专利名称：细胞培养方法、细胞培养体系及培养基调整装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用密封的培养容器的细胞培养，特别涉及调整追加的培
养基的溶存气体量及pH使培养环境保持最佳状态的细胞培养方法、细胞 培养体系及培养基调整装置。
背景技术：
近年，在人工环境下培养细胞或组织、微生物等的细胞培养技术发展， 正积极应用于生物医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等医疗 领域。
该细胞培养技术己经实际应用于生产单克隆抗体或再生皮肤等必须 有效培养大量细胞的多个方面，成为极重要的技术。
在上述情况下，为了大量有效地培养细胞，以往提出了各种细胞培养 装置。
例如，专利文献l记载的细胞培养用具在容器主体设置有细胞培养袋 和用于阻止培养袋中的培养液流通的阻止部件，使用该阻止部件分隔培养 区域，随着细胞增殖能阶段地扩张培养区域。
通过使用上述细胞培养用具，可以从培养起始至其结束时刻在同一培 养袋内继续培养。
另外，专利文献2记载的用于生物体外增殖的装置具有具有培养空间 的细胞培养亚分区室的连续列与能可变地释放且隔断亚分区室间液体连 通的调整构件，随着细胞增殖，阶段地扩张培养区域。
由此，可以提供适合确保细胞存活的小规模的起始环境与增大规模的 环境，可以在没有转移污染危险的情况下经济且省时地培养高细胞数集 团。
进而，专利文献3记载的培养容器是培养沿着底面生长的细胞的培养 容器，能对应细胞生长扩大底面的面积。由此，能在单一容器内有效地增殖细胞。
但是，上述现有的细胞培养装置中，关于在培养区域扩张时追加的培 养基并没有进行特别研究。
例如，专利文献l记载了下述内容如果在被第一阻止部件分隔的培 养区域内，细胞增殖至所希望的程度的话，用第二阻止部件分隔袋，此时， 与培养细胞的增殖能力相对应地确定培养基的量，使培养区域扩张时的细 胞密度维持在适当的范围内。并且记载了通常确定培养基的量使培养开始 时或培养区域扩张时的细胞密度为lxl()S个/ml左右，并且根据使用的细胞 种类和增殖特性或培养目的来适当设定细胞密度即可。
另一方面，专利文献1中，并没有明确记载如何调整追加的培养基成 分，考虑追加最适合用于最初培养基的培养基。
但是，由于随着细胞增殖，培养基环境慢慢变差，所以追加与最初的 培养基相同条件的培养基时，刚追加后的培养环境虽然提高，但无法维持 最初的培养基环境。
艮P，细胞增殖的结果是，培养基的溶存氧量降低，溶存二氧化碳量增 加。另外，因产生乳酸等，培养基的pH慢慢降低。即使在上述培养基中追 加例如相同量的与最初培养基相同条件的培养基，也无法使培养基整体恢 复到最初的最佳环境。
上述问题在实施专利文献2及3记载的发明的情况下也同样发生。
专利文献l记载了下述内容将袋放入碳酸气体培养器内，在培养所
需的气体气氛下静置培养，培养温度、培养时间、pH、 二氧化碳浓度等条
件根据使用的细胞设定。
另外，专利文献2记载了下述内容当在最初的亚分区室中达到细胞 生长和存活性的界限时，将内容物(细胞、培养基)转移到后续连续的亚分 区室，在后续亚分区室内中，利用加入其中的培养基和容量等提供来自最 初的亚分区室的细胞集团保持存活力同时进一步增加所需的必要条件。
进而，专利文献3中记载了下述内容通过将混合的间充质干细胞和 培养基维持在规定的温度及二氧化碳浓度等的培养条件，经规定时间，在 一定培养条件下细胞被二次培养。
认为上述现有技术中，如上所述，没有考虑追加的培养基的成分条件，追加与最初的培养基相同条件的培养基，随后调整温度和C02浓度等培养 条件。
