使用带内质网定位信号的鞘酯△4-去饱和酶的转化细胞中的神经酰胺的制造方法

专利名称：使用带内质网定位信号的鞘酯△4-去饱和酶的转化细胞中的神经酰胺的制造方法
技术领域：
本申请主张基于2007年3月30日申请的日本专利申请2007-94762以及2007年6月12日申请的日本专利申请2007-155037的优先权。本发明涉及在酵母细胞内等的细胞内制造人型神经酰胺的方法。
背景技术：
皮肤的最外层，存在着具有保持水分的保湿功能和保护肌肤不受外界刺激的屏障 功能的称为角质层的组织。角质层由角质细胞和天然保湿因子、及细胞间脂质构成，其中， 特别是约占细胞间脂质一半的神经酰胺对上述功能起着极为重要的作用。例如，特应性皮 炎、老年性干皮病共通的特征是保湿功能显著降低，已知其主要原因是由于脂代谢酶异常 而引起的神经酰胺量的减少，且也已证实神经酰胺具有增强屏障功能 美白作用、抑制黑素 生成的作用。神经酰胺是可从外界补充的物质。J Invest Dermatol. 96 :523_526，1991 (非专利文献 1)、Arch Dermatol Res. 283 219-223，1991 (非专利文献2)中公开了《特应性皮炎、老年性干皮病中神经酰胺量 的减少》J Dermatol Sci. 1 :79_83，1990 (非专利文献 3)、Acta Derm Venereol. 74 337-340，1994(非专利文献4)中公开了《神经酰胺量的减少与脂代谢酶异常》；Contact Dermatitis. 45 280-285, 2001 ( # # ^lJ ^； K 5) > J EurAcad Dermatol Venereol. 16 587-594，2002 (非专利文献6)中公开了《神经酰胺的屏障功能的恢复》；且Cell Signal 14 :779-785，2002(非专利文献7)中公开了《通过神经酰胺抑制黑素生成》。近年来，其作为针对干燥敏感肌肤带来的皮肤疾病的治疗药物或化妆品·美容健 康食品的材料受到极大关注。实际上，作为化妆品、食品·营养补助食品等，配合了神经酰 胺的大量产品已有市售，且神经酰胺原料市场的规模有持续扩大的趋势。作为神经酰胺的原料，至今为止所使用的是来自牛等动物的原料，但因被指出有 传染病的问题，所以目前以米、小麦、大豆、薯类等的植物性神经酰胺为主流。最近的基础研 究[J. Clin. Invest. 112 1372-1382，2003 (非专利文献8)]已证实，神经酰胺的结构在皮肤 保湿·屏障功能上极为重要，而与人的神经酰胺结构不同的植物性神经酰胺是否是功能性 强的脂质还留有疑问。且因动植物中存在的神经酰胺为微量，其提取 精制较为困难，生产 率低、成本高，所以，强烈希望开发出可克服这些缺点的新的生产技术。如图1所示，已知神经鞘脂类合成·代谢途径中二氢神经鞘氨醇(DHS: dihydrosphingosine)生物合成后的反应在包括人的高等动物细胞和酵母之间有很大差 异。此外，在神经鞘脂类合成 代谢途径中，对于各个过程中起作用的各个酶蛋白质及编码 该蛋白质的基因，也已获得了一定程度的认识[Biochemistry. 41 :15105_15114. 2002 (非 专利文献 9) J Biol Chem. 277 :25512-25518，2002(非专利文献 10) ；Yeast 9:267-277， 1993 (非专利文献 11) J Biol Chem 272 :29704_29710，1997 (非专利文献 12) J Biol Chem 275 :31369-31378，2000(非专利文献 13) J Biol Chem 275 39793-39798，2000 (非专利文献14)] 。非专利文献1J Invest Dermatol. 96 :523_526，1991非专利文献2Arch Dermatol Res. 283 :219_223，1991非专利文献3J Dermatol Sci.1 :79_83，1990非专利文献4Acta Derm Venereol. 74 :337_340，1994非专利文献5Contact Dermatitis. 45 280-285,2001非专利文献6J Eur Acad Dermatol Venereol. 16 :587_594，2002非专利文献7Cell Signal 14:779-785,2002非专利文献8J. Clin. Invest. 112 1372-1382，2003非专利文献9Biochemistry. 41 :15105_15114· 2002非专利文献10J Biol Chem. 277 :25512-25518，2002非专利文献11Yeast 9 :267_277，1993非专利文献12J Biol Chem 272:29704-29710,1997非专利文献13J Biol Chem 275 :31369_31378，2000非专利文献14J Biol Chem 275 :39793_39798，2000非专利文献15EMBO J. 9 :3153_3162，1990非专利文献16J Cell Biol. 127 :653_665，1994非专利文献17Science. 263 :1629_1631，1994非专利文献18Cell. 79 :1199_1207，1994非专利文献19Eur J Cell Biol. 64 :211_216，1994
非专利文献20Annu Rev Cell Dev Biol. 12 :27_54，1996非专利文献21J Cell Biol. 127 :21_28，1994非专利文献22J Biol Chem. 273 :33273_33278，1998非专利文献23J Cell Biol. 152 :935-944，200
发明内容
发明要解决的课题植物性神经酰胺不仅与人的神经酰胺结构不同，而且生产率低。为了克服这些问题，人们迫切希望开发出能用酵母细胞等细胞来制造人型神经酰胺的新生产技术。解决课题的方法本发明者为了解决上述问题进行了潜心研究，结果想到了本发明。本发明开发通过巧妙地控制基因重组技术和真核生物的神经酰胺合成 代谢以及运送系统来高效地生产功能性高的人型神经酰胺的系统。因此，采用基因操作较容易且在 传统的食品制造中应用的芽殖酵母作为宿主。具体而言，以存在于人的角质层的且在其中分布量最多、对皮肤的保湿 屏障功能 极为重要的神经酰胺NS为目标。神经酰胺的结构由细胞所具有的酶的种类来决定，因生物 种不同而不同。作为宿主使用的芽殖酵母不具有合成高等动物的主要神经酰胺即神经酰胺 NS的酶。取而代之，宿主具有合成宿主特有的神经酰胺的酶。因此，为了采用酵母来合成神 经酰胺NS，必须抑制宿主自身的神经酰胺合成途径，并且向酵母导入必要的酶。具体地说，如图1所示，神经鞘脂类合成 代谢途径中二氢神经鞘氨醇(DHS)生物 合成后的反应，在包括人的高等动物细胞和酵母之间有很大差异。即芽殖酵母(酵母属) 中因不存在鞘脂Δ 4-去饱和酶基因(DESl)，所以不能合成DHS的C-4位上具有双键的人型 鞘氨基醇碱(鞘氨醇(sphingosine))(图2)。不同的是，通过二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶 基因(SUR2 :Sphinganine C4-hydroxylase gene)编码的酶使DHS的C-4位被羟化，合成植 物鞘氨醇(PHS)。之后，这些鞘氨基醇碱转换为神经酰胺。本发明者认为首先为了在酵母细胞内制造人型神经酰胺，重要的是使在酵母细胞 内不存在的鞘脂Δ 4-去饱和酶在酵母细胞内表达、以及完全或部分破坏二氢神经鞘氨醇 C4-羟化酶的酶活性。因此，首先想到了通过酵母的转化，1)制作上述SUR2基因阻断株，2) 在其突变株中导入人DESl基因。进而，通过使导入的酶在最佳部位定位，能增加神经酰胺NS的产量。神经酰胺NS 的合成中所需的二氢神经酰胺在酵母的内质网中合成。但是，据对人型鞘脂Δ4-去饱和酶 DESl蛋白质的C末端氨基酸序列的观察，没有发现酵母典型的内质网定位信号(例如，基于 双赖氨酸(dilysine-based) (KKXX或KXKXX)的序列)。因此，认为即使使人型鞘脂Δ 4_去 饱和酶DESl蛋白质在酵母中表达也不能高效地合成人型神经酰胺NS。本发明者认为为了更高效地生产人型神经酰胺，使作为酶的鞘脂Δ 4-去饱和酶DESl蛋白质在内质网定位的方法更有效。即，为了使DESl蛋白质在内质网定位，向酵母导 入通过在DESl蛋白质附加酵母典型的内质网定位信号而得到的鞘脂Δ4-去饱和酶基因 (DESlm)。通过使导入的酶在最佳部位定位，能增加神经酰胺NS的产量。