50mg/kg体重或0.5mg/kg体重至10mg/kg体重的功用。优选剂量方案可以在0.1至lmg/kg体重之间。当然，所有这些剂量是示例性的，处于这些点之间的任何剂量也预期用于本发明。对于任何特定受试者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括体重、总体健康状况、性别、饮食、施用的时间和途径、吸收和排泄的速度、与其他药物的组合以及被治疗的特定癌症的严重度。可由本领域技术人员使用pORT-RDD质粒的任何适当的施用模式。此类方法包括但不限于通过注射、显微注射、电穿孔、电转移、快速注射(jet-injection)进行的质粒的直接递送、磷酸钙沉淀、使用DEAE-葡聚糖然后使用聚乙二醇、直接的声波装载(directsonicloading)、脂质体介导的转染、受体介导的转染、微粒轰击、使用碳化硅纤维进行的搅拌、PEG-介导的原生质体的转化、干燥/抑制_介导的DNA吸收或此类方法的任何组合。优选通过电转移施用pORT-RDD质粒，如下面进一步描述的。电转移方案通过对患有皮下肿瘤的小鼠进行瘤内或肌内电转移来成功地施用pORT-RDD质粒。因此，本发明涉及pORT-RDD质粒用于通过电转移，特别地通过瘤内和/或肌内电转移进行的肿瘤的治疗的用途。本发明还提供了pORT-RDD质粒用于制备意欲被体内电转移入肿瘤细胞的药剂的用途。本发明还涉及pORT-RDD质粒用于体内电转移入肿瘤细胞的用途。可按照本领域内已知的任何适当的方法电转移待施用的质粒。有利地，可按照国际专利申请PCT/IB2006/002401中描述的方案进行电转移。根据该方案，将质粒或药剂与肿瘤或肌肉细胞接触，然后如下电刺激肿瘤或肌肉-首先，使用至少一个200至2000伏/cm的高电压(HV)场强的脉冲-其次，使用具有50至200伏/cm的低电压(LV)场强和300至2000ms的持续时间的单脉冲。可将质粒与肿瘤或肌肉细胞接触数秒至10分钟，例如30秒至5分钟，在应用HV脉冲之前。优选在易于与电转移电极接触的肌肉即身体表面上的肌肉中进行肌内电转移。可通过直接的瘤内注射、通过全身性施用(例如，静脉内或动脉内途径)或通过局部或皮下施用来接触质粒。质粒的肌内注射可用于将质粒与肿瘤或肌肉细胞接触。特别地，可首先用至少一个400至2000伏/cm，优选600至2000，优选800至1600伏/cm，更优选900至1200，通常大约1000伏/cm的HV场强的脉冲电刺激肿瘤或肌肉组织。HV脉冲可具有10至1000us，优选50至200us，通常大约100us的持续时间。可存在几个HV脉冲，即具有本文中公开的技术指标(specification)的2至10个HV脉冲。在该情况下更方便地具有相同的HV脉冲。HV脉冲的频率可以是1Hz。然而，上面公开的单HV脉冲足以穿透细胞膜。因此，在优选实施方案中，使用单HV脉冲。当存在单HV脉冲时，其优选是矩形脉冲。在几个HV脉冲的情况下，可使用单极或双极脉冲，或使用具有不同方向和/或极性的脉冲，优选使用矩形类型。根据实施方案，至少一个HV场强的脉冲由一个脉冲HV=1500V/cm,100μs，IHz组成。HV和LV脉冲可通过间隔的时间分开，并且该间隔的时间可有利地是300ms至3000s，优选500ms至1000s，优选500ms至10s，通常大约1000ms。在特定的实施方案中，不存在间隔的时间或只有很短的间隔时间，例如小于300ms，且HV脉冲具有300至1000伏/cm,优选400至800伏/cm的场强。单LV脉冲可具有100至200伏/cm，优选120至160伏/cm，通常大约140伏/cm的场强。单个LV脉冲可具有300至800ms，优选350至600ms，通常大约400ms的持续时间。LV脉冲可以具有与HV脉冲相同的极性，或可以具有与HV脉冲的极性相反的极性。优选，单LV脉冲是矩形脉冲。其还可以是梯形的或不连续的。根据实施方案，LV脉冲具有140V/cm的场强并且持续400ms。可按照本发明执行的优选电转移方案是-HV:1000-1600V/cm,50-200μs,1个脉冲，IHz，-间歇500ms至IOs-LV=100-200V/Cm,300-800ms,1个脉冲。优选，可使用下列电转移方案-HV=1300V/cm,100μs,IHz,1个脉冲-间歇=IOOOms-LV=140V/cm,400ms,1个脉冲。备选地，优选还可使用下列电转移方案-HV=1500V/Cm,100μs,IHz,1个脉冲-间歇1000ms-LV=140V/Cm,400ms,1个脉冲。将根据下列图和实施例进一步举例说明本发明。M图1是pORTIaCMV质粒的图谱。Ml是pORT-RDD质粒的图谱。Ml是pVAXl质粒的图谱。图4是在基于pORT的载体的瘤内电转移后，在14天中B16F10皮下肿瘤的肿瘤生长的图示。当肿瘤体积>30mm3(第0天)时，注射50μg质粒(于50μ1IOmMTris,ImMEDTA，0.9%NaCl，pH7.5中)并且施以电脉冲。数据表示各组(在第0天，pORTIaCMVη=10(在实验过程中发生一个自然死亡)和pORT-RDDη=11(在实验过程中发生2个自然死亡)；在第14天，对于每一组η=9)的肿瘤体积(平均值士SD)。星号表示统计学显著性。■是在基于PORT的载体的瘤内电转移后，在前7天中B16F10皮下肿瘤的肿瘤生长的图示。数据表示各组的肿瘤体积(平均值士SD)。星号表示统计学显著性。_展示利用基于PORT的载体的瘤内电转移治疗的小B16F10皮下肿瘤的以mm3表示的肿瘤体积的监控的分析。肿瘤体积在第0天在33.51至65.45mm3之间。数据表示各组的肿瘤体积(平均值士SD)。该图不包括死亡小鼠pORTlaCMVη=6和pORT-RDDη=7。不存在统计学显著性。Ml展示利用基于PORT的载体的瘤内电转移治疗的小B16F10皮下肿瘤的以V/V0表示的肿瘤监控的分析。肿瘤体积在第0天在33.51至65.45mm3之间。V/V0表示第0天的肿瘤体积与第D天的肿瘤体积之间的比率。数据表示各组的肿瘤比率(平均值士SD)。该图不包括死亡小鼠pORTlaCMVη=6和pORT-RDDη=7。星号表示统计学显著性。Μ8展示在不断增加的剂量的pORT-RDD质粒的瘤内电转移后B16F10皮下肿瘤的肿瘤生长的分析。当肿瘤体积在30至50mm3(第0天)之间时，将不断增加的剂量的PORT-RDD质粒注射入预先建立的B16F10皮下肿瘤并且使用电脉冲。数据表示各组的肿瘤体积(平均值士SD)。M9展示利用pORT-RDD质粒的重复瘤内电转移治疗的B16F10皮下肿瘤的以mm3表示的肿瘤体积的监控的分析。数据表示各组(TE媒介物η=20；pORT-RDDIXη=10；pORT-RDD2Xη=20)的肿瘤体积(平均值士SD)。图10显示在200μgpORT-RDD质粒的单次瘤内电转移后，通过超声进行的肿瘤体积的监控。图11显示在200μgpORT-RDD质粒的单次瘤内电转移后，通过多普勒-超声进行的肿瘤血管的监控。图12显示在用不断增加的量的pORT-RDD(ΒΑ015-VCC-Q04)质粒转染后，B16F10细胞增殖的抑制。^13展示在用不断增加的量的pORT-RDD(ΒΑ015-VCC-004)质粒转染后，C9细胞增殖的抑制。图14展示在用不断增加的量的pORT-RDD(ΒΑ015-VCC-004)质粒转染后，451Lu细胞增殖的抑制。图15显示关于非冷冻干燥的和冷冻干燥的质粒样品的质粒形式的琼脂糖凝胶分析的结果(M:1KbDNA梯标志物，Invitrogen)。Si^显示C9黑素瘤细胞增殖的分析的结果。按照Lipofectamin印Ius方案，用不断增加的剂量的非冷冻干燥的(批次3)和冷冻干燥的(批次4)pORT-RDD质粒转染细胞(对于每一个剂量，η=4)。数据表示平均值士SD。图17显示451LU黑素瘤细胞增殖的分析的结果。按照Lipofectamineplus方案，用不断增加的剂量的非冷冻干燥的(批次3)和冷冻干燥的(批次4)pORT-RDD质粒转染细胞(对于每一个剂量，η=4)。数据表示平均值士SD。^18显示利用非冷冻干燥的或冷冻干燥的pORT-RDD质粒的瘤内电转移治疗的B16F10皮下肿瘤的以mm3表示的肿瘤体积的监控的分析。数据表示各组的肿瘤体积(平均值士SD)。ΜΛ9展示利用pORT-RDD质粒和媒介物的瘤内电转移治疗的B16F10皮下肿瘤的肿瘤体积的监控。数据表示各组的肿瘤体积(平均值士SD)。S20展示从第0天(细胞注射)至第8天利用pORT-RDD质粒和媒介物的瘤内电转移治疗的B16F10皮下肿瘤的肿瘤体积的监控。数据表示各组的肿瘤体积(平均值士SD)。实施例实施例1pORT-RDD质粒的产生·质粒CobraBioManufacturing已产生了表达质粒pORT-RDD，其编码在翻译上融合至人尿激酶的信号肽的下游的RDD基因。编码序列在强真核巨细胞病毒(CMV)启动子的控制之下并且被置于牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号的上游。通过将包含由人尿激酶分泌信号驱动的RDD基因的基因盒插入CobraBioManufacturing的pORTlaCMV质粒(图1中的图谱)已设计了pORT-RDD。