使用抗衰老化合物产生蛋白质的方法

专利名称：使用抗衰老化合物产生蛋白质的方法
技术领域：
无
背景技术：
本发明概言之涉及在哺乳动物细胞培养物中产生蛋白质。特定地，本发明涉及在抗衰老化合物(例如，肌肽)的存在下培养哺乳动物细胞以维持存活力并增加生产力，同时具有优良质量。培养细胞己产生出许多蛋白质产物。这些产物(例如杂交瘤产生的单克隆抗体)可用于治疗、研究或其它应用。通常使用动物细胞、特别是哺乳动物细胞来产生蛋白质。遗憾的是，使用动物细胞使得生产过耗费时间且成本高。
将化学试剂添加到细胞培养基中可通过诱导细胞产生产物来增加细胞生产力，由此增加总产量。使用的最佳试剂随许多因素而变，所述因素包括期望的蛋白质产物和细胞类型。类似的因素也影响所添加选定试剂的量和将试剂添加到细胞培养基中的时间。试剂的实例是烷酸或盐、尿素衍生物或二甲亚砜(DMSO)。诸如丁酸钠等化学试剂可对蛋白质产生具有多种效应。添加试剂可增加细胞的比生产力，但其也可具有细胞毒性效应且可抑制细胞生长和存活力。
通常，当细胞产生蛋白质时，蛋白质被分泌到细胞培养基中。然而，特定蛋白质并非培养基中的唯一物质；高分子量聚集体、酸性物质和其它物质通常也存在于培养基中，这些物质可使得纯化过程更费力且成本高。可使用各种技术和方法来提高产物质量，从而能够更有效进行蛋白质纯化；其尤其包括改变生物反应器的条件或使用不同的细胞系。然而，尽管如此此领域中仍需要导致经改良纯化过程的蛋白质生产技术和方法。
因此，业内需要添加到细胞培养基中可增强所关注蛋白质的表达同时维持高细胞存活力的化学试剂。业内进一步需要通过减少细胞培养基中高分子量聚集体和酸性物质的量来提高蛋白质的产物质量的试剂。

发明内容
在某些实施例中，本发明涉及增强蛋白质产物产生的方法。例如，在某些实施例中，本发明提供在包含抗衰老化合物的培养基中培养表达所关注蛋白质的宿主细胞的方法以便增强所关注蛋白质的总体产生。在某些实施例中，所述抗衰老化合物包含肌肽。
在某些实施例中，本发明提供增强所关注蛋白质产生的组合物。许多蛋白质中的任何一种都可根据本发明的方法和组合物来产生。例如，在某些实施例中，使用本发明的方法和组合物产生抗体。在某些实施例中，使用本发明的方法和组合物来产生任选地连接至一个或一个以上的额外蛋白质部分的受体。例如，本发明的方法和组合物可用于产生TNFR融合蛋白。
在某些实施例中，本发明提供细胞培养基，其包含增强表达于宿主细胞中的所关注蛋白质的产生的抗衰老化合物。在某些实施例中，所述抗衰老化合物包含肌肽。在某些实施例中，遗传上操纵的宿主细胞与接种物培养基组合形成细胞培养基，所述细胞培养基在生物反应器中生长。在期望蛋白质产物的生产运行期间，可改变生物反应器的条件和/或可添加补充物以提高生产力和/或维持存活力。补充物可包括补料培养基和/或一种或一种以上的添加剂(例如，在本发明中，肌肽和/或其它抗衰老化合物)。
哺乳动物宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)在生物反应器中在生产运行快结束时可经历存活力的降低。已发现，添加抗衰老剂(例如肌肽和其类似物)到细胞培养基中有助于维持较高的活细胞数目和细胞存活力直至蛋白质收获为止。
此外，根据本发明可使用提高生产力的方法(例如在生产运行的生长期之后和/或在生产期期间改变温度)。给出但仅是一个实例，在蛋白质产物、特别是生长分化因子-8 (GDF-8)的抗体的产生期间，温度向下改变以帮助引发和提高生产力。在某些实施例中，添加抗衰老化合物(例如肌肽)帮助提高细胞培养物的生产力。在某些实施例中，抗衰老化合物可在所述温度改变之前、期间和/或之后添加。
还发现，将抗衰老化合物(例如肌肽)添加到细胞培养基中提高蛋白质产物的总体质量。在蛋白质的产生期间，细胞培养基中有高分子量聚集体和其它不期望的物质。肌肽的添加降低了高分子聚集体的量且提高产物质量。在某些实施例中，添加除肌肽以外的抗衰老化合物降低所述高分子量聚集体的积累并提高产物质量。在某些实施例中，肌肽与一种或一种以上的额外抗衰老化合物组合添加。