专利文献1:日本特开2000-125848号公报
专利文献2:专利第2981684号公报
专利文献3:日本特开2004-89136号公报
发明内容
但是，仅用上述方法事实上无法适当改善因细胞增殖而变差的环境， 难以将培养基的pH和溶存二氧化碳量、溶存氧量等的环境常维持在最佳状 态。
另外，即使参照其他现有技术文献，也没有记载在密封的培养容器下 的细胞培养中，能将培养环境保持在最佳状态的技术。
本发明是鉴于上述情况而得到的，目的在于提供一种细胞培养方法、 细胞培养体系及培养基调整装置，在被密封的培养容器中的细胞培养中， 在培养中的培养基中追加并混合新培养基后，预先调整追加的培养基的pH
及溶存气体量使培养环境为最适合细胞增殖的条件，由此将培养环境保持 在最佳状态。
为了达到上述目的，本发明的细胞培养方法是在封入有细胞和培养基
的培养容器中新追加培养基来培养细胞的细胞培养方法，是下述方法调
整追加的培养基的pH及溶存气体量，混合调整的培养基与培养容器内的培 养基，从而将培养容器内的培养基状态调整为最适合细胞培养的条件，培 养培养容器内的细胞。
如果细胞培养方法为上述方法，则在培养容器内的培养基中新追加培 养基时，可以调整追加的培养基使混合后的培养基状态为最佳。
因此，以往存在下述问题，即使新追加培养基，也无法使追加后的培 养基最佳，培养环境慢慢变差，妨碍细胞增殖，但根据本发明，由于可以 使追加后的培养基最佳化，所以可以使培养环境常维持最佳状态。
需要说明的是，"培养基"作为包括培养液和培养基的情况进行使用。
另外，本发明的细胞培养方法是下述方法通过将追加的培养基的pH
调整至比最适合细胞培养的pH高、和/或将追加的培养基的溶存二氧化碳
6分压调整至比最适合细胞培养的压力低、和/或将追加的培养基的溶存氧分 压调整至比最适合细胞培养的压力高，混合调整的培养基与培养容器内的 培养基，由此将培养容器内的培养基的至少pH、溶存二氧化碳分压或溶存 氧分压的任一个调整至最适合细胞培养的条件，培养培养容器内的细胞。
如果细胞培养方法为上述方法，则将追加的培养基的pH、溶存二氧化
碳分压及溶存氧分压分别调整至不超过最适合细胞培养的值的值，即不超 出最适合与因培养而各个值发生变化的方向相反的方向的条件，可以与培 养容器内的培养基混合。
因此，可以使混合后的培养基状态回复到最适合细胞培养的状态，并 能将培养环境常维持于最佳状态。
另外，本发明的细胞培养方法是扩张培养容器的容积、追加新培养基
的方法。
如果细胞培养方法为该方法，则用各种方法扩张密封的培养容器，增 加培养容积，追加新培养基时，可以将追加后的培养环境维持在最佳状态。
另外，本发明的细胞培养方法是下述方法培养容器由软包材料形成， 用规定的部件挤压培养容器，将该培养容器分隔为包括培养部与能扩张部 的二个室以上，对应培养部的细胞数增加使部件与培养容器相对移动，来 扩张培养部的容积。
如果细胞培养方法为上述方法，则用软包材料构成培养容器，例如使 用辊部件将培养容器分隔为培养部与能扩张部，由此可以对应培养细胞数 的增加扩张培养部，同时在培养部扩张时追加培养基时，可以追加培养基 使混合后的培养基为最佳。
因此，即使培养细胞数增加，也能在不使培养基变差的情况下使培养 环境常处于最佳状态。
另外，本发明的细胞培养方法是混合后培养容器内的培养基的pH为
6.5 7.5的方法。
另外，本发明的细胞培养方法是混合后培养容器内的培养基的溶存二 氧化碳分压为20mmHg 50mmHg的方法。