因此，本发明提供在酵母细胞内制造人型神经酰胺的方法，其包括1)通过酵母细胞的转化，导入带内质网定位信号的鞘脂Δ4-去饱和酶基因 (DESlm)，该DESlm通过在鞘脂Δ4-去饱和酶基因(DESl)的3’末端添加编码酵母的内质 网定位信号的碱基序列而得到；及2)通过酵母细胞的转化，使酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因(SUR2)的表达缺失。本发明中，人型神经酰胺是指具有如图2的“目的产物”中所示的结构式的神经酰胺NS。与此相对，酵母型神经酰胺即植物神经酰胺的不同点是，人型神经酰胺4位的双键部 分被羟基所取代(图3)。而且，为构建高效生产人型神经酰胺NS的系统，将本发明的制造方法进行了最佳化。具体方法是，通过酵母的转化，进行以下3)或4)中的任一个或这些的组合，使更高效 地制造人型神经酰胺得以成功3)为使神经酰胺NS不被羟化，需使酵母神经鞘脂类α -羟化酶基因(SCS7)的表 达缺失；和/或4)使酵母碱性二氢神经酰胺酶基因(YDCl)的表达缺失。因此，本发明通过以上述1)及2)为必要条件，将3)_4)作为优选方式的追加条 件，提供在酵母细胞内简便且高效地制造人型神经酰胺的方法。本发明优选包含以下的方 式。(方式1)在酵母细胞内制造人型神经酰胺的方法，其包括1)通过酵母细胞的转化，导入带内质网定位信号的鞘脂Δ4-去饱和酶基因 (DESlm)，该DESlm通过在鞘脂Δ4-去饱和酶基因(DESl)的3’末端添加编码酵母的内质 网定位信号的碱基序列而得到；及，2)通过酵母细胞的转化，使酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因(SUR2)的表达缺失。(方式2)方式1中所述的制造方法，其中，内质网定位信号的氨基酸序列由包含2个以上赖 氨酸残基的4个或5个氨基酸残基组成。(方式3)方式1或2中所述的制造方法，其中，内质网定位信号的氨基酸序列为VKKEK(V表 示缬氨酸残基，K表示赖氨酸残基，E表示谷氨酸)。(方式4)方式1 3中任一项所述的方法，其中，鞘脂Δ4-去饱和酶基因(DESl)编码下述 蛋白质，该蛋白质具有序列号2的氨基酸序列或序列号2中1个或1个以上的氨基酸残基 发生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有鞘脂△ 4-去饱和酶活性。
(方式5)方式1 4中任一项所述的方法，其中，带内质网定位信号的鞘脂Δ 4-去饱和酶 基因(DESlm)编码由序列号4的氨基酸序列组成的蛋白质。(方式6)方式1 5中任一项所述的方法，其中，酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因 (SUR2)编码下述蛋白质，该蛋白质具有序列号6的氨基酸序列或序列号6中1个或1个以上的氨基酸残基 发生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶活性。(方式7)方式1 6中任一项所述的方法，其中，进一步包括通过酵母细胞的转化，使酵母神经鞘脂类α-羟化酶基因(SCS7)的表达缺失。(方式8)方式7中所述的方法，其中，酵母神经鞘脂类α-羟化酶基因(SCS7)编码下述蛋 白质，该蛋白质具有序列号8的氨基酸序列或序列号8中1个或1个以上的氨基酸残基 发生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有神经鞘脂类α -羟化酶活性。(方式9)方式1 8中任一项所述的方法，其中，进一步包括通过酵母细胞的转化，使酵母 碱性二氢神经酰胺酶基因(YDCl)的表达缺失。(方式10)方式9中所述的方法，其中，酵母碱性二氢神经酰胺酶基因(YDCl)编码下述蛋白 质，该蛋白质具有序列号10的氨基酸序列或序列号10中1个或1个以上的氨基酸残 基发生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有碱性二氢神经酰胺酶活性。(方式11)方式1 10中任一项所述的方法，其中，酵母从酵母属的酵母中选择。鞘脂Δ 4-去饱和酶基因(DESl)本发明的方法包括构成要素1)，通过酵母细胞的转化，导入带内质网定位信号的 鞘脂Δ 4-去饱和酶基因(DESlm)，该DESlm通过在鞘脂Δ 4-去饱和酶基因(DESl)的3’末 端添加编码酵母的内质网定位信号的碱基序列而得到。并非要受局限，DESl优选编码如下蛋白质，该蛋白质具有序列号2的氨基酸序列 或序列号2中1个或1个以上的氨基酸残基发生缺失、附加或取代了的氨基酸序列，且具有 鞘脂Δ 4-去饱和酶活性。可用于本发明的基因(核酸)，包括基因组DNA (也包括与其对应的cDNA)、化学合 成的DNA、通过PCR扩增的DNA及这些的组合。DESl优选具有序列号1的碱基序列。其是编码具有序列号2的氨基酸序列的人鞘 月旨Δ 4-去饱和酶蛋白质的碱基序列，例如已在GenBanK :accession number AF466375中 公开。1个以上的密码子编码同一氨基酸时，称为遗传密码的简并。因此，与序列号1不完全一致的DNA序列可编码具有与序列号2完全相同的氨基酸序列的蛋白质。这样的突变 体DNA序列可从沉默(silent)突变(例如，PCR扩增中发生)中产生或也可以是有目的地 对天然序列进行诱变的产物。DESl优选编码序列号2中记载的氨基酸序列。但是，并不限于此，也可以有1个或 1个以上的氨基酸序列发生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有鞘脂Δ4-去饱和酶 活性，可包括所有的同源蛋白质。只要编码与序列号2具有同等功能的氨基酸序列即可，不 限于序列号2。“氨基酸突变”可以为1 多个，优选1 20个，更优选1 10个，最优选 1 5个。由DESl编码的氨基酸序列，具有与序列号2中记载的氨基酸序列有至少约70%、 优选约80%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选98%以上的同一性。氨基酸的同一性百分数，可通过视觉检查及数学计算确定。或2个蛋白质序列 的同一性百分数，可根据 Needleman，S. B.及 Wunsch，C. D. (J. Mol. Biol.，48 :443_453， 1970)的算法，通过使用从威斯康星大学遗传学计算机小组(UWGCG)获得的GAP计算机程 序比较序列信息来确定。GAP程序的优选默认值中，包括(1)如Henikoff，S及Heniko， J.G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 10915-10919，1992)中记载的打分矩阵、blosum62 ； (2) 12的空位权重；(3)4的空位长度权重；及(4)对末端空位无罚分。也可使用本领域技术人员所使用的序列比较的其他程序。同一性的百分数，可 使用例如 Altschul 等(Nuc 1. Acids. Res. 25.，p. 3389-3402，1997)中记载的 BLAST 程 序与序列信息比较确定。该程序可在因特网上National Center for Biotechnology Information(NCBI)、或 DNA Data Bank of Japan (DDBJ)的网站上利用。根据 BLAST 程序 的同源性检索的各种条件(参数)，在该网站有详细记载，可适当变更一部分设定，但检索 使用通常的默认值进行。本发明的方法中，优选鞘脂Δ 4-去饱和酶具有序列号2或与序列号2至少有70 % 同一性的氨基酸序列，且具有鞘脂Δ 4-去饱和酶活性。即使是具有同一功能的蛋白质，由于其来源品种不同，其氨基酸序列也可存在不 同，这一点是本领域技术人员周知的事实。只要具有鞘脂Δ 4-去饱和酶活性，DESl也可 包含如序列号1的碱基序列的同源体、突变体。已知除序列号2的人鞘脂Δ4-去饱和酶 蛋白质以外，还存在例如编码与小鼠(M. musculus)、黑腹果蝇(D. melanogaster)、线虫 (C. elegans)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等显示同样活性的蛋白质的基因 (非专利文献10)。“具有鞘脂Δ4-去饱和酶活性”是指，例如图2或图3中所示，在二氢神经鞘氨醇 的C-4位导入双键，合成鞘氨醇的活性。或指在二氢神经酰胺的C-4位导入双键，合成神经 酰胺NS的活性。通过DESl的导入，在转化酵母细胞内，合成通过酵母天然代谢途径无法合 成的鞘氨醇及/或神经酰胺NS。本发明的优选的鞘脂Δ4-去饱和酶基因，还包括可与序列号1的碱基序列在严谨 条件下，例如中度或高度严谨条件下杂交，且具有鞘氨基醇△ 4-去饱和酶活性的核酸。