基因盒的序列如下AAGCTTATGAGAGCCCTGCTGGCGCGCCTGCTTCTCTGCGTCCTGGTCGTGAGCGACTCCAAAGGCATGGCTGCTTTCTGCGGAAATATGTTTGTGGAGCCGGGCGAGCAGTGTGACTGTGGCTTCCTGGATGACTGCGTCGATCCCTGCTGTGATTCTTTGACCTGCCAGCTGAGGCCAGGTGCACAGTGTGCATCTGACGGACCCTGTTGTCAAAATTGCCAGCTGCGCCCGTCTGGCTGGCAGTGTCGTCCTACCAGAGGGGATTGTGACTTGCCTGAATTCTGCCCAGGAGACAGCTCCCAGTGTCCCCCTGATGTCAGCCTAGGGGATGGCGAGTAATCJAGA(348bp)(SEQIDNO3).HindIII和XbaI限制位点以粗体显示，人尿激酶分泌信号以下划线显示，RDD基因以斜体显示。用HindIII和XbaI降解合成的基因盒和pORTlaCMV，然后连接片段以产生pORT-RDD质粒。pORT-RDD载体因而包含下列元件(图2中的质粒图谱)人巨细胞病毒立即_早期(CMV)启动子+内含子a(比经典CMV(Cobra来源)更强的启动子)、牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号、用于选择的LacO序列和在人尿激酶分泌信号的控制下的人RDD基因。然后将pORT-RDD转化入宿主株系DH1-0RT并且通过发酵来生产。还可使用Cranenburgh等人，2001中提及的DHlLacdapD株系。·pORT-RDD的产生研究工作细胞库的产生将已转化的DH1-0RT(CobraBiomanufacturing,CTL2006#0492P)的甘油原液用于接种8X5ml的25ml无菌universal中的无菌LB培养基。将5ml培养物在37°C下于以200rpm振荡的培养箱中温育大约16小时。小量制备20Dml样品来确认质粒的存在。然后将IODml的经选择的培养物用于接种25mlLB培养基。在以200rpm振荡的条件下，在37°C下培养该培养物直至其达到0.8-1.50D单位的光密度(600nm)。使用20%ν/ν甘油冷冻保存培养物。将该培养物以Iml士0.2ml等分入20多个无菌冷冻管，然后在低于-70°C下贮存。遗传稳定性试验评估质粒的结构和分离稳定性，进行多于40个胞世代。通过将相同数目的细胞(0.100Dml)接种入新鲜LB培养基(5ml)中，然后以24小时的间隔进行传代培养来进行该评估。在37°C和200rpm下在轨道振荡器中温育培养物。在各24小时间隔上，测量光密度(600nm)并且将其用于计算经过的细胞倍增次数(或世代)细胞世代的数目=Ln(终光密度/接种时的光密度)/1η2重复该过程直至已进行多于40个细胞世代。在各传代培养期，通过离心沉淀已知数目的细胞(20Dml)，并且使用两种小量制备方法(由Birnboim和Doly设计的小量制备方法(NucleicAcidsRes.1979Nov24；7(6)1513-23)和使用QIAprepMiniprep方法及试剂盒(Qiagen))来提取pDNA。然后将等体积的来自各个传代培养的分离的pDNA装载至用溴化乙锭染色的0.8%琼脂糖凝胶上，然后定性显现分离或结构不稳定性的迹象。通过连续传代培养和经历44代的取样分析，未发现显著的总体分离或结构不稳定性的迹象。5-升发酵罐的评估在FTApplikon5/71发酵罐容器中以51的规模评估包含pORT-RDD的DHl-ORT株系。所使用的复合培养基和发酵方案是具有下列改进的Varley等人(Bioseparation.1999；8(1-5)209-17)中的复合培养基和发酵方案。Varley等人描述的培养基由终浓度KH2P043g/l、Na2HPO46g/l、NaCl0.5g/l、聚丙二醇MW2025g0.2%、微量元素溶液0·05%[由CoCl2.6H202g/l、CuCl2.2H201.9g/l、H3BO3L6g/l、MnSO4.H2O1.6g/l、Na2MoO4.2H202g/l、ZnCl2.7H202g/l、Fe2(SO4)3.xH20lg/UCaCl2.2H20lg/1和柠檬酸60g/l组成]、CaCl2.2H200.03g/l、FeS04.7H200.04g/l、柠檬酸0.02g/l、MgS040.5g/l、维生素溶液5ml/l[由生物素0.6g/l、叶酸0.04g/l、吡哆醇-HCl1.4g/l、核黄素0.42g/l、泛酸5.4g/l和烟酸6.lg/1组成]、四环素12mg/l以及蛋白胨2g/1、酵母提取物20g/l、(NH4)2SO410g/l和甘油2.8%组成。然而，用于线性补料分批发酵的甘油、植物蛋白胨、酵母提取物和硫酸铵不包括在大量培养基(bulkmedia)中，而是以60、40和30ml/小时的恒定进料速度添加入容器。通过将IOOgBacto酵母提取物、IOg植物蛋白胨、176.5g甘油、25g硫酸铵混合并且用纯化水加至740ml来制备进料液。在0.2μm过滤器上进一步过滤进料液。在发酵的整个时间过程中收集用于分析的样品。就光密度(600nm)、分离或结构不稳定性以及PDNA的个别产量分析样品。通过在21长颈Erlenmeyer振荡培养瓶(baffledErlenmeyershakeflask)中将来自研究工作细胞库(ResearchWorkingCelIBank)的200μ1细胞用于200mlT-Broth培养基(11.8g/l植物蛋白胨、23.6g/l酵母提取物、2.2g/lKH2PO4,9.4g/lK2HPO4,5.04g/1甘油)中来制备接种物。在以200rpm振荡的条件下在37°C下温育接种物大约12小时。然后将12000Dml用于接种51的容器。物理参数在整个发酵时间过程中连续地监控溶解氧、pH、搅拌速度和温度。收获使用提供有自来水(mainswater)的冷却套将容器冷却至10°C。将培养物收集入11离心罐(centrifugepot)，然后通过在SorvallRC3BPlus离心机中于4°C下以4500rpm离心20分钟来沉淀细胞。轻轻倒出上清液，然后用2%Tego2000消毒。然后在低于-70°C下冷冻细胞沉淀。分析在整个发酵时间过程中测量光密度(600nm)以获得生长动力学。沿着发酵的时间过程在几个时间间隔处沉淀已知量的细胞(即0D_xml)(1000Dml)。将这些样品于_20°C下贮存。使用Qiagen-SOOMaxi-pi^p试剂盒和方案(Qiagen)从这些细胞分离质粒。通过测量DNA在260nm处的OD来计算pDNA的浓度。由此，通过将PDNA浓度(yg/ml)除以样品的ODml数来计算培养物的个别质粒产量。对每一个发酵进行该计算，对每一个样品进行使用溴化乙锭染色的0.8%的琼脂糖凝胶电泳以定性显现pDNA。最终发现在发酵过程中40ml/小时的进料速度对于质粒产量(大约1μg/0Dml)是最适宜的。·pORT-RDD的纯化除非另外指出，否则所有缓冲盐和试剂购自VWRInternational(Leicestershire,UK)并且为分析级的(AnalaR)。使用纯化水和注射用水(WFI)级水(Hyclone，UK)制备所有缓冲液和消毒液。使用DU800分光光度计(BeckmanCoulter,UK)进行光密度测量。使用SorvallEvolutionRC(Kendro,UK)进行离心。在ECCSSU1214Turn&CastGel系统(VWRInternational,UK)中，使用ElectrophoresisPowerSupply600(AmershamBiosciences,UK)进行琼月旨糖凝胶电泳。QiagenPlasmidMaxi试剂盒的组分(Qiagen-tip500、缓冲剂QBT、QC和QF)(Qiagen5UK)用于裂解滴定法。细胞裂解和裂解物的澄清向101不锈钢容器中的冷冻的细胞沉淀(对于批次1，终浓度为120g/l，对于批次2为150g/l)中加入21细胞悬浮缓冲液，用不锈钢刮铲人工混合直至悬浮物表现为不含聚集物(aggregate)。通过将细胞与41裂解液(0.155MNaOH,1%SDS于20_22°C下)混合3分钟(对于批次1)和10分钟(对于批次2)来裂解细胞。向裂解物中加入21中和溶液(3M醋酸钾和IOmMEDTA，pH5.5)，同时温和地搅拌。然后使用500μm网袋过滤器(meshbagfilter)(L1NM500BBSS,Plastok,UK)和标称50μm、5μm和0·3μm深度的过滤器(KR50A05HH1、KR05A05HH1和KRK3A05TT1，Millipore,UK)来除去沉淀的细胞碎片。离子交换层析用354ml经纯化水清洗的FractogelEMDTMAE(MerckKGaA,Germany)将XK50/30层析柱填充至264.6ml的填充床体积，从而导致13.5cm(对于批次1)的床高。用370ml经纯化水清洗的FractogelEMDTMAE(MerckKGaA,Germany)将批次2±真充至254.8ml的填充床体积，从而导致13.Ocm(对于批次2)的床高。通过使用2.5ml的丙酮来对填充介质进行填充试验，从而导致1.65和1.35(分别对于批次1和2)的可接受的不对称值(Asymmetryvalue)0然后用两倍柱体积的0.5MNaOH对介质进行消毒，接触时间超过1小时。然后泵入平衡缓冲液使之通过柱子直至流出物的PH已达到彡8.5。用6312.5ml(批次1)和6393.3ml(批次2)的澄清的原料(feedstock)装载柱子，以IOOcm/小时的恒定线流速度运行。在通过以IOOcm/小时的流速使用洗脱缓冲液来回收pDNA之前，重新使用平衡缓冲液洗掉未结合的和污染的材料。通过切向流过滤进行的离子交换后的中间产物的浓缩使用MilliporeLabScaleTFF系统，该系统适配有新型50cm2，30kDa再生纤维素PelliconXL膜(Millipore，UK)。使用纯化水清洗系统和膜，进行10分钟，然后使用离子交换洗脱缓冲液进行平衡(2X500ml，10分钟)。将离子交换后的pDNA溶液轻轻倒入贮器。