另外，本发明的细胞培养方法是混合后培养容器内的培养基的溶存氧 分压为115mmHg 170mmHg的方法。
7如果细胞培养方法为上述方法，则可以使追加新培养基后的培养基的 pH、溶存二氧化碳分压、溶存氧分压分别最佳化，从而能将培养环境常维 持在最佳状态。
另外，本发明的细胞培养方法是混合后培养容器内的细胞密度为
5 x 103个/011 3 x 1 ()6个/ml的方法。
如果细胞培养方法为上述方法，则可以处于追加新培养基后的细胞密 度不过低且不过高的最佳状态。
因此，能将细胞增殖效率维持在最佳状态。
另外，本发明的细胞培养体系是在封入有细胞和培养基的培养容器中
新追加培养基来培养细胞的细胞培养体系，为具有下述构件的构成调整 追加的培养基pH及溶存气体量的培养基调整装置；封入有培养基与细胞的 培养容器；和将追加的培养基从培养基调整装置输送至培养容器的管。
如果细胞培养体系为上述构成，则可以调整在封入有培养基与细胞的 培养容器中新追加的培养基，使混合后的培养基状态为最佳。
因此，能将培养环境常维持于最佳状态。
另外，本发明的细胞培养体系为还具有下述构件的构成使用规定的 部件挤压由软包材料形成的培养容器，将该培养容器分隔成包括培养部与 能扩张部的二个室以上，对应培养部的细胞数增加使部件与培养容器相对 移动来扩张培养部容积的细胞培养装置。
该细胞培养体系具有将培养容器分隔成培养部与能扩张部，对应细胞 数增加来扩张培养部容积的细胞培养装置，培养部的容积被扩张时，必须 新追加培养基。
此时，根据本发明，可以调整追加的培养基状态使混合后培养基的状 态处于最佳，从而可以将培养环境常维持在最佳状态。
另外，本发明的培养基调整装置是在封入有细胞和培养基的培养容器 中新追加培养基来培养细胞的培养基调整装置，为下述构成将追加的培 养基pH调整至比最适合细胞培养的pH高、和/或将追加的培养基的溶存二 氧化碳分压调整至比最适合细胞培养的压力低、和/或将追加的培养基的溶 存氧分压调整至比最适合细胞培养的压力高。
如果培养基调整装置为上述构成，则在封入细胞和培养基的培养容器中新追加培养基时，能将该追加的培养基调整至使追加后的培养基状态处 于最佳。
根据本发明，在培养容器内的培养基中新追加培养基时，可以调整追 加的培养基使混合后培养基状态处于最佳。
因此，可以使混合后的培养基最佳化，从而可以将培养环境常维持于 最佳状态。
是表示本发明第一实施方案的细胞培养体系构成的框图。是表示本发明第一实施方案的细胞培养体系的培养液追加前后 的培养部环境的图。是表示本发明第二实施方案的细胞培养体系构成的框图。
具体实施例方式
以下，参见
本发明的细胞培养方法、细胞培养体系及培养基 调整装置的优选实施方案。 [第一实施方案]
首先，参见图l说明本发明第一实施方案的构成。该图是表示本实施 方案的细胞培养体系构成的框图。
如图1所示，本实施方案的细胞培养体系具有细胞培养装置IO、培养 库20、培养液调整装置(培养基调整装置)30、培养液贮藏容器(培养基贮藏 容器)40、保管库50、回收容器60、管70。
细胞培养装置10如该图所示，具有培养容器ll、容器装载台12和辊13。
培养容器ll是封入有作为培养对象的细胞(培养细胞)和用于培养该细 胞的培养基(包括培养液和培养基)进行培养的容器。在该培养容器ll中， 将能封入培养细胞和培养基的部分称为培养部U-1，将由于被辊13分隔而 培养细胞和培养基不能进入的部分称为能扩张部ll-2。
培养容器ll以软包材料为材料形成为袋状(袋型)。