“严谨条件下”是指在中度或高度严谨条件下进行杂交。具体地说，中度严谨条件， 例如可根据DNA的长度，由具有一般技术的本领域技术人员容易地确定。基本条件包括 使用如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 3 片反，第 6-7 章，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001 中所示，且与硝酸纤维素膜有关，5 X SSC、0. 5 % SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)的预洗涤溶液，约 40_50°C下、约 50%甲酰胺、2\5506\55([或 约42°C下的约50%甲酰胺中的Stark溶液(Stark's solution)等其他同样的杂交溶液] 的杂交条件，以及例如约40°C -60°C、0. 5-6XSSC、0. 1% SDS的洗涤条件。优选中度严谨条 件包括约50°C、6XSSC的杂交条件(及洗涤条件)。高严谨条件，例如也可基于DNA的长度，由本领域技术人员容易地确定。—般此种条件，包括在比中度严谨条件高的温度及/或低的盐浓度下的杂交(例 如，约65°C、6XSSC 0. 2父55(，优选6\55(，更优选2\55(，最优选0. 2X SSC的杂交)及 /或洗涤，例如定义为如上所述的杂交条件及同时伴随约65°C -680.2XSSC,0. 1% SDS 的洗涤。杂交及洗涤的缓冲液中，可用SSPE(1XSSPE是0. 15M NaClUOmM NaH2PO4及1. 25mM EDTA、pH7. 4)代替SSC (1 X SSC是0. 15M NaCl及15mM柠檬酸钠)，洗涤在杂交结束后进行 15分钟。如本领域技术人员所周知、且如以下进一步所记载，要通过适用控制杂交反应和 双链稳定性的基本原理来达到所需程度的严谨性时，可将洗涤温度和洗涤盐浓度根据需要 进行调整(例如，希望参照Sambrook等、2001)。使核酸与未知序列的目标核酸杂交时，杂 交的长度可假定为杂交核酸的长度。使已知序列的核酸杂交时，杂交的长度可通过联配核 酸序列，鉴定具有最佳序列互补性的单数或多数区域来确定。预测为不足50碱基对长度的 杂交体的杂交温度，必须比杂交体的解链温度(Tm)低5-25Π 」Τω由以下等式确定。对于 长度不足18碱基对的杂交体，为Tm(°C) =2仏+1~碱基数)+4(6+(碱基数)。对于长度超过 18 碱基对的杂交体，为 Tm = 81. 50C +16. 6 (Iogltl[Na+])+41 (摩尔分数[G+C])-0. 63(% 甲酰 胺)-500/n，在此，N为杂交体中的碱基数，且[Na+]为杂交缓冲液中的钠离子浓度(IX SSC 的[Na+] = 0. 165M)。优选这样的杂交核酸分别为至少8个核苷酸(或更优选为至少15个 核苷酸、或至少20个核苷酸、或至少25个核苷酸、或至少30个核苷酸、或至少40个核苷酸、 或最优选为至少50个核苷酸)、或其具有杂交核酸长度的至少(更优选为至少25%、 或至少50%、或至少70%、且最优选为至少80% )的长度，其与杂交核酸至少有50% (更 优选为至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97.5%、或至 少99%、且最优选为至少99. 5%)的序列同一性。此处的序列同一性如上述详细记载，通 过比较使重复部分和同一性最大化，另外使序列空位最小化地进行联配的杂交核酸的序列 来确定。核酸同一性的百分数可通过视觉检查及数学计算确定。或2组核酸序列的同一性 百分数，可通过目测检查和数学计算确定、或更优选为此比较通过使用计算机·程序、比较 序列信息来进行。代表性的优选计算机·程序为遗传学计算机·小组(GCG ；威斯康星州麦 迪逊)的威斯康星·软件包、10. 0 版程序 “GAP” (Devereux 等、1984、Nucl. Acids Res. 12 387)。通过此“GAP”程序的使用，除进行2个核酸序列的比较以外，还可进行2个氨基酸 序列的比较、核酸序列和氨基酸序列的比较。在此，“GAP”程序的优选默认值中包含(1) 对于核苷酸的(包括同一物为1、及非同一物为0的值)一元(unary)比较矩阵的GCG实 行、和 Schwartz 及 Dayhoff 监修“多肽序列及结构图谱(Atlas of Polypeptide Sequence 及Structure) ”国立生物医学研究财团、353-358页、1979中记载的Gribskov及Burgess， Nucl. Acids Res. 14 =6745,1986的加权氨基酸比较矩阵；或其他可比较的比较矩阵；(2)对氨基酸的各空位追加30的罚分和对各空位中的各记号追加1的罚分；或对核苷酸序列 的各空位追加50的罚分和对各空位中的各记号追加3的罚分；(3)对终端空位无罚分及 (4)无对长空位的最大罚分。本领域技术人员所使用的其他序列比较程序中，例如，可使 用通过国立医学文库的网站http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bls. html 的 BLASTN程序、2. 2. 7版、或可使用WU-BLAST2. 0算法。对于WU-BLAST2. 0的标准默认值的设 定，如以下因特网网站http://blast, wustl. edu中所记载。且BLAST算法使用BLOSUM62 氨基酸打分矩阵，可使用的选择参数如下所示(A)包括将具有低组成复杂性的查询序列 的片段[由 Wootton 及 Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)确定；也 希望参照Wootton及Federhen，1996《序列数据库中组成偏向性区域的分析》(Analysis of compositionalIy biased regions in sequence databases)Methods Enzymo1. 266 544-71]、或短周期性的内部重复组成的片段[由Claverie及States (Computers and Chemistry, 1993)的XNU程序确定)]用于屏蔽的过滤，及(B)根据用于报告对数据库序 列的适合性的统计学上的显著性阈值、或根据E-分数(Karlin及Altschul，1990)的统计 学模型，单纯偶然发现的适合度的期待概率；源于某种适合度的统计学的显著差异比E-分 数阈值大时，此适合度不被报告；优选E-分数阈值的数值为0.5、或按优选度增加的顺序 为 0.25,0.1,0.05,0.01,0.001,0. 0001、le_5、le_10、le_15、le_20、le_25、le_30、le_40、 le-50、le-75、或 Ie-IOO0同样，本发明的鞘脂Δ4-去饱和酶基因(DESl)中，包括如下核酸，其因为1个或 多个碱基发生缺失、插入或取代，所以与序列号1的碱基序列不同，但编码具有鞘脂Δ4-去 饱和酶活性的蛋白质。只要编码具有鞘脂Δ4-去饱和酶活性的蛋白质，对缺失、插入或取 代的碱基数量无特别限制，但优选为1个 数千个、更优选为1个 1千个、进一步优选为 1个 500个、更进一步优选为1个 200个、最优选为1个 100个。也可将规定的氨基酸通过例如具有同样的物理化学特性的残基取代。在这种保守 性取代的例子中，包括使1个脂肪族残基相互取代，例如将lie、Val、Leu或Ala相互取代； Lys及Arg、Glu及Asp、或从Gln及Asn之间的1个极性残基向其他残基的取代；或用芳香 族残基的其他残基取代，例如将Phe、Trp或Tyr相互取代。其他保守性取代，众所周知的 例如具有同样疏水性特性的区域全体的取代。本领域技术人员可通过周知的基因工程的方 法，使用Sambrook等(2001)(上述)等中记载的，例如定点诱变法，实施所需的缺失、插入 或取代。带内质网定位信号的鞘脂Δ4-去饱和酶基因(DESlm)本发明的带内质网定位信号的鞘脂Δ4-去饱和酶基因(DESlm)，是通过在上述鞘 脂Δ4-去饱和酶基因(DESl)的3’末端添加编码酵母的内质网定位信号的碱基序列得到 的基因。“酵母的内质网定位信号”为本领域技术人员所周知，在本发明的方法中，可以利用 任意的内质网定位信号。例如，并非要受到局限，在以下的文献中，公开了具有由包含2个以上的赖氨酸残基的4个或5个氨基酸残基组成的氨基酸序列的典型的酵母定位信号。EMBO J. 9 :3153-3162，1990(非专利文献 15)J Cell Biol. 127 :653_665，1994(非专利文献 16)Science. 263 :1629_1631，1994(非专利文献 17)