在应用15psi的跨膜压力差之前，打开泵，并且让系统运行10分钟。连续充注贮器直至所有洗脱的材料已被加入并且体积减小至大约2mg/mlpDNA的最终标称浓度。然后在最终的缓冲液漂洗之前从系统引流出浓缩物，确保从膜回收最大量的PDNA。计算漂洗缓冲液的体积以获得lmg/ml的终pDNA浓度。在使用之间，用纯化水清洗系统和膜。然后用水漂洗系统，并将其贮存在0.IMNaOH中。离子对反相层析在该方法中使用包含大约850ml的Perfluorosorb-S介质的VS60层析柱(Millipore,UK)。通过泵入两倍柱体积的0.5MNaOH(接触时间超过1小时)来进行柱子和介质的消毒。然后在使用前平衡介质(直至PH达到7士0.2)。用69.Oml(批次1)和200.8ml离子交换后的TFF浓缩物装载柱子，然后以70cm/小时的恒定线流速度运行。然后在将洗脱缓冲液用于回收捕获的PDNA之前，向柱子中导入两倍柱体积的清洗缓冲液1和4倍柱体积的清洗缓冲液2来除去残留的内毒素、RNA和未结合的材料。收集洗脱峰，使用UV分光光度法分析洗脱峰以测定回收的PDNA的浓度。通过切向流过滤进行的浓缩/渗滤以及产品配制如之前所述制备系统。连续充注贮器直至所有pDNA溶液都已加入。当pDNA溶液被浓缩至需要的浓度后，立即针对配制缓冲液(formulationbuffer)(IOmMTris碱、ImMEDTA.0.9%w/vNaClpH7.5)进行渗滤，直至渗透物(permeate)的pH和导电率等于渗滤缓冲液。然后在2x缓冲液漂洗之前从系统引流出经渗滤的浓缩物，确保从膜回收最大量的pDNA。使用0.2μm过滤器过滤回收的pDNA等分，然后在无菌条件下将其注入无菌冷冻管。纯化方法概述于表1中。表1纯化概要表pORT-RDD细胞裂解<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>阴离子交换层析<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>·用于悬浮缓冲液变换的DNA沉淀表2用于DNA沉淀的混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>制备两管各上述混合物，将其于_20°C下温育过夜。以12000rpm，4°C离心混合物30分钟。弃去上清液，加入乙醇70%。对溶液进行离心，弃去上清液。干燥沉淀，然后使用25μ1无菌NaCl0.9%(1个管)或25μ1无菌IOmMTris-ImMEDTA-NaCl0·9%、ρΗ7·5(称为TE-NaCl)(另一个管)重悬浮沉淀。DNA浓度通过26(V280nm处的光密度读数来测量。按照之前的转染方案转染pORTlaCMV-NaCl、ρORTlaCMV-TENaCl,pORT-RDD-NaCl和pORT-RDD-TENaClDNA，每质粒6个孔。进行该实验一次。·RDDWestern印迹法按照经设计用于增殖测定的方案，将人C9黑素瘤细胞涂布在24孔板(60，000个细胞/孔)中，然后用1μg质粒和LipofectaminePlus试剂(GibcoLifetechnologies)进行转染。在于无血清培养基中进行4小时的转染后，用补充有10%血清的培养基更换转染上清液。在转染后72小时收集上清液。对于细胞提取物，通过刮擦收集细胞，然后将其与50μ1裂解缓冲液(10mlRIPA缓冲液+1个抗蛋白酶完全小片(antiproteaseCompleteminitablet)[ref.11836153，Rochel)一起温育30分钟。在以10OOOrpm离心10分钟后，将裂解物等分并且在-80°C下贮存。利用Bradford测定法测定各上清液的蛋白质浓度。通过将18μ1上清液或18μ1PBS中的30μg的总蛋白(对于提取物)与6μ1NuPageLDS样品缓冲液4Χ(ΝΡ0007，Invitrogen)和2.5μ1NuPage样品还原剂(ΝΡ0004，Invitrogen)混合来进行Western印迹。将样品在70°C下加热10分钟。按照NuPageNovex方案将样品装载在NuPageNovexBis_Trisl2%凝胶(NP0341B0X,Invitrogen)上，然后在MOPSSBS缓冲液中进行迁移。使用转移缓冲液Tris48mM_甘氨酸39mM_SDS0.037%-甲醇20%在硝酸纤维素膜OptitranBA-S850，22μ(Schleicher&Schuell)上进行半干转移(semi-drytransfer)，然后在4°C下在PBS-5%牛奶(印迹级封闭剂(blottinggradeblocker)脱脂奶粉，ref170-6404,BioRad)中封闭过夜。用PBS-0.1%Tween20清洗膜，然后将其与在PBS-0.1%Tween20-2%牛奶中稀释至12000的一抗Neosystem抗血清一起在室温下温育1个半小时。在清洗后，将膜与在PBS-0.Tween20-2%牛奶中稀释至15000的HRP驴抗兔IgG(NA934，Amersham)一起在室温下温育1小时。清洗膜并用ECL(RPN2209，Amersham)显现。·统计分析使用SigmaStat3.1软件进行所有统计分析。学生氏t检验(studentttest)用于比较在用对照质粒或RDD质粒转染后存活细胞的百分数。ρ值<0.05被认为是显著的。·结果由poRT-RDD质粒驱动的RDD的分泌在pORT-RDD转染的细胞的细胞提取物和上清液中都在预期的大小(IOkDa)处特异地检测到条带。然而，在pVAX-RDD转染的细胞的上清液中未检测到RDD肽。因此，与来自pVAX载体的经典CMV启动子相比，来自pORT载体的完全CMV-内含子A启动子诱导更强的AMEP肽的产生和分泌。在pORT-RDD转染后C9增殖的抑制为了证明从pORT-RDD产生的RDD肽的抗增殖活性，在细胞转染后建立增殖测定。也将新型pORT-RDD质粒与用作阳性对照的组成型质粒pVAX-RDD相比较。该实验的结果示于表3中。表3:携带RDD的质粒与对照质粒的C9抗增殖活性的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>与pORTlaCMV对照质粒转染相比，pORT-RDD转染显著地抑制了C9黑素瘤细胞增殖达65.5%(学生氏t检验ρ<0.001)。该抑制是极具可再现性的，因为对于两个实验都获得该相同的结果。在相同的条件下，PVAX-RDD质粒转染不能抑制C9增殖。DNA重悬浮缓冲液的作用将pORT-RDD质粒悬浮于IOmMTris-ImMEDTA-150mMNaCl,pH7.5(TENaCl)中。为了了解EDTA是否可干扰RDD活性，测定在TENaCl或生理血清(physiologicserum)(NaCl0.9%)中制备的pORT-RDD质粒的抗增殖活性。表4使用两种DNA重悬浮缓冲液进行的C9增殖测定<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>无论对于哪一种重悬浮缓冲液，都获得了C9细胞的强增殖抑制。差异未达到统计学显著性(p=0.291，学生氏t检验)。这表明Tris和EDTA都不干扰AMEP的活性。在pORT-RDD转染后B16F10增殖的抑制为了证明pORT-RDD对黑素瘤细胞的抗增殖活性，用基于pORTlaCMV的质粒转染鼠B16F10黑素瘤细胞，然后进行MTT增殖测定。表5:B16F10增殖测定(两个实验的平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>与pORTlaCMV对照质粒转染相比，pORT-RDD转染显著地抑制了B16F10细胞的增殖达74.5%(学生氏t检验ρ<0.001)。综合起来，这些结果证明pORT-RDD质粒比经典的pVAX-RDD质粒更有效地诱导AMEP肽的强产生和分泌，以及抑制黑素瘤细胞(人C9和鼠B16F10)的增殖。此外，该抗增殖效应不依赖于用于制备DNA的重悬浮缓冲液。TENacl缓冲液中包含的EDTA不干扰该活性。实施例3单次pORT-RDD瘤内电转移在皮下B16F10黑素瘤中的抗肿瘤功效的研究本研究的目的是调查与空对照pORTlaCMV载体相比，新型pORT-RDD质粒在预先建立的皮下B16F10肿瘤中的单次有疗效的瘤内电转移的功效。通过肿瘤体积的监控来评估对肿瘤生长的效应。·材料和方法细胞系和培养条件将B16F10黑素瘤细胞在37°C下于增湿的5%CO2大气中培养于补充有10%的热灭活的胎牛血清、1.5g/l碳酸氢钠和抗生素(100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素；InvitrogenGibco,ref15140—122)的Dulbecco，sModifiedEagles'Medium+GlutaMAX中。从单个小瓶产生多瓶冷冻的细胞并且将其保持在液氮中。取决于汇合率(confluenceratio)，如实施例2中所描述每周传代培养细胞两次或三次。动物由Janvier(LeGenest-St-Isle，France)提供雌性6至8周龄的C57BL/6小鼠。所有动物实验按照动物实验的伦理指导原则(Directiven°86/609CEE)来进行并且经BioAlliancePharma伦理委员会批准。在肿瘤细胞植入前使动物在进行实验的区域适应新环境，进行至少4天。将动物在温度(21°C)、光周期(12h光照/12h黑暗)和空气交换(airexchange)(每小时12次换气(airrenewal))的受控条件下供养于室内。湿度保持在30至70%之间。在无特定病原体条件下供养动物，持续监控室温和湿度。