所谓软包材料，是指将可挠性'柔软性赋予包装体的包装材料。由此， 培养容器11可以随着辊13的挤压.旋转挠性地改变培养部11-1的容积。关于软包材料，例如记载于日本特开2002-255277号公报(使用软包材料膜片的 食品包装体及食品的取出方法)、日本特开2004-323077号公报(加压挤出形 的袋状容器)等，是周知技术。
另外，培养容器ll具有细胞培养所需的气体透过性。由此，可以将细 胞培养体系设定为封闭体系(密封体系)。并且，为了能确认内容物，培养 容器l 1的一部分或全部具有透明性。
作为满足作为上述培养容器ll的条件的包装材料的具体例，可以举出 聚烯烃、乙烯-乙酸乙烯基酯共聚物、苯乙烯系弹性体、聚酯系热塑性弹性 体、硅酮系热塑性弹性体、硅酮橡胶等。
该培养容器ll的四条边被密封，但其中一边连接有2根以上管70。其 中l根是用于将培养细胞和培养基从外部注入培养部ll-l的注入用管(管 70-1)，另l根是用于将培养细胞和培养基从培养部ll-l回收的回收用管(管 70-2)。另外，如图1所示，安装有3根管70时，第3根是用于将培养细胞和 培养基作为样品从培养部ll-l取出的采样用管。
作为该管70的材质，可以使用例如硅酮橡胶、软质氯乙烯树脂、聚丁 二烯树脂、乙烯-乙酸乙烯基酯共聚物、氯化聚乙烯树脂、聚氨酯系热塑性 弹性体、聚酯系热塑性弹性体、硅酮系热塑性弹性体、苯乙烯系弹性体、 例如，SBS(苯乙烯.丁二烯.苯乙烯)、SIS(苯乙烯'异戊烯.苯乙烯)、SEBS(苯 乙烯.乙烯.丁烯.苯乙烯)、SEPS(苯乙烯'乙烯'丙烯'苯乙烯)等。上述材质具 有优异的气体透过性。
容器装载台12是上面载置有培养容器11 、进而在该培养容器l l上面配 设有辊13的平面台。
辊13形成圆柱状，以使轴方向与培养容器ll的幅方向平行的方式配设 在培养容器ll上面，如图1所示，可以沿着培养容器ll的长度方向水平地
旋转移动。
该辊13的轴方向的长度比培养容器11的宽度长，辊13在自身重量等的 作用下辊13的表面挤压培养容器11。
因此，培养容器11以辊13的挤压位置为边界，分成培养部ll-l与能扩 张部ll-2的二个室。此时，安装有管70的室为培养部11-1，于其中封入培 养细胞和培养基。需要说明的是，于细胞培养装置10安装2根以上辊13，例如分别以培 养容器11的长度方向的两端侧的室为培养部11-1A、培养部11-1B，以形成 于中央的室为能扩张部11-2等能设定二个室以上的培养部11-1与能扩张部 11-2。
然后，辊13与培养容器11的上面连接，同时边旋转边在容器长度方向 移动，由此培养部ll-l的容积连续变化。
具体而言，在于培养部ll-l内培养细胞的状态下，辊13被控制在增加 培养部ll-l容积的方向移动，可以对应培养状态将培养部ll-l维持于最佳 容积。
另一方面，培养结束回收培养基和培养细胞时，辊13向减少培养部11-1 容积的方向移动，被辊13挤压的培养基和培养细胞通过管70被挤出到外部 (例如，下述回收容器60)，所以可以将它们自动回收。
培养库20将细胞培养装置10收纳于其内部，可以控制培养部ll-l的温 度、氧浓度、二氧化碳浓度，从而可以确保稳定的培养环境。
培养液调整装置30是将用保管库50冷藏的培养液贮藏容器40中的培 养液通过管70-l加热至适合培养细胞的温度，同时控制培养液的pH、溶存
二氧化碳分压及溶存氧分压。
此时，培养液调整装置30在与培养容器内的培养液混合后将培养液的 pH调整至比最适合细胞培养的pH高的值，使其达到最佳的pH。
另外，培养液调整装置30是在与培养容器内的培养液混合后将培养液 的溶存二氧化碳分压调整至比最适合细胞培养的溶存二氧化碳分压低的