Cell. 79 :1199_1207，1994(非专利文献 18)Eur J Cell Biol. 64 :211_216，1994(非专利文献 19)Annu Rev Cell Dev Biol. 12 :27_54，1996 (非专利文献 20)本发明的“酵母的内质网定位信号”优选为“具有由包含2个以上的赖氨酸残基的4个或5个氨基酸残基组成的氨基酸序列的内质网定位信号”。更优选内质网定位信号的氨 基酸序列含有KKX1X2或KX1KX2X3Oi表示赖氨酸残基，X1^ X2> X3表示任意的相同或不同的氨 基酸残基)。最优选的内质网定位信号的氨基酸序列的方式之一，包括在本说明书的实施例 中记载的VKKEK (V表示缬氨酸残基，K表示赖氨酸残基，E表示谷氨酸)。本发明的带内质网定位信号的鞘脂Δ4-去饱和酶基因(DESlm)的信号部分以外、 即鞘脂Δ4-去饱和酶基因(DESl)不受特殊限制，如上述“鞘脂Δ4-去饱和酶基因(DESl) ” 的项目中所述。优选编码序列号2的氨基酸序列。因此，DESlm基因编码由序列号2的氨 基酸序列+VKKEK、即序列号4的氨基酸序列组成的蛋白质。DESlm基因的核酸序列，典型而 言由序列号3的碱基序列组成。除序列号3以外，还包含通过基因简并而编码序列号4的 氨基酸序列的碱基序列。“酵母的内质网定位信号”除“具有由包含2个以上的赖氨酸残基的4个或5个氨 基酸残基组成的氨基酸序列的内质网定位信号”以外，还已知有多种内质网定位信号。并非 要受到限制，例如已知内质网定位的机制，可以用于本发明的方法。J Cell Biol. 127 :21_28，1994(非专利文献 21)据记载，具有氨基酸序列HDEL的蛋白质被高尔基体回收到内质网。与HDEL同样， KDEL也是公知的内质网定位信号。JBiol Chem. 273 :33273-33278，1998(非专利文献 22)公开了跨膜区中的决定因子(组)在向内质网的回收中起作用。J Cell Biol. 152 :935-944，2001(非专利文献 23)据记载，高尔基体膜蛋白质中的一种与内质网膜蛋白质的跨膜区中的回收信号相 互作用，参与向内质网的回收。另外，酵母细胞以外的细胞也可以作为本发明的制造方法中的转化用宿主细胞来 使用。作为宿主细胞，包含哺乳动物细胞(人、小鼠、大鼠等)、昆虫细胞等。上述各种细胞 的用于内质网定位的信号为已知，可以利用适合所使用的细胞的种类的内质网定位信号。酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因(SUR2)本发明的方法包括构成要素2)，通过酵母细胞的转化，使酵母二氢神经鞘氨醇 C4-羟化酶基因(SUR2)的表达缺失。并非要受局限，但SUR2优选编码如下蛋白质，该蛋白质具有序列号6的氨基酸序 列或序列号6中1个或1个以上的氨基酸残基发生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有 二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶活性。SUR2优选具有序列号5的碱基序列。其是编码具有序列号6的氨基酸序列的酵 母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶蛋白质的碱基序列，例如，已在S⑶(Saccharomyces Genome Database, http://www. yeastgenome. org/)中&JF。SUR2优选编码序列号6中记载的氨基酸序列。但并不限于此，也可以有1个或1个 以上的氨基酸序列发生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶活性，包括所有的同源蛋白质。只要编码与序列号6具有同等功能的氨基酸序列即可， 不限于序列号6。“氨基酸突变”为1 多个，优选1 20个，更优选1 10个，最优选1 5个。“具有二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶活性”是指，例如图2或图3所示，在二氢神经 鞘氨醇的C-4位导入羟基、合成植物鞘氨醇的活性，或在二氢神经酰胺的C-4位导入羟基、 合成植物神经酰胺的活性。本发明中，通过酵母细胞的转化，使SUR2的表达部分或完全缺 失，从而部分或完全地抑制在酵母天然代谢途径中合成的植物鞘氨醇及/或植物神经酰胺 的合成。通过SUR2基因表达的抑制和DESl基因的表达，能高效合成鞘氨醇及/或神经酰 胺NS。由SUR2编码的氨基酸序列，与序列号6中记载的氨基酸序列有至少约70%、优选 约80%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选98%以上的同一性。本发明的优选酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因(SUR2)，还包括可与序列号5 的碱基序列在严谨条件下，例如在中度或高度严谨条件下杂交，且具有酵母二氢神经鞘氨 醇C4-羟化酶活性的核酸。同样，本发明的酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因(SUR2)包括如下核酸其因 1个或多个碱基的缺失、插入或取代而与序列号5的碱基序列不同，但编码具有二氢神经鞘 氨醇C4-羟化酶活性的蛋白质。对于“氨基酸及/或碱基的缺失、附加、取代”、“氨基酸及/或碱基的同一性百分 数”、杂交的“严谨条件下”等共通事项，如上述DESl中所述。酵母神经鞘脂类α -羟化酶基因(SCS7)本发明的方法可进一步包括，通过酵母细胞的转化，使酵母神经鞘脂类α-羟化 酶基因(SCS7)的表达缺失。SCS7具有如下活性，即例如在与图3或图7的植物神经酰胺、 二氢神经酰胺、神经酰胺NS的鞘氨基醇碱以酰胺键结合的脂肪酸α位的碳上附加羟基，分 别合成Cer (AP)、Cer (ASa)、Cer (AS)的活性。由于SCS7活性的存在，因此即使所期望的二 氢神经酰胺、神经酰胺NS被合成，也会被进一步羟化。因此，本发明优选包括使SCS7的表 达缺失。并非要受局限，但SCS7优选编码如下蛋白质，该蛋白质具有序列号8的氨基酸序 列或序列号8中1个或1个以上的氨基酸残基发生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有 神经鞘脂类α-羟化酶活性。SCS7优选具有序列号7的碱基序列。其是编码具有序列号8的氨基酸序列的 酵母神经鞘脂类α-羟化酶蛋白质的碱基序列，例如，已在S⑶(Saccharomyces Genome Database, http://www. yeastgenome. org/)中公开。SCS7优选编码序列号8中记载的氨基酸序列。但并不限于此，也可以有1个或1 个以上的氨基酸序列发生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有神经鞘脂类α-羟化 酶活性，包括所有的同源蛋白质。只要编码与序列号8具有同等功能的氨基酸序列即可，不 限于序列号8。“氨基酸突变”为1 多个、优选1 20个、更优选1 10个、最优选1 5个。“具有神经鞘脂类α-羟化酶活性”是指，例如图7所示，具有在与植物神经酰胺、 二氢神经酰胺、神经酰胺NS的鞘氨基醇碱以酰胺键结合的脂肪酸α位的碳上附加羟基，分别合成Cer(AP) Xer(ASa) Xer(AS)的活性。本发明中，优选通过酵母细胞的转化，使SCS7 的表达部分或完全缺失，从而抑制不期望的二氢神经酰胺、神经酰胺NS的羟化。由SCS7编码的氨基酸序列与序列号8中记载的氨基酸序列有至少约70%、优选约 80%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选98%以上的同一性。本发明的优选酵母神经鞘脂类α -羟化酶基因(SCS7)，还包括可与序列号7的碱 基序列在严谨条件下，例如在中度或高度严谨条件下杂交，且具有酵母神经鞘脂类α-羟 化酶活性的核酸。同样，本发明的酵母神经鞘脂类α-羟化酶基因(SCS7)包括如下核酸其因1 个或多个碱基的缺失、插入或取代而与序列号7的碱基序列不同，但编码具有神经鞘脂类 α-羟化酶活性的蛋白质。对于“氨基酸及/或碱基的缺失、附加、取代”、“氨基酸及/或碱基的同一性百分 数”、杂交的“严谨条件下”等共通事项，如上述DESl中所述。酵母碱件二氢神经酰胺酶基因(YDCl)本发明的方法可进一步包括通过酵母细胞的转化，使酵母碱性二氢神经酰胺酶 基因(YDCl)的表达缺失。例如如图1-图3所示，YDCl编码具有分解二氢神经酰胺、合成二氢神经鞘氨醇的 活性的蛋白质。