统计分析使用SigmaStat3.1软件进行所有统计分析。为了比较两个组，当成功地通过正态性和等方差性检验(normalityandequalvariancetest)时，软件运行学生氏t检验。如果这些检验中的一个检验失败，软件运行Marm&Whitney秩和检验。对于每一个分析，用户自由接受每一个统计检验。P值<0.05被认为是显著的。·实验研究设计和治疗细胞注射在注射入小鼠之前，使B16F10细胞保持在培养物中直至5代。在注射当天前48h传代培养细胞。用PBS漂洗亚汇合的B16F10细胞，然后将其与胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)一起温育直到细胞脱落。加入新鲜培养基，以1200rpm离心细胞，进行5分钟，然后将其重悬浮于25ml新鲜培养基中。在0.04%台盼蓝中对细胞进行计数用于成活力定量(viabilityquantification)0将细胞离心，然后重悬浮于足够体积的0.9%NaCl(Versol,LaboratoireAguettant,Lyon,France)中以在100μ1中具有IO6个B16F10细胞(在PBS缓冲液中细胞死亡率更高)。通过SC途径在小鼠的右胁腹上注射ΙΟΟμ1细胞。在细胞注射的前一天，先用电动剃刀剃除小鼠胁腹上的毛。质粒的电转移(第O天)在细胞接种后7天首次检查肿瘤体积。此时，一些肿瘤已良好地建立，然后将它们用于此类第一组。为了在第O天最大限度地限制肿瘤体积的差异性，对第一组14只小鼠(p0RTlaCMV，7只和p0RT_RDD，7只)进行电转移，两天后，对第二组7只小鼠(p0RTlaCMV，3只和pORT-RDD，4只)进行电转移。质粒的稀释每个肿瘤施用在50μ1无菌缓冲液中的50μg质粒。如下在无菌条件下用无菌缓冲液(IOmMTris,ImMEDTA，0.9%NaCl，pH7.5)进行质粒的稀释第一组:p0RTIaCMV用436μ1TE-NaCl稀释364μ1的2.2μg/μ1的pORTIaCMV；pORT-RDD用392μ1TE-NaCl稀释408μ1的1.96μg/μ1的pORT-RDD。第二组P0RTlaCMV由于少量的对照质粒，将用于第一组的稀释物在_20°C下保持冷冻，并且重新用于第二组注射；pORT-RDD用196μ1TE-NaCl稀释204μ1的1.96μg/μ1的pORT-RDD。研究设计给携带皮下B16F10肿瘤的C57BL/6雌性小鼠分配下列组号表6被治疗的小鼠的组<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在麻醉前测量肿瘤。通过腹膜内注射0.2ml包含0.5ml甲苯噻嗪2%(Rofflpun，Bayer)、2.Oml氯胺酮50mg/ml(Ketalar；Panpharma,Fougeres,France)、7·5mlNaCl0.9%的氯胺酮/甲苯噻嗪混合物来麻醉动物。电转移治疗由50μg的在50μ1TE-NaCl缓冲液中的质粒的单次瘤内注射组成。选择该剂量是因为其相应于实验室和电转移文献中通常使用的剂量。将导电膏(Conductivegel)用于肿瘤上。注射后立即按照下列方案使用Cliniporator装置，通过在肿瘤上使用相距5mm的两个不锈钢板电极来应用电脉冲-HV=1500V/cm,100μs,IHz,1个脉冲-间歇=IOOOms-LV=140V/cm,400ms,1个脉冲。肿瘤体积的监控和肿瘤生长的研究在电转移后第0、2、5、7、9、12和14天，通过用数字测径器测量两个垂直直径来监控肿瘤大小。按照公式(长度+宽度/2)3Χπ/6来计算肿瘤体积。在实验过程中未对小鼠称重。在实验过程中记录死亡的小鼠。基于以mm3表示的肿瘤体积或V/V0比(即第D天的体积/第0天的体积)已建立了肿瘤生长曲线。如下计算肿瘤生长的抑制抑制100X[1-(治疗组的肿瘤体积/对照组的肿瘤体积)]。·结果死亡率在实验过程中观察到自然死亡(第7天P0RTlaCMV，笼子_1；pORT-RDD,笼子_2；和pORT-RDD，笼子-3)。该死亡率与治疗没有明确的联系。经常在B16F10模型中观察到自然死亡。肿瘤体积的监控所有肿瘤的肿瘤体积结果概述于表7中和示于图4中。以mm3表示的所有肿瘤的肿瘤体积的监控Λ_O_2_5_7_9_1214PORTlaCMV平·59.2687.93178.02279.02338.89640.13864.31_SD14.1331.56103.36201.88216.33454.42571.78pORT-RDD平■56.0380.99104.11130.28221.48409.07642.71_SD18.6516.5240.9129.9776.86132.96182.96揪'J%_7.941.553.334.636.125.6SigmaStatStudentρ=_0.6620.5290.0410.0260.1440.1630.285在治疗的当天，经pORTlaCMV治疗的肿瘤大小在40.19mm3至84.76mm3(平均体积59.26士14.13mm3)之间，经pORT-RDD治疗的肿瘤大小在33.51mm3至89.51mm3(平均体积56.03士18.65mm3)之间。在第7天，在pORTlaCMV对照组中，肿瘤体积达到279.02士201.88mm3，在pORT-RDD治疗组中肿瘤体积达到130.28士29.97mm3，从而观察到53%的抑制(学生氏t检验ρ=0.026)。在第14天，在pORTlaCMV对照组中，肿瘤体积达到864.31士571.78mm3,在pORT-RDD治疗组中肿瘤体积达到642.71士182.96mm3，相应于26%的肿瘤生长抑制(非显著性的，学生氏t检验ρ=0.285)。在之前的研究中，按照相同的方案，对于在第0天<IOOmm3的肿瘤，在电转移后14天，pVAX-RDD和pBi-RDD质粒经显示分别抑制B16F10肿瘤的生长达20%和29%，但无任何统计学显著性。在电转移后7天，抑制小于19%。只针对小肿瘤的肿瘤体积在治疗的当天在选择小肿瘤后也进行结果分析。结果概述于表8中和显示于图6中。对于体积<50mm3的肿瘤，以mm3表示的肿瘤体积的监控Λ___O2_5_7_9_1214pORTlaCMV__平_50.1969.05144.07219.74308.59698.47971.85__SD7.6325.2289.06174.49212.44527.21648.95pORT-RDD__平M48.0575.6181.00121.42199.61363.18590.63__SD11.4911.0220.7629.8151.59107.45155.21鄉姊___43.844.735.348.039.2SigmaStatStudent_0.7050.5450.0950.1680.2130.1260.158经pORTlaCMV治疗的肿瘤大小在40.19mm3至59.73mm3(平均体积50.19士7.63mm3)之间，经pORT-RDD治疗的肿瘤大小在33.51mm3至65.45mm3(平均体积48.05士11.49mm3)之间。在第7天，在pORTlaCMV对照组中，肿瘤体积达到219.74士174.49mm3，在pORT-RDD治疗组中肿瘤体积达到121.42士29.81mm3。在第14天，在pORTlaCMV对照组中，肿瘤体积达到971.85士648.95mm3,在pORT-RDD治疗组中肿瘤体积达到590.63士155.21mm3。pORT-RDD瘤内电转移在电转移后抑制B16F10黑素瘤肿瘤的生长达45%(第7天)和39%(第14天)。但该差异未达到统计学显著性。只针对小肿瘤的V/V0比为了减少第0天的肿瘤体积的差异性的影响，将结果以V/V0比(第D天的体积/第0天的体积)表示。结果示于表9和图7中。对于体积彡50mm3的肿瘤的V/V0比<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在第7天，在pORTlaCMV对照组中，肿瘤体积比达到4.69士3.08mm3,在pORT-RDD治疗组中达到2.55士0.39mm3。在第14天，在pORTlaCMV对照组中，肿瘤体积比达到20.95士11.87mm3,在pORT-RDD治疗组中达到12.54士3.01mm3。如原始数据(表9)中所描述的，在第5天至第14天保持至少40%的肿瘤生长抑制，在第12天具有50%的最大抑制。在第9和12天获得统计学显著性。综合起来，这些结果表明pORT-RDD质粒显得比之前的质粒更有效，特别是在转移后7天。如果肿瘤在治疗的当天是小肿瘤(33.51mm3至65.45mm3)，那么该抑制效应更重要。pORT-RDD瘤内电转移在电转移后抑制B16F10肿瘤的生长达45%(第7天)和39%(第14天)。但该差异未达到统计学显著性。该最后一点可通过每组小鼠的减少的数目(pORTlaCMVη=6，和pORT-RDDn=7)来解释。此外，观察到的pORT-RDD治疗组的减少的标准差很可能与RDD因子的抗肿瘤效应相关。事实上，已大体上清楚，抗血管生成抗肿瘤因子对于小肿瘤更有效。因此，对于进一步实验，为了治疗小的并且经校准的(calibrated)肿瘤，可能必须在早于接种后7天检查肿瘤的体积。此外，在生理血清中制备B16F10细胞后观察到高细胞死亡率。为了限制该细胞死亡率，可测定其他重悬浮缓冲液例如无血清培养基。然而，根据该第一实验，可得出pORT-RDD质粒瘤内电转移抑制预先建立在C57BL/6小鼠上的B16F10黑素瘤肿瘤的肿瘤生长，其功效比基于pBi和pVAX的载体更高。实施例4在皮下B16F10肿瘤中进行pORT-RDD的单次瘤内电转移的剂量范围的评估本研究的目的是调查与媒介物电穿孔相比，不断增加的剂量的pORT-RDD质粒在皮下预先建立的B16F10黑素瘤肿瘤中进行单次瘤内电转移后的抗肿瘤功效。