值，使其达到最佳的溶存二氧化碳分压。
另外，培养液调整装置30是在与培养容器内的培养液混合后将培养液
的溶存氧分压调整至比最适合细胞培养的溶存氧分压高的值，使其达到最 佳的溶存氧分压。
利用上述培养液调整装置30的机构，能将培养液贮藏容器40中的培养 液在与培养容器内的培养液混合后，防止培养部11-l的培养液的温度降低。
另外，能将培养部ll-l中的培养液的pH、溶存二氧化碳分压及溶存氧 分压维持在最佳状态。
需要说明的是，也能限定该培养液调整装置30的机构，使其调整至少
iipH、溶存二氧化碳分压及溶存氧分压的任一种。
培养液贮藏容器(培养液罐)40是预先保持用于注入培养容器11的追加 的培养液的容器。该培养液贮藏容器40被收纳于保管库(保冷库)50。
该培养液贮藏容器40与培养容器11(载置于培养装载台12的器具)通过 具有柔软性的管70-l连结，在培养容积扩张时从培养液贮藏容器40向培养 容器ll输送培养液。
回收容器(离心用瓶)60是预存放从培养容器11回收的培养细胞和培养 基的容器。
该回收容器60能安装于离心分离机，通过进行离心分离，可以从培养 基回收培养细胞。
需要说明的是，回收容器60与培养容器11(载置于培养装载台12的器具) 可以通过具有柔软性的管70-2连结。通过该管70-2，培养基及培养细胞从 培养容器11回收到回收容器60 。
然后，参见图l说明本实施方案的细胞培养体系的动作(细胞培养方 法)。但是，本发明的细胞培养方法并不限定于以下的具体动作。
首先，在细胞培养装置10中，通过使辊旋转移动，将培养容器ll的培 养部ll-l的容积调节至适合目标培养的尺寸，于该培养部ll-l封入具有适 合培养的一定以上的细胞密度的细胞群和培养该细胞群的最佳培养基。
然后，将培养库20内的温度及二氧化碳浓度与氧浓度调节至适合培养 的值。
另外,将用于向培养器11追加的培养基注入培养液贮藏容器40，将该 培养液贮藏容器40冷藏于保管库50。
然后，培养容器H内的细胞增殖时，由于扩张培养部ll-l的容积，对 应增加的细胞量和细胞密度使辊13移动，在适当的位置配设辊13。
另外，将用于追加于培养容器11的培养液通过管70-1从培养液贮藏容 器40输入培养液调整装置30。此时，利用辊13的移动，将适合培养容器ll 扩张的容积的量的培养液输入培养液调整装置30。
然后，利用培养液调整装置30，在培养容器ll内的培养液中混合该管 70-1内的培养液后，将管70-l内的培养液pH调整至最适合细胞培养的pH。 该最佳的pH因作为培养对象的细胞而不同，但人类的大多组织细胞的情况
12下优选为6.5 7.5。
作为如上所述调整pH的具体构件，培养液调整装置30具有可以调整装 置内部的氧分压、二氧化碳分压及温度的形态，可以采取在该装置内部收 纳管70-l的形态。
此处，通过改变调整装置30内的溶存二氧化碳分压，能调整管70-l内 的培养液的pH。作为其他方法，能通过在培养液中添加碳酸盐等来调整。
另外，利用培养液调整装置30，在培养容器ll内的培养液中混合该管 70-1内的培养液后，将管70-l内的培养液的溶存二氧化碳ih压调整至最适 合细胞培养的溶存二氧化碳分压。该混合后最适合细胞培养的溶存二氧化 碳分压因作为培养对象的细胞而不同，但在人类的大部分组织细胞的情况 下优选为20mmHg 5 OmmHg 。
作为如上所述调整溶存二氧化碳分压的具体构件，例如，使用与上述 pH调整构件相同的装置，调整装置内部的二氧化碳分压，可以将管70-l内 的培养液调整至规定的溶存二氧化碳分压。