YDCl活性是促进可以说是神经酰胺合成的相反方向的反应的活性，使成为 神经酰胺NS合成的材料的二氢神经酰胺减少。因此，本发明优选包括使YDCl的表达缺失。并非要受局限，但YDCl优选编码如下蛋白质，该蛋白质具有序列号10的氨基酸序 列或序列号10中1个或1个以上的氨基酸残基发生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具 有碱性二氢神经酰胺酶活性。YDCl优选具有序列号9的碱基序列。其是编码具有序列号10的氨基酸序列 的酵母碱性二氢神经酰胺酶蛋白质的碱基序列，例如，已在S⑶(Saccharomyces Genome Database, http://www. yeastgenome. org/)中&JF。YDCl优选编码序列号10中记载的氨基酸序列。但并不限于此，也可以有1个或1 个以上的氨基酸序列发生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有碱性二氢神经酰胺酶 活性，包括所有的同源蛋白质。只要编码与序列号10具有同等功能的氨基酸序列，不限于 序列号10。“氨基酸突变”为1 多个、优选1 20个、更优选1 10个、最优选1 5个。“具有碱性二氢神经酰胺酶活性”是指，例如图1-图3所示，具有分解二氢神经酰 胺、合成二氢神经鞘氨醇的活性。本发明中，优选通过酵母细胞的转化，使YDCl的表达部分 或完全缺失，从而抑制不期望的二氢神经酰胺的分解。由YDCl编码的氨基酸序列，与序列号10中记载的氨基酸序列有至少约70%、优选 约80%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选98%以上的同一性。本发明的优选酵母碱性二氢神经酰胺酶基因(YDCl)，还包括可与序列号9的碱基序列在严谨条件下，例如中度或高度严谨条件下杂交，且具有酵母碱性二氢神经酰胺酶活 性的核酸。同样，本发明的酵母碱性二氢神经酰胺酶基因(YDCl)包括如下核酸其因1个或 多个碱基的缺失、插入或取代而与序列号9的碱基序列不同，但编码具有碱性二氢神经酰 胺酶活性的蛋白质。
对于“氨基酸及/或碱基的缺失、附加、取代”、“氨基酸及/或碱基的同一性百分数”、杂交的“严谨条件下”等共通事项，如上述DESl中的记述。 [οπ ]诵 i寸·g 胃仆,m^mm^AMm^^在本发明中，酵母细胞内的DESlm的表达不受限定，可使用公知方法进行。优选包 括用包含DESlm的表达载体转化宿主酵母细胞，且在可使核酸表达的条件下培养转基因酵 母细胞。并非要受局限，本发明的方法中可利用的酵母优选来自酵母属(Saccharomyces) 的酵母。更优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、贝 _ BJ (Saccharomyces bayanus)、胃(Saccharomyces kluyveri)。包括酵母属的芽殖酵母在基因水平上的神经酰胺的合成 代谢分析发展最快， 因此，可使本发明的人型神经酰胺的制造方法迅速达到最佳化。且酵母细胞容易培养，可用 于传统的食品制造，并可确立简便、安全、廉价地大量提取·精制神经酰胺的方法。本发明中，为进行基因的导入 表达，可使用公知的酵母表达载体。本发明的实施 例中，使用了公知的酵母用基因表达载体pRS series (p4XX) (Mumberg et al.，Gene，156， 119，1995)及 pYE22m(Ashikari et al.，Appl MicrobiolBiotechnol,30, 515,1989) 导入酵母时使用的载体，可使用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体 整合型(YIp 型)的任一个。例如，YEp 型载体 YEp24(J. R. Broach etal.，Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83,1983)、YCp 型载体 YCp50 (M. D. Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp 型载体 YIp5 (K. Struhl et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76，1035，1979)等的多数酵母用表达载体为本领域技术人员所公知， 均可用于本发明的方法中。表达载体除各基因以外，一般在宿主中增殖，所以可包含在含有可选择性标记及 复制起点的载体内。载体中进一步包含，优选来自酵母的适合的转录或翻译调控序列根据 需要与本发明的核酸连接。调控序列的一例中，包括转录启动子、操作子或增强子、mRNA核糖体结合位点、以 及调节转录及翻译开始及终止的适合的序列。核苷酸序列在调控序列与该DNA序列起作用 地相关时，可起作用地连接。因此，启动子核苷酸序列在该启动子核苷酸序列调节DNA序列 的转录时，可与DNA序列起作用地连接。在宿主细胞中赋予复制能力的复制起点、及鉴定转 化体的选择基因一般被转入到表达载体。选择标记，可根据常法使用常用的标记。例如四 环素、氨苄青霉素、或卡那霉素或新霉素、潮霉素或壮观霉素等的抗生素抗性基因及HIS3、 TRPl等的营养缺陷型基因等。酵母载体经常含有来自2μ酵母质粒的复制起点序列、自主复制序列(ARS)、启动 子区域、用于多聚腺苷化的序列、用于转录终止的序列、及可选择的标记基因。载体，可通过使用常法将所需基因连接到在本技术领域方便获得的重组用载体 (例如，质粒DNA等)中来制备。在质粒等载体中整合基因的DNA片段的方法，例如，可为 Sambrook, J.，and Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd ed. (New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press)中所记载的方法等。简便的方法， 也可使用市售的连接试剂盒(例如，宝酒造制等)。将载体导入宿主细胞的方法，一般可使用Sambrook，J.等(2001)(上述)中记载的磷酸钙法或氯化钙/氯化铷法、电穿孔法、电子注射法、PEG等化学处理的方法、基因枪等 的方法等。通过酵母转化的各基因的缺失方法本发明的方法包括通过酵母细胞的转化，使酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基 因(SUR2)的表达缺失。本发明的方法进一步在优选方式中包括通过酵母细胞的转化，使酵母神经鞘 脂类α -羟化酶基因(SCS7)的表达缺失；及通过酵母细胞的转化，使酵母碱性二氢神经酰胺酶基因(YDCl)的表达缺失中的 任一种或这些的组合。本发明中，使各基因的表达缺失是指由各基因编码的蛋白质活性不能发挥之意。 如果通过阻断酵母细胞基因组上的各基因、抑制基因的转录、抑制从基因向蛋白质的翻译、 蛋白质即使被翻译也抑制其活性发挥等，使由基因编码的蛋白质活性最终不能发挥，即达 到了本发明方法中的目的，所以也包含于本发明的范围内。缺失可以是部分缺失，也可以是 完全缺失。典型的方法，阻断母细胞基因组上的各基因，使基因部分或完全缺失。SUR2、SCS7、YDCl的各基因的表达缺失可通过公知的方法进行。例如，本说明书的实施例中，通过使用连接了各基因的上游及下游的碱基序列、及 选择标记的DNA片段，与酵母天然基因组序列的同源重组，使各基因缺失。基因的阻断，可通过使参与靶基因中基因产物的表达的区域，例如编码区域、启动 子区域的内部附加或缺失单一或多个碱基，或使这些区域的全体缺失来进行。此种基因 阻断的方法可参照公知文献[例如，参照Yeast 10,1793(1994)、Yeast 15,1541(1999)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,4951 (1979) ,Met hods in Enzymology，101，202 (1983)等]。除基因阻断以外，为实现本发明的目的，抑制各基因表达的方法还可为反义法 (例如参照平岛及井上新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会 编，东京化学同人)PP. 319-347，1993等)、RNAi法(参照日本特表2002-516062号公报； 美国专利公开公报第 2002/086356A 号；Nature Genetics, 24 (2)，180-183,2000 等)、酶 性核糖核酸的方法(参照 FEBS Lett. 228 228,1988 ；FEBS Lett. 239 285,1988 ；Nucl. Acids. Res. 17 :7059，1989 等)、共抑制法(例如参照 Smyth DR :Curr. Biol. 7 :R793，1997、 Martienssen R :Curr. Biol. 6 :810，1996 等)等。神经酰胺合成的确认方法根据本发明的方法制造出的人型神经酰胺(神经酰胺NS)可使用公知方法进行 提取·精制。本发明的方法因使用酵母细胞，所以可进行大量的培养，可简便且迅速地提 取 精制神经酰胺。经精制的神经酰胺，可使用公知的用于鞘氨基醇分析的方法确认。分 析方法包括例如图4所示的TLC、HPLC、质谱(例如，LC-MS, LC-MS/MS、FT-MS)等。发明的效果若采用本发明的利用酶的定位控制来高效生产神经酰胺NS的系统，则可更廉价 地制造人皮肤中功能性强的人型神经酰胺。