为此，肿瘤体积包括在30至50mm3之间，治疗6个组1)媒介物(IOmMTrisUmMEDTA、0.9%NaCl、pH7.5无菌缓冲液)、2)25μg、3)50μg、4)100μg、5)200μg禾口6)400μg治疗性pORT-RDD质粒。在电转移治疗后监控肿瘤体积至少14天。·实验研究设计和治疗细胞注射在注射入小鼠之前，将B16F10细胞保持在培养物中直至6代。在注射当天前48h传代培养细胞。用PBS漂洗亚汇合的B16F10细胞，然后将其与胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)一起温育直至细胞脱落。加入新鲜培养基，以1200rpm离心细胞，进行5分钟，然后将其重悬浮于25ml新鲜培养基中。在0.04%台盼蓝中对细胞进行计数用于成活力定量。将细胞离心，然后重悬浮于足够体积的0.9%NaCl(Versol,LaboratoireAguettant,Lyon,France)中以在100μ1中具有IO6个B16F10细胞。通过SC途径在小鼠的右胁腹上注射100μ1细胞。在细胞注射的前一天，用电动剃刀剃除小鼠的胁腹上的毛。质粒电转移在细胞接种后6天，将小鼠随机分配至pORTlaCMV、pVAX或pORT-RDD组。以50μ1中25-50-100-200-400μg的量注射不断增加的剂量的质粒，从而导致不断增加的浓度0.5-l-2-4-8mg/ml的质粒制剂。研究设计当肿瘤达到30至50mm3时，选择C57B1/6小鼠进行治疗。然后在3个不同的日期中进行治疗，将准备好的小鼠随机分配入各治疗组表10被治疗的小鼠的组<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>在麻醉前测量肿瘤。通过腹膜内注射0.2ml包含0.5ml甲苯噻嗪2%(RompUn,Bayer)、2.0ml氯胺酮50mg/ml(Ketalar；Panpharma,Fougeres,France)、7.5mlNaCl0.9%的氯胺酮/甲苯噻嗪混合物来麻醉动物。电转移治疗由不断增加的剂量的在50ylTE-NaCl缓冲液中的质粒的瘤内注射组成。将导电膏用于肿瘤上。注射后立即按照下列方案(之前用于PVAX-RDD瘤内实验)使用Cliniporator装置，通过在肿瘤上使用相距5mm的两个不锈钢板电极来应用电脉冲-HV=1500V/cm,100us,1Hz,1个脉冲-间歇=1000ms-LV=140V/cm,400ms,1个脉冲。动物监控和杀死肿瘤体积的监控在电穿孔治疗后，在治疗后第0、2、5、7、9、12、14天，通过用数字测径器测量两个垂直直径(最长和最大的直径)来监控肿瘤大小。按照公式(长度+宽度/2)3Xji/6来计算肿瘤体积。基于以mm3表示的肿瘤体积已建立了肿瘤生长曲线。如下计算肿瘤生长的抑制抑制100X[1-(治疗组的肿瘤体积/对照组的肿瘤体积)]。体重的监控在细胞注射前一天记录动物的体重，然后在与进行肿瘤体积监控相同的日期记录动物的体重。自然死亡的监控记录实验过程中的自然死亡。在实验过程中，通过C02吸入杀死显示痛苦(恶病质、虚弱和难以运动)的体征并且比它们的初始体重减少超过20%的动物。在实验结束时(第14天)通过C02吸入杀死小鼠。统计检验使用SigmaStat3.1软件进行所有统计分析。软件运行学生氏t检验来比较两个组，运行AN0VA检验来比较所有组。p值<0.05被认为是显著的。结果死亡率在实验过程中观察到自然死亡，杀死显示痛苦体征的动物。在第14天，存活率是缓冲液组中为22.2%(9只中7只死亡/被杀死)、25iig组中为55.6%(9只中4只死亡/被杀死)、50iig组中为66.7%(9只中3只死亡/被杀死)、100iig组中为90%(10只中1只死亡/被杀死)、200ug组中为77.8%(9只中2只死亡/被杀死)、400ug组中为77.8%(9只中2只死亡/被杀死)。该死亡率与肿瘤的发展相关。未经治疗的和低剂量治疗的肿瘤都显示最高的死亡率。体重的改变在组之间的体重上未观察到显著的差异。第12天的缓冲液组中的少量减少可通过当时被杀死的一只小鼠的体重的损失来解释。肿瘤体积的监控的比较两个操作者在监控的每一天测量各肿瘤的两个垂直直径。在由每一个操作者测量的肿瘤体积之间观察到非常小的差异。治疗对肿瘤体积的效应将来自一个操作者的肿瘤体积的测量用于分析。结果示于图8中。与对照肿瘤相比，观察到经pORT-RDD治疗的肿瘤的生长的剂量依赖性抑制。抑制在第7天最大，特别地对于200yg的剂量具有80.3%的抑制表11经pORT-RDD治疗的肿瘤的生长的剂量依赖性抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在第7天后，所有肿瘤再次生长，特别是经对照、25和50yg治疗的肿瘤。由于小鼠数目太少(自第12天开始观察到高死亡率)，对照肿瘤生长曲线在第14天减少。统计分析(单因素方差分析)显示对于pORT-RDD治疗组在第5、7和9天抑制高度显著(P<0.001)。通过学生氏t检验进行的两两比较(two-and-twocomparison)显示在100、200和400ug组之间不存在统计学显著性。在第12天，由于肿瘤的再生长，在单因素方差分析后获得统计学显著性。但是，学生氏t检验分析显示对于50和200yg剂量的比较，达到了统计学显著性。在用于之前研究的初始方案中，施用单剂量的50yg的pORT-RDD质粒。这导致最多50%的肿瘤生长抑制。已决定估计不断增加的剂量的质粒的抗肿瘤效应。综合起来，pORT-RDD质粒的瘤内电转移以剂量依赖的方式显著抑制在C57BL/6小鼠上预先建立的B16F10黑素瘤肿瘤的生长。200iig的剂量表现为治疗50mm3肿瘤的最有效剂量，因为与缓冲液、25和50iig组相比较，我们获得最高的抑制和最好的显著性。该剂量相应于4ug/mm3肿瘤。此外，治疗不诱导任何毒性效应，即使以最高的剂量(400yg)治疗时亦如此，因为死亡率和体重不受影响。实施例5pORT-RDD质粒在皮下B16F10肿瘤中的重复瘤内电转移的评估实施例4中描述的剂量范围实验显示与25、50、100和400iig的剂量相比，200iigpORT-RDD质粒的单次瘤内电转移是最有效的剂量，其在电转移后第7天对皮下黑素瘤B16F10肿瘤的生长具有大约80%的抑制(p<0.001)。在该时间后，肿瘤再次生长。这些结果促使估量重复治疗对肿瘤生长的益处。因此，本研究的目的是调查在第0天和第7天的重复治疗的抗肿瘤功效。治疗由在第0天和第7天的200ugpORT-RDD质粒在预先建立的B16F10黑素瘤肿瘤中的瘤内电转移组成，所述肿瘤的体积在第一次治疗时包括在30至50mm3之间。已确定三组小鼠1)媒介物(10mMTrisUmMEDTA、0.9%NaCl、pH7.5无菌缓冲液)、2)pORT-RDD单次注射、3)pORT-RDD重复注射。实验研究设计和治疗细胞注射在注射入小鼠之前，将B16F10细胞保持在培养物中直至5代。在注射的当天前48h传代培养细胞。在细胞接种的当天，用PBS漂洗亚汇合的B16F10细胞，然后将其与胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)一起温育直至细胞脱落。加入新鲜培养基，以1200rpm离心细胞，进行5分钟，然后将其重悬浮于25ml新鲜培养基中。在0.04%台盼蓝中对细胞进行计数用于成活力定量。将细胞离心，然后重悬浮于足够体积的0.9%NaCl(Versol,LaboratoireAguettant,Lyon,France)中以在100u1中具有106个B16F10细胞。通过SC途径在小鼠的右胁腹上注射100ill细胞。在细胞注射的前一天，用电动剃刀剃除小鼠胁腹上的毛。质粒的制备以50ill注射200ug的质粒，导致通过乙醇沉淀pORT-RDD质粒，然后将其重悬浮于10mMTris,lmMEDTA,0.9%NaCl,pH7.5无菌缓冲液来产生0.4yg/yl的质粒制剂。研究设计研究包括50只在它们的右胁腹上携带30至50mm3的肿瘤的C57BL/6雌性小鼠。随机确定治疗分配并且治疗分配如下表12被治疗的小鼠的组CN101802186A说明书29/40页<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*由于太大的肿瘤大小，对于对照组不进行第二次治疗。在第7天，不再可能将肿瘤插入板电极之间。电转移方案通过腹膜内注射0.2ml包含()5ml甲苯噻嗪2%(RompUIl，Bayer)、2.0ml氯胺丽50mg/ml(Ketalar；Panpharma,Fougeres,France)禾口7.5mlNaCl0.9%的氣胺丽/甲苯噻嗪混合物来麻醉动物。第0和7天的治疗由200iig的在50illTE-NaCl缓冲液中的质粒的瘤内注射组成。将导电膏用于肿瘤上。注射后立即按照下列方案使用Cliniporator装置，通过在肿瘤上使用相距5mm的两个不锈钢板电极来应用电脉冲-HV=1500V/cm,100us,1Hz,1个脉冲-间歇=1000ms-LV=140V/cm,400ms,1个脉冲。第0天相应于电转移治疗的第1天。动物的监控和杀死通过用数字测径器测量两个垂直直径来监控肿瘤大小。按照公式(长度+宽度/2)3Xji/6来计算肿瘤体积。如下计算肿瘤生长的抑制抑制100X[1-(治疗组的肿瘤体积/对照组的肿瘤体积)]。结果首先，证明了使用pORT-RDD质粒的两次瘤内电转移是安全的并且被动物良好地耐受，因为未观察到对小鼠体重和死亡率的影响。