抗衰老化合物(例如，肌肽)添加到细胞培养基中的浓度可随许多工艺因素而变，所述因素尤其包括(例如)细胞类型、期望产物和生物反应器的条件。而且，肌肽可由其类似物乙酰基肌肽、高肌肽、鹅肌肽和p-丙氨酸代替。在某些实施例中，肌肽与一种或一种以上的其它抗衰老化合物组合提供。在某些实施例中，抗衰老剂(例如，肌肽)在细胞培养基中的浓度为约5 mM至约100 mM。在某些实施例中，浓度为约10mM至约40mM。在某些实施例中，浓度为约20mM。任何适宜的培养程序和接种物培养基都可用于在蛋白质产生过程中培养细胞。可使用血清和无血清培养基二者。此外，可视需要针对特定细胞类型和蛋白质产物使用各种培养方法来培养所需细胞。所述程序已为熟悉细胞培养技术的技术人员所熟知和了解。
从以下说明和权利要求书中将明了本发明的其它特征和优点。


图la.肌肽对MYO-29酸性峰值的影响。
图lb.肌肽对高分子量聚集体的影响。
图lc.在不同天数时添加肌肽对酸性峰值的影响。
图ld.在不同天数时添加肌肽对高分子量聚集体的影响。
图2a.肌肽对每日活细胞密度的影响。
图2b.肌肽对每日细胞存活力的影响。
图2c.肌肽对每日效价的影响。
图2d.肌肽对累积比细胞生产力的影响。第12天和第14天的各个条从左到右代表对照A第10天补料，20mM肌肽第10天补料，对照B第10天补料，20 mM肌肽(第10天未补料)，和对照C (第10天未补料)。
图2e.肌肽对高分子量聚集体的影响。第12天和第14天的各个条从左到右代表对照A第10天补料，20mM肌肽第10天补料，对照B第10天补料，20 mM肌肽(第10天未补料)，和对照C (第10天未补料)。
图3a.不同浓度的肌肽对活细胞密度的影响。
图3b.不同浓度的肌肽对每日细胞存活力的影响。
图3c.不同浓度的肌肽对每日效价的影响。
图3(1.不同浓度的肌肽对累积比细胞生产力的影响。各个条从左到右代表对照P2，对照P5， 20mM肌肽和40mM肌肽。
图3e.不同浓度的肌肽对高分子量聚集体的影响。各个条从左到右代表对照P2，对照P5, 20 mM肌肽和40 mM肌肽。
图4.在含有或缺少肌肽的培养基中所生长的产生重组TNFR融合蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的活细胞密度曲线。对照条件是4个对照生物反应器运行的平均值。
图5.在含有或缺少肌肽的培养基中所生长的产生重组TNFR融合蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的细胞存活力曲线。对照条件是4个对照生物反应器运行的平均值。
图6.肌肽对聚集/错误折叠TNFR融合蛋白的百分比的影响。对照条件是4个对照生物反应器运行的平均值。图7.肌肽对由产生重组TNFR融合蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系所产生的 高分子量(HMW)聚集体的百分比的影响。对照条件是4个对照生物反应器运行的平均 值。
图8.在含有或缺少肌肽的培养基中所生长的产生重组TNFR融合蛋白的中国仓 鼠卵巢(CHO)细胞系的产物效价曲线。对照条件是4个对照生物反应器运行的平均值。
图9.在含有或缺少肌肽的培养基中所生长的产生重组TNFR融合蛋白的中国仓 鼠卵巢(CHO)细胞系的比细胞生产力曲线。对照条件是4个对照生物反应器运行的平 均值。
图10.由在含有或缺少肌肽的培养基中所生长的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系所产 生的重组TNFR融合蛋白的总唾液酸化曲线(表示为参考物质的百分比)。对照条件 是4个对照生物反应器运行的平均值。
图11.由在含有或缺少肌肽的培养基中所生长的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系所产 生的重组TNFR融合蛋白的唾液酸化N-连接寡糖的分布(表示为总N-连接寡糖的百 分比)。对照条件是4个对照生物反应器运行的平均值。