图1表示酵母及高等动物细胞中神经鞘脂类的合成代谢途径。
图2表示本发明的在酵母细胞内制造人型神经酰胺的方法的优选方式的概要。图3表示酵母及高等动物的鞘氨基醇及神经酰胺的分子种类及其结构式。图4示意性地表示从酵母菌体培养到TLC及HPLC分析的工序。图5表示采用氚标记(3H) D-赤式-二氢神经鞘氨醇的酵母的神经酰胺的TLC分析结果和使用生物影像分析仪(BAS)的放射标记神经酰胺的定量结果。标记时间为16小时， 温度为25°C。从左边开始，样品1-3如下所述1.实施例6111. SUR2/SCS7双重阻断(实施例3) +空载体；2.实施例61. SUR2/SCS7双重阻断(实施例3)+DESl基因表达；3.实施例611. SUR2/SCS7双重阻断(实施例3)+DESlm基因表达。图6表示采用氚标记(3H) D-赤式-二氢神经鞘氨醇的酵母的神经酰胺的TLC分析 结果和使用生物影像分析仪(BAS)的放射标记神经酰胺的定量结果。标记时间为16小时， 温度为25°C。从左边开始，样品1-3如下所述1.实施例6VI. SUR2/SCS7/YDC1三重阻断(实施例4) +空载体；2.实施例6IV. SUR2/SCS7/YDC1三重阻断(实施例4) +DESl基因表达；3.实施例6V. SUR2/SCS7/YDC1三重阻断(实施例4) +DESlm基因表达。图7表示通过荧光显微镜(OLMPUS BX51)用GFP用滤色片观察在实施例9中制作 的融合蛋白质的定位的结果。
实施例以下根据实施例具体说明本发明，但这些不限定本发明的技术范围。本领域技术 人员可根据本说明书的记载容易地对本发明加以修饰·变更，这些均包含于本发明的技术 范围内。实施例1 人鞘脂△ 4-去饱和酶基因(DESl)表达载体的制备以已公开的数据库中的人鞘脂Δ 4-去饱和酶(sphingoid Δ 4-desaturase)基因 (DESl)的碱基序列(GenBanK :accession number AF466375)(序列号 40，其中的 CDS 为序 列号1)为参考，制备引物deslF(序列号11)及deslR(序列号12)。序列号11 :5，-CCTTCTCTAGAGGATCCATGGGGAGCCGCGTCTCGCGGGAAGAC-3，序列号12 :5，-CCTTCGAATTCCCCGGGCCAGGGGAGCTTCTGAGCATCACTGGTC-3，利用上述引物对，以人cDNA文库为模板进行PCR。利用所得到的PCR产物(约 1. Ikb)的BamHI和SmaI位点，克隆到酵母用基因表达载体pKOll (由Kamei et al.， J. Biol. Chem.，273，28341，1998 ；Dr. K. Tanaka 提供)上。根据双脱氧测序法进行碱基序列确定，确认出克隆的碱基序列与数据库一致。利 用BamHI和Xhol位点，亚克隆到酵母用基因表达载体pRS series (p4XX) (Mumberg et al.， Gene, 156，119，1995)上。实施例2 酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因(SUR2)阻断株的制备以已公开的酵母基因组数据库(SGD (Saccharomyces Genome Database, http //www. yeastgenome. org/))中的酵母二氧神经銷氛醇〇4_尹圣化8| (sphinganineC4-hydroxylase)基因(SUR2)的碱基序列(序列号5)和含有其上游和下游区域的序列(序 列号41)为参考，制备引物sur2F(序列号13)及sur2R(序列号14)。序列号13 :5，-CTCCGGCTTCTGCGGTTTTTCTTAGTCTTTCCGCACCAATTTTCACAGGAATTCCC GGGGATCCGG-3，序列号14 :5，-GGATAATAAATACAAACGTGGGAAGTCGGAGACATTGCCTTTACCCAGCAAGCTAG CTTGGCTGCAGG-3，利用上述引物对，以质粒pYDp_L(Berben et al. , Yeast, 7,475,1991)为模板进行 PCR，获得了由SUR2基因上游295bp、选择标记及SUR2基因下游75bp相连接的PCR产物。 使用此 PCR 产物，根据通常方法进行 HQ 13 株(MATa，ura3，his3，leu2，lys2，trpl，barl-l) 的转化，用营养缺陷型培养基筛选转化体，获得SUR2基因阻断株。使用为使正常基因与阻断基因扩增的片段长度不同而设计的确认用引物(序列 号15及16)，通过PCR法进行SUR2基因阻断的确认。序列号15 :5，-CTCCGGCTTCTGCGGTTTTTCTTAGTCTTTC-3，序列号16 :5，-GGAAGTCGGAGACATTGCCTTTACCCAG-3，实施例3:酵母SUR2、及酵母神经鞘脂类a-羟仆廉某因(SCS7)双重阳直株的制 备以已公开的酵母基因组数据库(SOT)中的酵母神经鞘脂类a-羟化酶 (sphingolipid alpha-hydroxylase)基因(SCS7)的碱基序列(序列号7)和含有其上游及 下游区域的序列(序列号42)为参考，制备引物SCS7up280F(序列号17)及SCS7up280R_ G418(序列号 18)、scs7down280F_G418(序列号 19)及 scs7down280R(序列号 20)。序列号17 :5，-CGAATTCAGCCGAAAACAGTCTTGCTT-3，序列号18 :5，-CTCCATGTCGCTTACCACCGCTTTTAGTGC-3，序列号19 :5，-CGCTATACTGCAGCCTCGTCCAAAATTGTCA-3，序列号20 :5，-CGAATTCTTGCCAACCTGATCTGTGAA-3，利用上述引物对，以根据常法制备的酵母基因组DNA为模板进行PCR，获得分别相 当于SCS7基因上游区域约280bp、下游区域约280bp的PCR产物。 接着，作为第二阶段的PCR，将上述2种PCR片段混合，用G-50凝胶过滤柱(Quick Spin Columns for radiolabeled DNA purification，罗氏公司)将原有引物除去后，将以 Geneticin(G418)抗性基因为标记的pFA6a_kanMX4 (EMBL AJ002680)载体作为模板,扩增 上述引物scs7up280F和scs7down280R的组合约2. 3kb的PCR片段。使用该最终PCR产物， 根据常法进行实施例2记载的酵母SUR2阻断株的转化。用含有G418 300mg/L的YPD平板 培养基(1%酵母膏、2%聚蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂)筛选转化体，获得SUR2/SCS7双重 阻断株。将G418基因插入目标部位，为了分析SCS7基因是否被阻断，在SCS基因内制作引 物SCS7 GD CheckF2(序列号21)，在G418基因内制作引物G418 CheckR(序列号22)。对 于经PCR有1. 2kb的片段扩增的，确认为基因阻断株。序列号21 :5，-GCGCTGCATACATAGACATATACAC-3，序列号22 :5，-ATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACA-3，实施例4 酵母SUR2、酵母碱性二氢神经酰胺酶基因(YDC1)及SCS7三重阻断株的制备以已公开的酵母基因组数据库(S⑶)中的酵母碱性二氢神经酰胺酶(alkaline dihydroceramidase)基因(YDCl)的碱基序列(序列号9)和含有其上游及下游区域的序 列(序列号43)为参考，制备引物ydclup280F(序列号23)和ydclup280R(序列号24) ydcldown250F(序列号 25)及 ydcldown250R(序列号 26)。