进而，利用培养液调整装置30，在培养容器ll内的培养液中混合该管 70-1内的培养液后，将管70-l内的培养液的溶存氧分压调整至最适合细胞 培养的溶存氧分压。在该混合后，最适合细胞培养的溶存氧分压因作为培 养对象的细胞而不同，但在人类的大部分组织细胞的情况下优选为 115mmHg 170mmHg 。
如上所述，作为用于调整溶存氧分压的具体方法，例如在上述培养液 调整装置30中，通过调整装置内的氧分压，可以将管70-l内的培养液调整 至规定的溶存氧分压。
如上所述地操作，用培养液调整装置30调整的培养液通过管70-l注入 培养容器l 1的培养部11-1 ，与培养部ll-l内的培养液混合。
该结果是，混合后的培养液的pH、溶存二氧化碳分压、溶存氧分压能 恢复至最适合细胞培养的值。
同样地，与增加的细胞量和时间经过对应地使辊13移动，使辊13移动 最终以大致整个培养容器11为培养部11-1。
在该过程中，培养部ll-l的培养液的pH、溶存二氧化碳分压、溶存氧 分压可以维持在最适合培养的状态。回收培养容器ll的培养基和培养细胞时，使辊13朝向连接有管70-2的
边旋转移动。
由此，培养部ll-l的容积逐渐减小，培养基等通过管70-2回收到回收 容器60。
需要说明的是，本实施方案中，在细胞培养装置10中，使用辊13改变 培养容器ll的培养部ll-l的容积，但本发明并不限定于此，此外，也可以 适用于用各种方法改变培养部ll-l容积的情况。
例如，如专利文献l所记载，使用阻止培养液流通的阻止部件阶段地 改变培养袋内的培养部的容积的情况，或如专利文献2所记载使具有培养 空间的培养亚分区室连续来阶段地改变培养空间的容积的情况也能适用 本发明。另外，如专利文献3所记载，也能适用于使用能扩大底面面积的 培养容器进行培养的情况。
如以上所说明，根据本实施方案的细胞培养体系，在培养容器内的培 养液中新追加培养液时，可以调整追加的培养液，使混合后的培养液pH、 溶存二氧化碳分压、溶存氧分压达到最佳。
因此，可以使混合后的培养液最佳化，从而可以将培养环境常维持于 最佳状态。
下面，参见图3说明本发明的第二实施方案。该图是表示第二实施方 案的细胞培养体系的构成的框图。
本实施方案在将追加的培养液的pH、溶存二氧化碳分压、溶存氧分压 在培养液贮藏容器40中调整的方面与第一实施方案不同。关于其他方面， 与第一实施方案相同。
如图3所示，本实施方案中，在培养液调整装置30内设置培养液贮藏 容器40，能调整该培养液贮藏容器40的培养液的pH、溶存二氧化碳分压、 溶存氧分压。
另外，优选在该培养液调整装置30设置冷却机能，能与第一实施方案 的保管库50相同的保冷。
如果细胞培养体系如上设置，则能进一步简化整体构成。 实施例(实施例l)
将容积为1L的培养容器配设在容器装载台，使辊移动，调节培养容器 的培养部的容积为0.1L。
然后，在该培养部注入0.1LRPMIMedium 1640(GIBCO公司制)作为培 养液，同时注入1000万个人白血病T淋巴瘤jurkat作为培养细胞。 使用i-STAT(Abbott公司帝ij)测定该培养液的pH，结果为7.17。 另外，使用i-STAT(Abbott公司制)测定该培养液的溶存二氧化碳分压， 结果为39mmHg。
进而，使用i-STAT(Abbott公司制)测定该培养液的溶存氧分压，结果 为140mmHg。
另外，培养液的温度为37'C。
然后，将该细胞培养3天。另外，调节培养库的温度，将培养液的温 度维持在37。C。