具体实施例方式
定义
根据长期的惯例，当在此申请案(包括权利要求书)中使用时，术语"一种(a 和an)"是指"一种或一种以上"。即使已在某一特定程度上阐释了本发明，但很明 显，根据揭示内容对于那些所属领域的技术人员许多替代、修改和改变将显而易见。 因此，在本发明的精神和范围内的所有所述替代、修改和改变意欲由所界定的权利要 求书涵盖。
本文所用的术语"抗衰老化合物"是指当添加到细胞培养物中时促进其中所生长细 胞的存活力、生长和/或生存期的任何试剂或化合物。在某些实施例中，与在缺少所述 抗衰老化合物且其它方面相同的培养条件下观测到的相比，在细胞培养物中使用抗衰 老化合物使得效价提高、细胞比生产力提高、细胞存活力提高、积分活细胞密度增加、 高分子量聚集体的积累减少和/或酸性物质的积累减少。根据本发明的方法和组合物可 使用的抗衰老化合物的非限制性实例包括肌肽、乙酰基肌肽、高肌肽、鹅肌肽和P-丙 氨酸。在某些实施例中，根据本发明的组合物和方法可使用两种或两种以上的抗衰老 化合物。
短语"宿主细胞"是指能够遗传上操纵和/或能够在细胞培养基中生长和存活的细 胞。通常，所述细胞可表达许多所关注内源或异源蛋白质且可保留蛋白质或将其分泌 到细胞培养基中。
宿主细胞通常是"哺乳动物细胞"，其包含脊椎动物细胞的非限制性实例，其包 括幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人类肾(293)细胞、正常猕猴胎二倍体(FRhL-2)细胞、和鼠科动物骨髓瘤(例如，SP2/0和NSO)细胞。所属领域的技 术人员应了解根据本发明的方法和组合物可使用的其它宿主细胞。
术语"细胞培养基"是指包含营养物以在细胞可生长并产生期望蛋白质的条件下支 持细胞存活的溶液。短语"接种培养基"或"接种物培养基"是指包含营养物且在其 中开始细胞培养的溶液或物质。在某些实施例中，"补料培养基"含有与接种培养基 相似的营养物，但是在培养开始之后补料给细胞的溶液或物质。在某些实施例中，补 料培养基含有接种培养基中不存在的一种或一种以上的组份。在某些实施例中，补料 培养基缺少接种培养基中存在的一种或一种以上的组份。熟悉细胞培养技术的人员无 需过多试验就应得知构成接种和补料培养基的各种组份。通常，这些溶液提供细胞生 长和存活所需要的必需和非必需氨基酸、维生素、能量源、脂质和微量元素。在某些 实施例中，接种培养基、补料培养基或二者包含抗衰老化合物。
本文所用的术语"细胞培养物特征"是指可观测到和/或可测量的细胞培养物特征。 本发明的方法和组合物有利地用于改良一种或一种以上的细胞培养物特征。在某些实 施例中，细胞培养物特征的改良包含细胞培养物特征的量值增加。在某些实施例中， 细胞培养物特征的改良包含细胞培养物特征的量值降低。作为非限制性实例，细胞培 养物特征可为效价、细胞比生产力、细胞存活力、积分活细胞密度、高分子量聚集体 的积累、和/或酸性物质的积累。所属领域的技术人员将了解可使用本发明的方法和组 合物改良的其它细胞培养物特征。
本文所用的术语"确定成分的培养基"是指培养基的组成已知且受控的培养基。确 定成分的培养基不包含复合添加剂(例如血清)或包含未知和/或不受控制的组份的水 解产物。
本文所用的术语"复合培养基"是指包含至少一种其身份或数量未知或不受控制的 组份的培养基。
短语"细胞系"通常是指表达所关注蛋白质的初代宿主细胞。在一些实施例中，细 胞已被编码期望蛋白质和/或包含激活所连接序列(无论是内源序列还是异源序列)的 表达的控制序列的外源DNA转染。在某些实施例中，源自所述经遗传修饰的细胞的 细胞形成细胞系并将其放在细胞培养基中以生长并产生蛋白质产物。在某些实施例中， 细胞系包含未经外源DNA转染且表达所关注内源蛋白质的初代宿主细胞。
细胞培养基的"生长期"是指细胞经受快速分裂和指数、或接近于指数生长时的 时期。典型地，细胞在针对细胞生长进行优化的条件下通常培养1-4天。生长期条件 可包括温度在约35'C至42'C下、通常约37'C。生长期的长度和生长期的培养条件可 有所变化，但通常已为熟悉细胞培养领域的技术人员习知。在某些实施例中，生长期 中的细胞培养基补充有补料培养基。