序列号23 :5，-CGAATTCCCCAGAGGCAAAGATGTTA-3，序列号24 :5，-TGGATGGCACGGATCCGAAAGGCACACCTGTCATTATGG-3，序列号25 :5，-TGTGCCTTTCGGATCCGTGCCATCCATTTGAATC-3，序列号26:5' -CGAATTCCTTTTATGATGGGAGTAACTGCT-3，利用上述引物对，以通过常法制备的酵母基因组DNA为模板进行PCR，获得分别 相当于YDCl基因上游区域约280bp、下游区域约250bp的PCR产物。引物ydclup280R和 ydcldOwn250F共有分别共通的互补序列，在YDCl基因的上游区域和下游区域的边界包含 BamHI位点。混合分别相当于YDCl基因上游区域约280bp、下游区域约250bp的PCR产物，使 用引物ydclup280F和ydcldown250R进行PCR，获得包含夹有BamHI位点的YDCl基因上下 游区域的530bp的PCR产物。将其预先用BamHI切割pUC19后，利用引物ydclup280F和 ydcldown250R中所含有的EcoRI位点，克隆到通过T4 DNA聚合酶(polymerase)平末端化 后自我连接而获得的载体上(pYDCl-1)。1)由于接下来要导入的潮霉素抗性基因内存在EcoRI位点，因此为了除去 ρYDCl-I 中的 EcoRI 位点，制备引物 YDClup280F_Sse (序列号 27)和 YDCldown250R_Sse (序 列号28)，以pYDCl-Ι为模板，进行PCR0用限制酶Sse8387I将得到的530bp的片段酶解 后，将通过琼脂糖凝胶电泳精制·回收(GENECLEAN Turbo, Q-BIO Gene公司)得到的片段 插入PUC19的Pst I部位(pYDCl-2)。为了用限制酶Bgl II切取潮霉素抗性基因，制作 引物 GA32-2(序列号 29)和 GA32R(序列号 30)，将 pGA32 (Goldstein et al.，yeast. 15 1541 (1999))作为模板，进行PCR，得到1. 5kb的片段。序列号27 :5，-AAACCTGCAGGCCCAGAGGCAAAGATGTTAAGTTAGATTTTC-3，序列号28 :5，-TTTCCTGCAGGCTTTTATGATGGGAGTAAC TGCTGC ATGTGT-3，序列号29 :5，-TAAGATCTGACATGGAGGCCCAGAATAC-3，序列号30 :5，-TAAGATCTCGCACTTAACTTCGCATCTG-3，将该片段插入上述pYDCl-2的BamHI位点，结果制成YDCl基因的上下游区域被潮 霉素抗性基因分开的框架(pYDCl-3)。用限制酶Sse8387I将pYDCl-3酶解，将除去了 pUC19 载体部分的区域如上所述那样通过琼脂糖凝胶电泳精制·回收，使用得到的物质，按常法进 行实施例3记载的酵母SUR2/SCS7阻断株的转化。用含有潮霉素200mg/L的YPD平板培养 基筛选转化体，获得SUR2/SCS7/YDC1三重阻断株。2)或者，用 BamHI 将质粒 pYDp-H(Berben et al. , Yeast, 7,475,1991)切割，将含 有HIS3基因的约1.2kb的片段插入上述含有YDCl基因的上下游区域的质粒的BamHI位点。 将得到的含有在YDCl基因的上下游区域夹有HIS3基因的区域的质粒用EcoRI切割，使用 得到的片段，按常法进行实施例2记载的酵母SUR2阻断株的转化。用不含组氨酸的最少完 全平板培养基(SC-His)进行筛选，获得SUR2/YDC1双重阻断株。接着，使用实施例3中记载的具有Geneticin (G418)抗性基因的约2. 3kb的PCR产物，按常法进行上述酵母SUR2/ YDCl双重阻断株的转化。用含有G418 300mg/L的YPD平板培养基筛选转化体，获得SUR2/ SCS7/YDC1三重阻断株。 为使正常基因与阻断基因中用PCR扩增的片段的长度不同，制备引物 YDClUPcheckF2(序列号31)和ydcl_GD_CheckR2 (序列号32)，通过PCR来确认基因阻断。
序列号 31 5，-CTCGTCCTCTGAACCAAAGC-3，序列号32 :5，-GGTAAATAGAACTTTTATGTGCCGC-3，实施例5带内质网定位信号的DESl (hDESlm)表汰裁体的制各用以下方法来构建载体，使作为酵母的内质网定位酶的SUR2蛋白质的C末端氨基酸序列VKKEK(内质网定位信号)与hDESl的C末端侧结合。将实施例1记载的hDESl表达载体作为模板，作为第一阶段的PCR，分别扩增引物 26SseF(序列号33)和VKKEK_R2(序列号36)的组合约1. 5kb的PCR片段和引物VKKEK_ F2 (序列号35)和426SseR(序列号34)的组合约0. 6kb的片段。序列号33 :5，-AACCTGCAGGTGGAATTGTGAGCGGATA-3，序列号34 :5，-TTCCTGCAGGTTTTCCCAGTCACGACGTT-3，序列号35 :5，-ATGGTGCTGGAGGTAAAGAAAGAGAAATAAATAT C ATTAGTGCCAAAG-3，序列号36 :5，-TAATGATATTTATTTCTCTTTCTTTACCTCCAGCACC ATCTCTCCTTT-3，接着，作为第二阶段的PCR，将上述2种PCR片段混合，通过琼脂糖凝胶电泳将原 有引物精制除去(GENECLEAN Turbo, Q-BIO Gene公司)，将得到的片段作为模板，扩增引 物426SseF和426SseR的组合约2kb的PCR片段。将该2kb的片段亚克隆到pCR-Blunt II-TOPO 载体(Invitrogen 公司)。利用双脱氧测序法进行碱基序列确定，确认出克隆的碱基序列(序列号37)。其 中，将DESlm的ORF部分的碱基序列作为序列号3，将序列号3编码的氨基酸序列作为 序列号4。通过限制酶BamHI和Xho I酶解，得到约1. 3kb的片段，插入以Ura3为标记 的 PRS426 (2 μ ) GPD 载体(Mumberg et al.，GENE, 156，119-122，1995)的同限制酶部位 (phDESlm)。实施例6具有人DESl或者带内质网定位信号的DESl (DESlm)表达质粒的神经酰 胺合成体系·代谢体系转化株的制备使用由上述实施例3、4得到的各基因的阻断株，制备DESl基因(实施例1)或 DESlm基因(实施例5)表达株。I. SUR2/SCS7双重阻断(实施例3) +DESl基因表达II. SUR2/SCS7双重阻断(实施例3)+DESlm基因表达III. SUR2/SCS7双重阻断(实施例3)+空载体IV. SUR2/SCS7/YDC1三重阻断(实施例4) +DESl基因表达V. SUR2/SCS7/YDC1三重阻断(实施例4) +DESlm基因表达VI. SUR2/SCS7/YDC1三重阻断(实施例4) +空载体用实施例1的人DESl表达质粒或实施例5中制备的带内质网定位信号的人型 DESl (DESlm)，根据常法进行实施例3、4中得到的阻断株的转化。转化体的筛选使用不含尿 嘧啶的最少完全平板培养基(SC-Ura)来进行。
所得到的转化株中的人DESl基因的表达通过如下方法来确认将使用 RNeasy试剂盒(Qiagen公司)精制的总RNA通过使用了引物Hdes 1_R (序列号38)的 SuperscriptII (Invitrogen公司)进行逆转录反应、和通过使用了反应物Hdesl_F (序列号 39)和 Hdesl_R(序列号 38)的 Ex-taq (Takara Bio 公司)进行 PCR(RT-PCR)。序列号38 :5，-TCCAGCACCATCTCTCCTTT-3，序列号39 :5，-AGTGGGTCTACACCGACCAG-3，t施例7(3H)D-,未式-二氡』神经鞘Ml車的神经酰胺的分析将上述实施例6的神经酰胺合成体系 代谢体系转化株在添加了组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、腺嘌呤及色氨酸的不含尿嘧啶的最少液体培养基中以25°C、150rpm振荡培养24小 时后，回收酵母，制备悬浮于最少液体培养基中的悬浮液0. 5ml (160D600units/ml)。加入氚 标记(3H)的D-赤式-二氢神经鞘氨醇10 μ 1(10 μ Ci)，在25°C下培养过夜(Zanolari et al.，The EMBO Journal, 19，2824，2000)。加入 200 μ 1 250mM 的 NaF 和 250mM 的 NaN3,终止 反应后，用冰冷却的灭菌水洗涤3次，使菌体悬浮于66μ 1的灭菌水中。