最重要的是，在第12天，重复的瘤内电转移诱导了与媒介物组(称为TE)相比，97%的肿瘤生长抑制，和与pORT-RDD单次组(称为pORT-RDDIX)相比，76.7%的抑制，如图9和表13中显示的。表13肿瘤生长抑制的百分数<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>此外，完全的肿瘤消退在第9天开始出现，在第21天达到40%的完全消退(表14)。这些消退在第一次治疗后保持达80天。表14完全肿瘤消退的百分数<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>综合起来，最佳的治疗方案可确定为在第0和7天使用200yg(对于50mm3-肿瘤)的最佳pORT-RDD剂量进行的两次连续瘤内电转移。实施例6皮下B16F10黑素瘤肿瘤中单次pORT-RDD瘤内电转移的抗肿瘤和抗血管生成功效的研究本发明的目的是调查与媒介物相比，pORT-RDD质粒在预先建立的皮下B16F10肿瘤中的单次有疗效的瘤内电转移的功效。通过使用多普勒超声检查进行的肿瘤体积和肿瘤血管监控来估量对肿瘤生长的作用。材料和方法细胞系和培养条件将B16F10黑素瘤细胞在37°C下于增湿的5%C02大气中培养于补充有10%的热灭活的胎牛血清、1.5g/l碳酸氢钠和抗生素(100UI/ml青霉素和lOOyg/ml链霉素；InvitrogenGibco,ref15140—122)的Dulbecco，sModifiedEagles'Medium+GlutaMAX中。动物由Janvier(LeGenest-St-Isle，France)提供雌性6至8周龄的C57BL/6小鼠。所有动物实验按照动物实验的伦理指导原则(Directiven°86/609CEE)来进行并且由BioAlliancePharma伦理委员会批准。在肿瘤细胞植入前使动物在进行实验的区域适应新环境至少4天。将动物在温度(21°C)、光周期(12h光照/12h黑暗)和空气交换(每小时12次换气)的受控条件下供养在室内。湿度保持在30至70%之间。统计检验使用SigmaStat3.1软件进行所有统计分析。为了比较两个组，当成功地通过正态性和等方差性检验时，软件运行学生氏t检验。如果这些检验中的一个检验失败，软件运行Marm&Whitney秩和检验。对于每一个分析，用户自由接受每一个统计检验。p值<0.05被认为是显著的。实验研究设计和治疗细胞注射在注射的当天前48h传代培养B16F10细胞。用PBS漂洗亚汇合的B16F10细胞，然后将其与胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)一起温育直到细胞脱落。加入新鲜培养基，以1200rpm离心细胞，进行5分钟，然后将其重悬浮于25ml新鲜培养基中。在0.04%台盼蓝中对细胞进行计数用于成活力定量。将细胞离心，然后重悬浮于足够体积的0.9%NaCl(Versol,LaboratoireAguettant,Lyon,France)中以在100u1中具有106个B16F10细胞。通过SC途径在小鼠的右胁腹上注射100ill细胞。在细胞注射的前一天，用电动剃刀剃除小鼠的胁腹上的毛。质粒的制备以50ill注射200yg质粒，导致通过乙醇沉淀pORT-RDD质粒，然后将其重悬浮于10mMTris，ImMEDTA，0.9%NaCl,pH7.5无菌缓冲液中来产生4.0ug/u1的质粒制剂。研究设计给携带皮下B16F10肿瘤的C57BL/6雌性小鼠分配下列组号表15被治疗的小鼠的组<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>质粒的电转移(第0天)通过腹膜内注射0.2ml包含()5ml甲苯噻嗪2%(Rompun,Bayer)、2.0ml氯胺酮50mg/ml(Ketalar；Panpharma,Fougeres,France)、7.5mlNaCl0.9%的氯胺酮/甲苯噻嗪混合物来麻醉动物。治疗由200iig的在50illTE-NaCl缓冲液中的质粒的单次瘤内注射组成。将导电膏用于肿瘤上。注射后立即按照下列方案使用Cliniporator装置，通过在肿瘤上使用相距5mm的两个不锈钢板电极来应用电脉冲-HV=1500V/cm,100us,1Hz,1个脉冲-间歇=1000ms-LV=140V/cm,400ms,1个脉冲。肿瘤体积的监控和肿瘤生长的研究使用配备两个线性探针(用于B模式和能量多普勒超声检查(更好的灵敏度和分辨率)的14MHz探针和在VRI模式(血管识别成像)中用于使用造影剂(contrastagent)的灌注检查的9MHz探针)的Aplio超声装置(Toshiba)进行所有监控。通过在第0天腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物以及通过在第1、2、3、4和7天进行异氟烷吸入来麻醉小鼠。肿瘤体积的监控通过在B模式中测量肿瘤的宽度、长度和深度来测定肿瘤的体积。B模式超声允许根据灰度等级描绘器官的形态和质地。在这样的B模式图像上，可测量肿瘤的大小，并且可根据低回声区的范围定性鉴别坏死。超声测量在于使用14MHz线性探针扫描时发现最大的横向和纵向肿瘤截面。针对小鼠身体，确定横向和纵向截面。在纵向截面上测量长度，在横向截面上测量宽度和深度。使用测径器直接在声谱仪(sonograph)上进行这些测量。记录和打印最大横向和纵向扫描。按照公式以mm3表示的体积=(长度X宽度X深度)/2来计算肿瘤体积。肿瘤血管的数目在多普勒能量模式中使用14MHz探针在横向和纵向截面上扫描各肿瘤，以将血管的数目计算入肿瘤体积。多普勒能量模式在色度上(与B模式图像叠加)显示了由血管腔中循环的红细胞反散射的超声能量。记录相应于通过连续探针位移(probedisplacement)进行的肿瘤扫描的视频序列(videosequence)，从而允许对整个肿瘤体积进行3D量化。由操作者事后审查这些序列以测定瘤内血管的数目。当这些像素重复发现于显示血流的连续追踪观察的连续肿瘤截面中时，这些彩色像素群(Colorpixelclot)被认为是瘤内血管的标志。然后将血管的平均数目计算为在横向截面和纵向截面中计数的血管的平均数目。结果肿瘤体积的监控与媒介物组相比，肿瘤体积被pORT-RDD治疗显著抑制达77.5%(第4天)和89.2%(第7天)(学生氏t检验，分别地p<0.001和p=0.006)(图10)。血管的监控与媒介物组相比，肿瘤血管的数目被pORT-RDD治疗显著抑制达70.(第4天)和78.(第7天)(学生氏t检验，分别地p<0.001和p=0.001)(图11)。综合起来，这些结果表明pORT-RDD的瘤内电转移显著抑制肿瘤血管的数目达78%，这与肿瘤生长的抑制相关。这些结果确认了解联蛋白片段对内皮细胞和黑素瘤细胞的双重活性。实施例7用于表征pORT-RDD质粒批次的体外功效测定法的开发黑素瘤细胞转染后的增殖测定法本研究的目的是开发基于使用不断增加的剂量的pORT-RDD质粒(也称为BA015-VCC-004)和LipofectaminePlus方案对黑素瘤细胞进行的转染的体外功效测定法。在转染后96小时用MTT试剂显示测定，以测定存活细胞的百分数。材料和方法poRT-RDD质粒在培养于LB培养基中的宿主株系DH1-0RT中产生pORT-RDD质粒，然后如之前所述纯化质粒。将质粒配制于10mMTrisUmMEDTA、0.9%NaCl、pH7.5中，然后在_20°C下保持冷冻。细胞系和培养条件将人C9黑素瘤细胞培养于补充有10%的热灭活的胎牛血清(InvitrogenGibco,ref10270-106)白勺Dulbecco’sModifiedEagles'Medium(DMEM+GlutaMAX,InvitrogenGibco,ref61965-026)中。将B16F10鼠黑素瘤细胞(ATCCCRL-6475)培养于补充有10%的热灭活的胎牛血清、1.5g/l碳酸氢钠(InvitrogenGibco,ref25080-060)的Dulbecco，sModifiedEagles'Medium+GlutaMAX中。将人451Lu黑素瘤细胞(ATCCCRL-2813)培养于2%肿瘤培养基中，所述培养基包含含有1.5g/l碳酸氢钠(InvitrogenGibco,Catno.25080-060)的MCDB153培养基(Sigma,M7403)和含有2mML-谷氨酰胺(Invitrogen，Catno.25030-024)的Leibovitz，sL-15培养基(Invitrogen，Catno.11415-049)的41的混合物，并且补充有0.005mg/ml牛胰岛素(Sigma，ref.I0516-5ML)、1.68mMCaCl2(Cambrex,Catno.CC-4202)和2%的热灭活的胎牛血清(Invitrogen，Catno.10270-106)。从单个小瓶产生多瓶冷冻的细胞，并且将其保持在液氮中。将细胞在37°C下于增湿的5%C02大气中进行每周2次的传代培养(对于C9细胞稀释度为110，对于B16F10细胞稀释度为115，以及对于451Lu细胞稀释度为1:4)。关于传代培养，除去培养基，用PBS漂洗，然后加入2ml(对于75cm2培养瓶)的胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)。让培养瓶在室温下静置直至细胞脱离。加入新鲜培养基，以1200rpm离心5分钟，然后抽吸出培养基，加入新鲜培养基，然后将细胞分配入新的培养瓶。转染和增殖测定法在转染的前一天，用每孔15000个B16F10细胞、30000个C9细胞或30000个451Lu细胞(于500yl中)准备24孔多孔板。