"过渡期"出现在细胞培养基正从符合生长期的条件改变至符合生产期的条件的 期间。在过渡期期间，通常改变尤其诸如温度等各种因素。在某些实施例中，过渡期 中的细胞培养基补充有补料培养基。
9"生产期"出现在生长期和过渡期二者之后。细胞的指数生长已经结束且蛋白质 产生是首要目标。可补充细胞培养基以引发产生。在某些实施例中，生产期中的细胞 培养基补充有补料培养基。此外，细胞培养基在生产期期间的温度通常可低于生长期 期间的温度，此通常会促进生产。生产期一直继续到达成期望终点为止。
短语"活细胞密度"是指在细胞培养基中在特定体积中(通常每ml)存活的细胞的 总数目。短语"细胞存活力"是指与细胞(死的和活的两种细胞)的总数目相比活着的 细胞的数目(表示为百分比)。
"积分活细胞密度"、"IVCD":本文所用术语"积分活细胞密度"或"IVCD"
是指活细胞在培养过程中的平均密度乘以培养进行的时间。当所产生蛋白质的量与在 培养过程中所存在活细胞数目成比例时，积分活细胞密度是评估在培养过程中所产生 蛋白质量的有用工具。
术语"高分子量聚集体"通常是指错误折叠的蛋白质或至少两个多肽的不当缔合。 所述缔合可源于任何方法，其包括但不限于共价交联、非共价交联、二硫化物交联、 或不可还原性交联。在某些实施例中，本发明的方法和组合物有利地用于减少高分子 量聚集体的积累。
短语"抗氧化剂"是指可通过阻断自由基来防止对脂质、蛋白质、DNA和其它基本 大分子的氧化损害的化合物。
"治疗性蛋白质""治疗性蛋白质"是对其在体内的一个作用区域或对其通过 中间体远程作用的一个身体区域具有生物效应的蛋白质或肽。治疗性蛋白质可为(例 如)分泌性蛋白，例如，抗体、抗体的抗原结合片段、可溶受体、受体融合物、细胞 因子、生长因子、酶、或凝血因子，如下文更详细的阐述。以上蛋白质的列表仅为实 例性的，且并不意欲作为限制性列举。所属领域的技术人员将了解，任何蛋白质均可 用于本发明且将能够根据需要选择欲产生的特定蛋白质。
如说明书中所用，术语多肽、蛋白质和肽同义且可互换使用。因此，如本文所用， 蛋白质、肽或多肽的尺寸通常包含2个以上的氨基酸。例如，蛋白质、肽或多肽可包 含约2至约20个氨基酸、约20至约40个氨基酸、约40至约100个氨基酸、约100 个氨基酸至约200个氨基酸、约200个氨基酸至约300个氨基酸等。
如本文所用，氨基酸是指所属领域熟知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍 生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施例中，蛋白质或肽的残基是连续的，氨基酸残 基的序列未间杂任何非氨基酸。在其它实施例中，序列可包含一个或一个以上的非氨 基酸部分。在特定实施例中，蛋白质或肽残基的序列可间杂有一个或一个以上的非氨 基酸部分。
"抗体"使用术语"抗体"指具有抗原结合区的任何类抗体分子且其包括抗体片 段，例如Fab'、 Fab、 F(ab')2、单结构域抗体(DAB)、 Fv、 scFv (单链Fv)等。制备和 使用各种基于抗体的构造和片段的技术已为所属领域熟知。制备和表征抗体的手段已 为所属领域熟知(参见，例如哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)，抗体实验室手册(抗体ALaboratory Manual),冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory), 1988;其以引用的 方式纳入本文中)。例如，抗体可包括至少一个且优选地两个全长重链，和至少一个 且优选地两个轻链。本文所用的术语"抗体"包括抗体片段或变体分子，例如抗原结合 片段(例如，Fab、 F(ab')2、 Fv、单链Fv片段)、重链片段(例如，骆驼科动物VHH) 和结合结构域-免疫球蛋白融合物(例如，SMIPtm)。