接着，与上述相同地测定培养液的pH、溶存二氧化碳分压、溶存氧分 压。其结果是，它们分别为6.8、 55mmHg、 135mmHg。
然后，在容器装载台上，使辊相对于培养容器移动，将培养部的容积 扩张0.2L，在该扩张的培养部从培养液贮藏容器40经由培养液调整装置30 注入0.1L培养液。
此时，在培养液调整装置30中，调整追加的培养液的pH、溶存二氧化 碳分压、溶存氧分压，分别为7.4、 21mmHg、 180mmHg。
接着，与上述相同地测定追加培养液混合后的培养部的培养部的pH、 溶存二氧化碳分压、溶存氧分压。
其结果分别为7.1、 38mmHg、 150mmHg。
(比较例l)
与实施例1相同地将容积为1L的培养容器配设在容器装载台，使辊移 动，将培养容器的培养部的容积调节为0.1L。
然后，准备0.5LRPMI Medium 1640(GIBCO公司制)作为培养液，在该 培养部注入其中的0.1L，同时注入1000万个人白血病T淋巴瘤jurkat作为培
养细胞。
使用i-STAT(Abbott公司制)测定该培养液的pH，结果为7.17。
15另夕卜，使用i-STAT(Abbott公司制)测定该培养液的溶存二氧化碳分压， 结果为39mmHg。
进而，使用i-STAT(Abbott公司制)测定该培养液的溶存氧分压，结果 为1401nmHg。
另外，培养液的温度为37"C。
然后，将该培养液培养3天。另外，通过调节培养库的温度，将培养 液的温度维持在37"C。
接着，与上述相同地测定培养液的pH、溶存二氧化碳分压、溶存氧分 压。其结果是，它们分别为6.87、 55mmHg、 134mmHg。
然后，在容器装载台上使辊相对于培养容器移动，将培养部的容积扩 张为0.2L，在该扩张的培养部中注入0.1L与最初注入的培养液相同的培养 液(7.17、 39mmHg、 140mmHg)。
然后，与上述相同地测定追加培养液混合后的培养部的培养部的pH、
溶存二氧化碳分压、溶存氧分压。
其结果分别为7.03、 46mmHg、 136mmHg。
如上所述，使用本发明的培养方法追加培养液的实施例l中，扩张培 养部追加培养液后的培养液的pH、溶存二氧化碳分压、溶存氧分压与培养 开始时刻基本相同，可以维持最适合培养的环境。
另一方面，确认了使用现有的培养方法追加培养液的比较例l中，扩 张培养部追加培养液后的培养液的pH、溶存二氧化碳分压、溶存氧分压与 刚追加前的值相比，虽然改善成适合培养的数值，但比培养开始时刻差， 即使追加培养液，培养环境也慢慢变差。
当然本发明不限定于以上的实施方案，可以在本发明的范围中能进行 各种变更实施。
例如，在上述各实施方案中，仅对细胞培养条件中的pH、溶存二氧化 碳分压、溶存氧分压进行了调整，但也可以适用其他条件进行适当变更来 维持最佳状态等。
产业上的可利用性
本发明能优选用于需要大量培养细胞的生物医药或再生医疗、免疫疗
16法等领域中。
权利要求
1、一种细胞培养方法，其特征在于，其是在封入有细胞和培养基的培养容器中新追加培养基来培养所述细胞的细胞培养方法，其中，调整所述追加的培养基的pH及溶存气体量，并将调整后的培养基和所述培养容器内的培养基混合从而将培养容器内的培养基状态调整至最适合所述细胞培养的条件，由此来培养所述培养容器内的所述细胞。
2、 如权利要求l所述的细胞培养方法，其特征在于， 将所述追加的培养基的pH调整至比最适合所述细胞培养的pH高，和/或将所述追加的培养基的溶存二氧化碳分压调整至比最适合所述细胞培 养的压力低，和/或将所述追加的培养基的溶存氧分压调整至比最适合所述 细胞培养的压力高，并将调整后的培养基与所述培养容器内的培养基混合从而将培养容 器内的培养基的至少pH、溶存二氧化碳分压或溶存氧分压的任一个调整至 最适合所述细胞培养的条件，由此来培养所述培养容器内的所述细胞。