在本悬浮液中加入玻璃珠，剧烈搅拌使菌体破碎。在其中加入氯仿、甲醇使氯仿、 甲醇、悬浮液之比为10 10 3，提取脂质。进行提取液的离心分离，回收所得到的上清 后，吹入氮气使其浓缩干燥。将样品溶解于100 μ 1的氯仿-甲醇-水(10 10 3)中， 加入0.6Ν NaOH甲醇溶液20 μ 1，使其在30°C下反应90分钟后，用0.6Ν醋酸溶液中和。通 过丁醇提取来除去盐，吹入氮气使所得到的丁醇层(上层)浓缩干燥。使脂质溶解于20μ1的氯仿_甲醇(1 1)中，在事先用硼酸盐(70mM Na2B4O7 · IOH2O甲醇溶液)处理30分钟并干燥得到的薄层色谱(TLC)板上点样，用氯仿-甲 醇(9 1)展开(Triola et al.，Molecular Pharmacology,66，1671，2004)。展开后，将 放射标记神经酰胺用生物影像分析仪(BAS)进行分析。结果如图5和图6所示。具有人DES 1表达质粒的SUR2/SCS7双重阻断株和SUR2/SCS7/YDC1三重阻断株 的神经酰胺NS(CerNS)为10 %时，带内质网定位信号的人DESl (DESlm)表达酵母SUR2/ SCS7双重阻断株的神经酰胺NS(CerNS)增至177%，带内质网定位信号的人DESl (DESlm) 表达酵母SUR2/SCS7/YDC1三重阻断株的神经酰胺NS(CerNS)增至232%。实施例8带EGFP的人DESl (EGFP~hDESl)或带EGFP和内质网定位信号的人 DESl (EGFP-hDESlm)表达载体的制备为了分析带hDESl和内质网定位信号的hDESlm在酵母的细胞中定位于何处，在本 实施例中，制备在各hDESl的N末端侧连接了 EGFP的框架。载体的构建方法如下所示。从实施例1中记载的phDESl，用限制酶BamHI和 XhoI切取DESl基因，插入pRS314-GAL-EGFP-EBP2载体(具有GAll启动子和TDH终 止子的PRS314表达载体的EcoRI和BamHI位点插入了 EGFP基因、在BamHI和XhoI 位点插入了 EBP2基因的载体；由广岛大学Dr.Keiko Mizuta提供)的同限制酶部位 (PRS314-GAL-EGFP-DES1)。用限制酶EcoRI和XhoI切取EGFP-DES1基因，亚克隆到酵母用 基因表达载体 pRS426-GDP (Mumberg et al.，Gene, 156，119，1995) (pEGFP-hDESl)。将用限制酶EcoRI和BamHI从pEGFP-hDESl切取的EGFP基因部分约750bp片 段(EGFP-BamHI)插入实施例5中记载的hDESlm表达载体(phDESlm)的BamHI位点 (pEGFP-hDESlm)。
实施例9具有带EGFP的人DESl (EGFP~hDESl)或带EGFP和内质网定位信号的人DESl(EGFP-hDESlm)表汰裁体的DESl蛋白质定位解析用转化株的制各在实施例2和3得到的SUR2阻断株和SUR2/SCS7双重阻断株以及实施例2中记载的Π(113株中用常法将EGFP-hDESl基因(实施例8)或EGFP-hDESlm基因(实施例8) 表达载体转化。转化体的筛选通过使用添加了组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、腺嘌呤以及色氨酸 的不含尿嘧啶的最少平板培养基来进行。I. FKl 13 株(实施例 2)+EGFP-hDESl 基因表达II. SUR2阻断株(实施例2) +EGFP-hDESl基因表达III. SUR2/SCS7双重阻断株(实施例3)+EGFP-hDESl基因表达IV. FKl 13 株(实施例 2) +EGFP-hDESlm 基因表达V. SUR2阻断株(实施例2) +EGFP-hDES Im基因表达VI. SUR2/SCS7双重阻断株(实施例3) +EGFP-hDESlm基因表达实施例10具有带EGFP的人DESl (EGFP-hDESl)或带EGFP和内质网定位信号的人 DESl (EGFP-hDESlm)表汰载体的DESl蛋白质的定位分析将实施例9得到的I. EGFP-hDESl基因表达酵母FK113株、II. EGFP-hDESl 基因表达酵母SUR2阻断株、III. EGFP-hDESl基因表达酵母SUR2/SCS7双重阻断株、 IV. EGFP-hDES Im基因表达酵母FK113株、V. EGFP-hDES Im基因表达酵母SUR2阻断株、 VI. EGFP-hDESlm基因表达酵母SUR2/SCS7双重阻断株分别用添加了组氨酸、亮氨酸、赖氨 酸、腺嘌呤以及色氨酸的不含尿嘧啶的最少液体培养基在25°C下振荡培养过夜。用荧光显 微镜(OLMPUS BX51)，用GFP用滤色片观察EGFP融合蛋白质的定位。结果如图7所示。证实hDESlm在任一株中均在内质网定位。
权利要求
在酵母细胞内制造人型神经酰胺的方法，其特征在于，其包括1)通过酵母细胞的转化，导入带内质网定位信号的鞘脂Δ4-去饱和酶基因DES1m，该DES1m通过在鞘脂Δ4-去饱和酶基因DES1的3’末端添加编码酵母的内质网定位信号的碱基序列而得到；及，2)通过酵母细胞的转化，使酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因SUR2的表达缺失。
2.如权利要求1所述的制造方法，其中，内质网定位信号的氨基酸序列由包含2个以上 赖氨酸残基的4个或5个氨基酸残基组成。
3.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，内质网定位信号的氨基酸序列为VKKEK， V表示缬氨酸残基，K表示赖氨酸残基，E表示谷氨酸。
4.如权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，鞘脂Δ4-去饱和酶基因DESl编码下 述蛋白质，该蛋白质具有序列号2的氨基酸序列或序列号2中1个或1个以上的氨基酸残基发生 缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有鞘脂△ 4-去饱和酶活性。
5.如权利要求1 4中任一项所述的方法，其中，带内质网定位信号的鞘脂Δ4-去饱 和酶基因DESlm编码由序列号4的氨基酸序列组成的蛋白质。
6.如权利要求1 5中任一项所述的方法，其中，酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因 SUR2编码下述蛋白质，该蛋白质具有序列号6的氨基酸序列或序列号6中1个或1个以上的氨基酸残基发生 缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶活性。
7.如权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，进一步包括通过酵母细胞的转化，使 酵母神经鞘脂类α -羟化酶基因SCS7的表达缺失。
8.如权利要求7所述的方法，其中，酵母神经鞘脂类α-羟化酶基因(SCS7)编码下述 蛋白质，该蛋白质具有序列号8的氨基酸序列或序列号8中1个或1个以上的氨基酸残基发生 缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有神经鞘脂类α -羟化酶活性。
9.如权利要求1 8中任一项所述的方法，其中，进一步包括通过酵母细胞的转化，使 酵母碱性二氢神经酰胺酶基因YDCl的表达缺失。
10.如权利要求9所述的方法，其中，酵母碱性二氢神经酰胺酶基因YDCl编码下述蛋白质，该蛋白质具有序列号10的氨基酸序列或序列号10中1个或1个以上的氨基酸残基发 生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有碱性二氢神经酰胺酶活性。
11.如权利要求1 10中任一项所述的方法，其中，酵母从酵母属的酵母中选择。
全文摘要
本发明提供在酵母细胞内等的细胞内制造人型神经酰胺的方法。本发明的制造方法包括1)通过酵母细胞的转化，导入带内质网定位信号的鞘脂Δ4-去饱和酶基因(DES1m)，该DES1m通过在鞘脂Δ4-去饱和酶基因(DES1)的3’末端添加编码酵母的内质网定位信号的碱基序列而得到；及，2)通过酵母细胞的转化，使酵母二氢神经鞘氨醇C4-羟化酶基因(SUR2)的表达缺失。
文档编号C12P13/02GK101802209SQ200880013470
公开日2010年8月11日 申请日期2008年3月25日 优先权日2007年3月30日
发明者儿玉由纪子, 奥原宏明, 船户耕一 申请人:三得利控股株式会社;国立大学法人广岛大学