抗体可为单克隆或单特异性抗体。抗体也可为人类、人源化的、嵌合的、CDR接 枝的或活体外产生的抗体。在再其它实施例中，抗体具有选自(例如)lgGl、 lgG2、 lgG3或lgG4的重链恒定区。在另一实施例中，抗体具有选自(例如)k或X的轻链。 在一个实施例中，恒定区经改变(例如经突变)以改良抗体的性质(例如，以使以下 性质中一种或一种以上的增加或减少Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数 目、效应细胞功能或补体功能)。通常，抗体特异性结合至预定抗原，例如与诸如神 经变性、代谢、炎性、自身免疫和/或恶性病症等有关的抗原。
小分子免疫医药(Small Modular ImmunoPharmaceuticals) (SMIPtm)提供包含結合 结构域多肽的变体分子的实例。SMIP和其用途和应用揭示于(例如)美国公开专利 申请案第2003/0118592号、第2003/0133939号、第2004/0058445号、第2005/0136049 号、第2005/0175614号、第2005/0180970号、第2005/0186216号、第2005/0202012 号、第2005/0202023号、第2005/0202028号、第2005/0202534号、和第2005/0238646 号、和其相关专利家族成员，所有这些专利的全文都以引用方式并入本文中。
单结构域抗体可包括互补决定区为单结构域多肽的一部分的抗体。实例包括(但 不限于)重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、源自常规4-链抗体的单结构域抗体、工程 抗体和除那些源自抗体以外的单结构域支架。单结构域抗体可为任何现有或任何未来
的单结构域抗体。单结构域抗体可源自任何物种，其包括(但不限于)小鼠、人类、 骆驼、骆马、山羊、兔子、牛。根据本发明的一个方面，本文所用的单结构域抗体是 天然存在的己知缺少轻链的重链抗体的单结构域抗体。例如，所述单结构域抗体揭示 于WO 9404678中。出于清晰的原因，源自天然缺少轻链的重链抗体的此可变结构域 在本文中称为VHH或纳米体以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。此一 VHH 分子可源自骆驼科物种(例如，骆鸵、骆马、单峰骆驼、羊驼和大羊驼)中出现的抗 体。除骆驼科以外的其它物种可产生天然缺少轻链的重链抗体；所述VHH在本发明 的范围内。
涵盖于术语抗体的"抗原结合片段"中的结合片段的实例包括(i) Fab片段，其 是由VL、 VH、 CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含2个在 铰链区中由二硫桥键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域构成的Fd 片段；(iv)由单臂抗体的VL和VH结构域构成的Fv片段；(v)dAb片段，其由VH结 构域构成；(vi)骆驼科动物或骆驼科动物源化可变结构域，例如VHH结构域；(vii)单 链Fv(scFv); (viii)双特异性抗体；和(ix)—个或一个以上与Fc区融合的免疫球蛋白分 子片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH通过不同基因编码，但所述结构
11域可使用重组方法借助合成连接体来连接，所述合成连接体能够使其作为其中VL和 VH区配对形成单价分子的蛋白质单链(称作单链Fv (scFv));参见(例如)伯德(Bird) 等人，(1988)科学(Science) 242:423-26;休斯顿(Huston)等人(丽)美国国家科 学研究院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 85:5879-83)。所述单链抗体还欲涵盖于 术语抗体的"抗原结合片段"中。可使用所属领域的技术人员己知的常规技术获得这 些抗体片段，且以与完整抗体相同的方式评价片段的功能。