在转染的当天(涂板后的第一天)，对细胞进行计数以确认每孔的细胞数目(至少前一天涂板的细胞数目)。细胞应当处于大约50%的汇合。在无血清培养基:DMEM(Invitrogen,Catno.61965-026)(对于B16F10和C9细胞)和Opti-MEM(Invitrogen,Catno.51985-026)(对于451Lu细胞)中制备转染样pBFIo转染不断增加的剂量的pORT-RDD质粒(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8、0.9、1.0、1.5和2.0iig/孔)，每个条件4个孔。对于所有DNA剂量，从单个DNA溶液(批次的110稀释物)制备样品。2u1Lipofectamine/5u1试剂Plus的比率被选择用来限制细胞毒性并且不随着不断增加的量的DNA而改变(如厂商方案中推荐的)。按照下列方案在无菌的5ml聚苯乙烯圆底管中制备转染混合物。通过用食指温和地轻打管的底部两次来进行振荡。-混合物制备平行地制备混合物混合物1:DNA/试剂Plus对于各实验，制备只包含试剂PlusTM/Lipofectamine培养基的管作为不含DNA的Lipofectamine对照。MM混合物1(DNA/试剂Plus)的制备-一般方案<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表17描述了详细的依赖于DNA体积的样品制备(稀释至0.196mg/mL的质粒批次的实例)。首先导入培养基，然后加入试剂Plus，最后加入DNA。Mdl混合物1(DNA/试剂Plus)的制备-详细的方案<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>混合物2:Lipofectamine对于所有转染条件制备1个管表18混合物2的制备<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>将各混合物在室温下温育15分钟。然后将预先复合的DNA(混合物1)和稀释的lipofectamine(混合物2)混合逐滴向混合物1中加入200u1混合物2(混合物1+2终体积=400u1)，从而制备复合的DNA。将具有不同量的DNA的每一个混合物在室温下温育15分钟。用无血清培养基500U1/孔清洗细胞。向混合物1+2中加入1600u1无血清培养基，从而获得用于4个孔的2ml的终体积。从细胞中除去无血清培养基，然后每孔加入500yl稀释在无血清培养基中的混合物1+2。逐个条件地(4个孔接着4个孔地)进行该步骤。在37°C、5%C02下精确地温育细胞4小时。然后用每孔750u1完全培养基更换转染混合物，并且将细胞在37°C、5%C02下温育96小时。±曾殖IlJ定的显现(Proliferationassayrevelation)在96小时温育后，用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑_2_基)_2，5_二苯基四氮唑溴化物)试剂显现存活细胞。将细胞与250iUPBS和25iilMTT(Sigma)(5mg/ml)—起温育。在于37°C下温育2小时后，加入250ill裂解缓冲液(20%SDS-33%二甲基甲酰胺-2%醋酸-0.025NHC1-0.05NNaOH)，进行过夜。将200yl的各样品分配入96孔板以在570nm处读取光密度。结果对于3个细胞系，观察到剂量依赖性细胞增殖抑制(图12、13和14)。实施例8:pORT-RDD质粒的冷冻干燥和体外评估为了能够注射高剂量的pORT-RDD质粒，已开发了能够提供pORT-RDD质粒的高浓度溶液的冷冻干燥法。冷冻-干燥方案按照下列冷冻-干燥方案，以每5ml玻璃瓶2mg的量将配制于lOmMTrisUmMEDTA，pH7.5中的40mgpORT-RDD与2%甘露醇和葡萄糖一起冷冻干燥。表19pORT-RDD质粒的冷冻-干燥方案温度持续时间压力冷冻*+20°C0-50°C1或2小时-50°C(板T°=-52°C)2小时+10°C3小时250iibars***升华*+10°C(板T°)12小时250iibars+20°C直至平衡250iiBars第二次干燥*+20°C(板T°)最长加小时50iiBars贮存+5°C通过琼脂糖凝胶电泳进行的质粒分析通过加入无菌0.9%NaCl在无菌条件下将一瓶质粒(2mg)重构至2mg/ml。在1%琼脂糖凝胶上分析1iigDNA样品(非冷冻干燥的和冷冻干燥的质粒)加水至10ii1加入1ill上样缓冲液装载在凝胶上并且迁移(平行地，1Kbladder,Invitrogen)将冷冻干燥的pORT-RDD重构的质粒的DNA质粒形式与pORT-RDD非冷冻干燥的质粒相比较。如图15中所示，在相同量的冷冻干燥的和非冷冻干燥的质粒迁移后在琼脂糖凝胶上未观察到可见的差异。不存在降解的迹象，存在等量的各质粒形式。通过细胞增殖测定进行的质粒分析为了证明冷冻-干燥法不影响pORT-RDD的生物活性，按照实施例7中描述的最优化的LipofectaminePlus方案，用不断增加的剂量的冷冻干燥的和非冷冻干燥的pORT-RDD质粒转染人C9和451Lu黑素瘤细胞。在转染后96小时，通过MTT试剂显现活细胞。结果示于图16和17中。批次3相应于非冷冻干燥的pORT-RDD质粒，批次4相应于冷冻干燥的质粒。对于两个细胞系在冷冻干燥的质粒和非冷冻干燥的质粒之间获得相似的抑制特征。因此，证明了开发的冷冻-干燥法对于质粒的完整性(因为没有观察到降解的迹象)和生物活性是安全的。冷冻干燥的和非冷冻干燥的批次经显示在转染后展示相当的对黑素瘤细胞增殖的抑制作用。综合起来，这些结果允许将冷冻_干燥法用于另外的pORT-RDD质粒批次。实施例9冷冻干燥的pORT-RDD质粒在皮下B16F10肿瘤中的单次瘤内电转移的评估本研究的目的是证明在其终制剂(于2%甘露醇-1%葡萄糖中冷冻_干燥的)中的并且以最佳的200ug的剂量施用的pORT-RDD质粒，以与非冷冻干燥的质粒相同的方式抑制B16F10肿瘤的生长。治疗由媒介物(TE-NaCl缓冲液)、冷冻干燥的安慰剂(2%甘露醇-1%葡萄糖的冷冻-干燥的溶液)或200iigpORT-RDD质粒(冷冻干燥的或非冷冻干燥的)在皮下预先建立的B16F10黑素瘤肿瘤中的单次瘤内电转移组成。为此目的，肿瘤体积包括在30至50mm3之间，并且治疗三个组1)媒介物、2)以4mg/ml通过沉淀制备的200ugpORT-RDD和3)以4mg/ml制备的200ug冷冻干燥的pORT-RDD批次。在治疗后的14天中监控肿瘤的体积。实验研究设计和治疗细胞注射在注射的当天前48h传代培养B16F10细胞。在细胞接种的当天，用PBS漂洗亚汇合的B16F10细胞，然后将其与胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)一起温育直至细胞脱落。加入新鲜培养基，以1200rpm离心细胞，进行5分钟，然后将其重悬浮于25ml新鲜培养基中。在0.04%台盼蓝中对细胞进行计数用于成活力定量。将细胞离心，然后重悬浮于足够体积的0.9%NaCl(Versol,LaboratoireAguettant,Lyon,France)中以在100u1中具有106个B16F10细胞。通过SC途径在小鼠的右胁腹上注射100ill细胞。在细胞注射的前一天，用电动剃刀剃除小鼠的胁腹上的毛。39质粒的制备对于用非冷冻干燥的质粒注射的组，以50ill注射200ugpORT-RDD质粒，导致通过乙醇沉淀，然后重悬浮于10mMTris，lmMEDTA,0.9%NaCl,pH7.5无菌缓冲液来产生4.0ug/u1的质粒制剂。对于用重构的冷冻干燥的质粒注射的组，用无菌0.9%NaCl以4yg/yl重构需要的小瓶质粒。研究设计研究包括50只在它们的右胁腹上具有30至50mm3的肿瘤的C57BL/6雌性小鼠。随机决定治疗分配，且治疗分配如下表20被治疗的小鼠的组<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>电转移方案如之前所述麻醉动物。治疗由200iig的在50illTE-NaCl缓冲液中的质粒的单次瘤内注射组成。将导电膏用于肿瘤上。注射后立即按照下列方案使用Cliniporator装置，通过在肿瘤上使用相距5mm的两个不锈钢板电极来进行电脉冲应用-HV=1500V/cm,100us,1Hz,1个脉冲-间歇=1000ms-LV=140V/cm,400ms,1个脉冲第0天相应于电转移治疗的当天。动物的监控和杀死通过用数字测径器测量两个垂直直径来监控肿瘤大小。按照公式(长度+宽度/2)3Xji/6来计算肿瘤体积。如下计算肿瘤生长的抑制抑制100X[1-(治疗组的肿瘤体积/对照组的肿瘤体积)]。结果如图18和表21中所示，冷冻干燥的和非冷冻干燥的质粒显著抑制B16F10肿瘤生长。对于冷冻干燥的和非冷冻干燥的质粒获得相似的肿瘤生长曲线。最重要的是，在所有实验过程中，在非冷冻干燥的pORT-RDD和冷冻干燥的P0RT-RDD治疗组之间未观察到显著的差异。表21肿瘤牛长抑制的百分数<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>综合起来，这些结果证明冷冻-干燥法对于pORT-RDD质粒的生物活性是有效的。冷冻干燥的和非冷冻干燥的批次经显示展示相当的对B16F10皮下肿瘤生长的抑制效应。实施例10:pORT-RDD质粒的预防性肌内电转移对B16F10皮下肿瘤生长的功效的评估本研究的目的是测定当pORT-RDD质粒在肿瘤细胞的接种之前被电转移入小鼠肌肉时，其对B16F10皮下肿瘤生长的潜在预防性作用。