3、 如权利要求1或2所述的细胞培养方法，其特征在于，扩张所述培养容器的容积进行所述新的培养基的追加。
4、 如权利要求3所述的细胞培养方法，其特征在于，所述培养容器由软包材料形成，并使用规定的部件挤压所述培养容器 将该培养容器分割为包括培养部和能扩张部的二个室以上，并且与所述培 养部的细胞数增加对应地使所述部件与所述培养容器相对移动来扩张培 养部的容积。
5、 如权利要求1 4中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于， 所述混合后的培养容器内的培养基的pH为6.5 7.5。
6、 如权利要求1 5中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于， 所述混合后的培养容器内的培养基的溶存二氧化碳分压为20mmHg 50mmHg。
7、 如权利要求1 6中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于，所述混合后的培养容器内的培养基的溶存氧分压为115mmHg 170mmHg。
8、 如权利要求1 7中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于， 所述混合后的培养容器内的细胞密度为5xl()S个/ml 3xl0S个/ml。
9、 一种细胞培养体系，其特征在于，其是在封入有细胞和培养基的培养容器中新追加培养基来培养所述 细胞的细胞培养体系， 具有调整所述追加的培养基的pH和溶存气体量的培养基调整装置； 封入培养基和细胞的培养容器；和将所述追加的培养基从所述培养基调整装置输送至所述培养容器的管。
10、 如权利要求9所述的细胞培养体系，其特征在于， 还具有下述细胞培养装置，所述细胞培养装置使用规定的部件挤压由软包材料形成的所述培养容器将该培养容器分隔为包括培养部和能扩张 部的二个室以上，并与所述培养部的细胞数增加相对应地使所述部件与所 述培养容器相对移动来扩张所述培养部的容积。
11、 一种培养基调整装置，其特征在于，其是用于在封入有细胞和培养基的培养容器中新追加培养基来培养 所述细胞的培养基调整装置，其中，将所述追加的培养基的pH调整至比最适合所述细胞培养的pH高， 和/或将所述追加的培养基的溶存二氧化碳分压调整至比最适合所述细胞 培养的压力低，和/或将所述追加的培养基的溶存氧分压调整至比最适合所 述细胞的培养的压力高。
全文摘要
在密封的培养容器中的细胞培养中，防止培养环境慢慢变差。一种方法，其是在封入有细胞和培养基的培养容器中，新追加培养基培养细胞的细胞培养方法，是下述方法将追加的培养基的pH调整至比最适合细胞培养的pH高，和/或将追加的培养基的溶存二氧化碳分压调整至比最适合细胞培养的压力低，和/或将追加的培养基的溶存氧分压调整至比最适合细胞培养的压力高，通过混合调整的培养基与培养容器内的培养基，将培养容器内的培养基的至少pH、溶存二氧化碳分压或溶存氧分压的任一个调整至最适合细胞培养的条件，培养培养容器内的细胞。
文档编号C12N1/00GK101668844SQ20088001345
公开日2010年3月10日 申请日期2008年4月24日 优先权日2007年4月27日
发明者小暮正人, 时田伟子, 末永亮, 田中乡史, 石崎庸一 申请人:东洋制罐株式会社