治疗由在第1天在胫骨前肌中电转移400ugpORT-RDD质粒(每一个胫骨前肌中200i!g(于50iU中))组成。对照动物在相同的实验条件下接受媒介物。然后，在电转移治疗(第0天)后的第一天将肿瘤细胞注射入C57B1/6J小鼠的右胁腹。定期监控肿瘤的发生，然后定期监控肿瘤体积。实验研究设计和治疗质粒的制备以100ill的体积对每只小鼠注射400ug冷冻干燥的pORT-RDD质粒的总量(每一个胫骨前肌中50ill)。通过加入注射用水将无菌冷冻-干燥瓶中的质粒重构至4mg/ml。在注射期间在4°C下保持质粒悬浮液。研究设计研究包括30只C57BL/6J雌性小鼠。随机确定治疗分配，且治疗分配如下表22被治疗的小鼠的组<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>在电穿孔之前，通过腹膜内注射0.2ml氯胺酮/甲苯噻嗪混合物来麻醉动物。治疗由在小鼠的每一个胫骨前肌中肌内注射200iig的在50iU注射用水中的质粒，之后立即进行电穿孔组成。在腿上使用导电膏。注射之后立即按照下列方案使用Cliniporator装置，通过在腿上使用相距5mm的两块不锈钢板电极来进行电脉冲应用-HV=700V/cm(即350V),100us,1Hz,1个脉冲-间歇=1000ms-LV=100V/cm(即50V)，400ms,1个脉冲第1天相应于电转移治疗的当天。在肌内电转移的前一天，用电动剃刀剃除背部的毛。在治疗的当天，通过指刺纹(fingertattoo)鉴别小鼠，剃除腿上的毛。细胞注射在电转移治疗(第0天)后的第一天注射B16F10细胞。在注射入小鼠之前将B16F10细胞保持在培养物中直至8代。在注射的当天前48-72h传代培养细胞。在细胞接种的当天，用PBS漂洗亚汇合的B16F10细胞，然后将其与胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco，ref25300-096)一起在37°C下温育直至细胞脱落。加入新鲜培养基，以1200rpm离心细胞，进行5分钟，然后将其重悬浮于50ml新鲜培养基中。在0.04%台盼蓝中对细胞进行计数用于成活力定量。将细胞离心，然后重悬浮于足够体积的0.9%NaCl中以在100u1中具有106个B16F10细胞。通过皮下途径将100U1细胞注射入小鼠背部。动物的监控和杀死在B16F10肿瘤细胞注射(第0天)后，定期监控小鼠直至肿瘤可触知(大约第5天至第7天)。然后，通过用数字测径器测量两个垂直直径(最长和最大的直径)来定期监控肿瘤的体积。按照公式(长度+宽度/2)3XJi/6来计算肿瘤体积。如下计算肿瘤生长的抑制抑制100X[1-(治疗组的肿瘤体积/对照组的肿瘤体积)]。结果^23肿瘤生长抑制的百分数天678912141619pORT-RDD对媒介物75.9%35.1%35.9%34.5%25.1%28.7%33.6%28.7%P检验student0.07330.34430.14140.11350.10320.07560.00240.0315使用GraphPadPrism4.0软件进行统计分析。P值<0.05被认为是显著的。如图19和20中以及表23中所示，400iigpORT-RDD质粒的肌内电转移在第6天诱导了75.9%的肿瘤生长的抑制(与对照媒介物组相比)，并且从第7天开始直至研究结束诱导了大约25-35%的肿瘤生长的抑制。pORT-RDD治疗组和对照组之间在第6天上的该差异可通过治疗组中皮下肿瘤植入的延迟来解释。事实上，在实验的该时间点上，在小鼠中检测到更少的肿瘤(具有更小的体积)。42治疗组和对照组之间的差异在第16天(33.6%)和第19天(28.7%)是显著的(p值<0.05)。此外，如表24中所显示的，pORT-RDD质粒治疗显著减慢了B16F10皮下肿瘤的生长。事实上，与对照组相比，治疗组中达到1000mm3和2000mm3的肿瘤体积的平均时间减少。表24媒介物组和pORT-RDD质粒治疗组中1000mm3和2000mm3的皮下B16F10肿瘤的生长的平均时间<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>使用GraphPadPrism4.0软件进行统计分析。P值<0.05被认为是显著的。这些结果表明由于pORT-RDD的肌肉电转移而产生的全身性AMEP能够抑制B16F10肿瘤生长植入。以7天的间隔进行的重复肌肉电转移治疗能够增加该全身性保护效应。权利要求包含编码在强巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的完整或部分metargidin的解联蛋白结构域或其衍生物的序列的pORT质粒，其中所述序列被插入。2.权利要求1的质粒，其包含编码序列SEQIDNO1的metargidin的解联蛋白结构域或其变体的序列，在所述变体中一个或多个核苷酸被从SEQIDNO:1置换、添加、缺失，所述变体与SEQIDN01具有至少80%的序列同一性并且保持在体外和/或体内抑制内皮细胞增殖和/或抑制血管发生的能力。3.权利要求1或2的质粒，其包含编码metargidin的解联蛋白结构域(RDD)的序列，其中所述质粒具有SEQIDNO2中显示的序列。4.用权利要求1至3的任一项的质粒转化的宿主细胞。5.权利要求4的宿主细胞，其为大肠杆菌。6.权利要求4的宿主细胞，其为哺乳动物细胞。7.产生pORT-RDD质粒的方法，其包括由培养权利要求4至6的任一项的宿主细胞，和从培养的宿主细胞回收P0RT-RDD质粒组成的步骤。8.权利要求7的方法，其包括培养权利要求4或5的宿主细胞，并且其还包括通过下列步骤纯化pORT-RDD质粒(a)碱性裂解培养的宿主细胞；(b)网袋过滤；(c)阴离子交换层析；(d)浓缩；(e)离子对反相和尺寸排阻层析，和(f)过滤。9.从权利要求4或5的宿主细胞纯化pORT-RDD质粒的方法，该方法包括步骤(a)碱性裂解宿主细胞；(b)网袋过滤；(c)阴离子交换层析；(d)浓缩；(e)离子对反相和尺寸排阻层析，和(f)过滤。10.在哺乳动物细胞中体内或体外表达RDD肽的方法，该方法包括用pORT-RDD质粒转化所述哺乳动物细胞，由此在哺乳动物细胞中表达RDD肽。11.权利要求10的方法，其中哺乳动物细胞是肿瘤细胞。12.包含权利要求1至3的任一项的质粒和药学上可接受的载体的药物组合物。13.权利要求1至3的任一项的质粒用于治疗肿瘤的用途。14.权利要求13的用途，其中所述质粒意欲用于预防和/或治疗转移性肿瘤。15.权利要求13或14的用途，其中将所述质粒与肿瘤或肌肉细胞接触并且如下电刺激肿瘤或肌肉-首先，使用至少一个具有200至2000伏/cm的高电压(HV)场强的脉冲-其次，使用具有50至200伏/cm的低电压(LV)场强和300至2000ms的持续时间的单脉冲。16.权利要求15的用途，其中通过瘤内注射将所述质粒与肿瘤细胞接触。17.权利要求15的用途，其中通过肌内注射将所述质粒与肿瘤或肌肉细胞接触。18.权利要求15至17的任一项的用途，其中通过包括在300ms至3000s之间的时间间隔分开HV和LV脉冲。19.权利要求15至18的任一项的用途，其中如下电刺激肿瘤或肌肉-HV=1000-1600V/cm,50-200us,1个脉冲，1Hz-间歇:500ms至10sLV=100-200V/cm,300-800ms,1个脉冲。20.用于测定权利要求1至3的任一项的pORT-RDD质粒对肿瘤细胞增殖的体外抑制功效的方法，该方法包括步骤a)提供肿瘤细胞系的亚汇合培养物；b)用不断增加的量的根据本发明的pORT-RDD质粒或用对照分别转染步骤a)的细胞培养物；c)在适合于获得用对照转染的细胞的增殖的条件下培养步骤b)的被转染的细胞；d)对于每一个特定量的被转染的pORT-RDD质粒，测定与步骤a)中提供的细胞培养物中的细胞的数目相比，存活细胞的百分数，所述细胞培养物被提供用于用所述特定量的pORT-RDD质粒进行的转染；e)对于用对照转染的细胞，测定与步骤a)中提供的细胞培养物中的细胞的数目相比，存活细胞的百分数，所述细胞培养物被提供用于用所述对照进行的转染；由此如果步骤d)中计算的存活细胞的百分数低于步骤e)中计算的存活细胞的百分数，则pORT-RDD质粒被确定为具有抑制功效。21.制备冷冻干燥的pORT-RDD质粒的方法，该方法包括步骤a)将pORT-RDD质粒的溶液冷冻至_40°C至_60°C；b)升华步骤，其通过在200至300μbar的压力下将温度增加至+5°C至+15°C的温度，进行10至20小时的时间来进行；和c)第二干燥步骤，其在室温下，在200至300μbar下进行，直至pORT-RDD质粒达到室温，然后在30-70μbar下进行直至20小时。22.权利要求21的方法，其包括步骤a)在1至2小时内将pORT-RDD质粒的溶液从+20°C冷冻至_50°C，然后将温度保持在-50°C，进行2小时；b)升华步骤，其在+10°C下在250μbar的压力下进行3小时，然后在+10°C下进行12小时；c)在+20°C下进行直至20小时的第二干燥步骤。23.权利要求21或22的方法，其中所述pORT-RDD质粒的溶液包含甘露醇1.9-2.Omg/ml和葡萄糖4.8-4.9mg/ml。全文摘要本发明涉及包含编码在强巨细胞病毒启动子控制下的完整或部分metargidin的解联蛋白结构域(RDD)或其衍生物的序列的pORT质粒，特别地具有SEQIDNO2中显示的序列的质粒。文档编号C12N15/85GK101802186SQ200880013989公开日2010年8月11日申请日期2008年3月5日优先权日2007年3月6日发明者C·波奎特,S·勒拜尔-比内申请人:生物联合制药公司