除"双特异性"或"双功能性"抗体外，抗体应理解为其各结合位点均相同。"双 特异性抗体"或"双功能性抗体"是具有2个不同重链/轻链对和2个不同结合位点的 人工杂交抗体。双特异性抗体可通过多种方法(包括杂交瘤融合或连接Fab'片段)产 生。参见，例如，松斯瓦里(Songsivilai)和拉赫曼(Lachmann)，临床实验免疫学(Clin. Exp. Immunol.) 79:315-321 (1990);考斯陶尼(Kostelny)等人，免疫学杂志(J. Immunol.) 148, 1547-1553 (1992)。
短语"生物反应器"是指可容纳细胞培养基且在培养期期间内部条件(例如pH和 温度)可控制的容器。
"补料分批培养"是指首先将细胞接种于具有接种物培养基的生物反应器中的细 胞培养方法。然后细胞培养基在整个生产运行的一个或一个以上的点处补充含营养组 份和/或其它补充物的补料培养基。
"分批培养"是指将细胞接种于具有用于整个生产运行的所有必需营养物和补充 物的生物反应器中的细胞培养方法。在整个生产持续时间内不向细胞培养基添加任何 营养物。
"灌注培养"是指不同于分批或补料分批培养方法的细胞培养方法，其中在分离 和/或纯化所关注的表达蛋白质之前不终止或不需要终止培养，且其中定时或连续将新 的营养物和其它组份添加到培养物中，在此期间定时或连续收获所表达的蛋白质。在 细胞培养的过程期间所添加营养物的组成可有所变化，此取决于细胞的需要、优化蛋 白质产生的要求、和/或所属领域的技术人员熟知的许多其它因素中的任一种。
短语"表达"是指在宿主细胞内出现的转录和转译。表达水平通常与由宿主细胞所 产生蛋白质的量有关。
"细胞比生产力"及诸如此类是指每个细胞中的特定产物表达速率。细胞比生产 力通常以每106个细胞每天所产生蛋白质的微克数或以每106个细胞每天所产生蛋白质 的皮克数来衡量。
本文所用的术语"效价"是指在给定量的培养基体积中细胞培养物所产生的重组表 达蛋白质的总量。效价通常以毫克或微克蛋白质/毫升培养基为单位表示。
所属领域的技术人员将认识到，本文所揭示的方法可用于培养许多种所属领域中 通常使用和培养的己知哺乳动物细胞，即，本文所揭示的方法并不限于仅与本发明一 起使用。
本发明某些实施例的详细阐述己发现，使用抗衰老化合物(例如肌肽)改良细胞培养物的存活力和生产力。例 如，添加肌肽维持细胞存活力，且提高细胞的生产力，且提高期望蛋白质产物的产物 质量。肌肽是抗氧化剂和抗衰老化合物，其还是一种以高水平(高达20mM)存在于 动物的肌肉和神经组织中的天然存在的二肽。作为抗氧化剂，肌肽还是自由基清除剂 和糖化抑制剂。通常，肌肽将反应性物质转化成非反应性物质，由此保护蛋白质、DNA 和其它基本大分子。作为抗衰老化合物，以20mM的浓度存在于培养基中的肌肽可延 长人二倍体成纤维细胞和人胎肺(初代细胞系)的生存期。本发明涵盖以下令人惊奇 的发现在细胞培养中使用抗衰老化合物(包括但不限于肌肽)来产生所关注蛋白质 是有利的。在某些实施例中，在细胞培养中使用所述抗衰老化合物来产生所关注蛋白 质获得一个或一个以上的经改良的细胞培养物特征，所述特征包括(但不限于)效价 提高、细胞比生产力提高、细胞存活力提高、积分活细胞密度增加、高分子量聚集体 的积累减少和/或酸性物质的积累减少。
已经证实，肌肽在具有较低葡萄糖水平的最低必需培养基(MEM,西格玛(Sigma)) 中对人类或啮齿类动物转化的肿瘤细胞具有细胞毒性，但在含有l mM丙酮酸盐的达 尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM，西格玛 (Sigma))中不具细胞毒性。(霍利迪(Holliday)等人，生物化学(Biochemistry)(莫斯科 (Moscow)) ， 65:843-848,846)。此外，已去除低分子量化合物的经透析胎牛血清使肌 肽的细胞毒性效应增加(上述文献)。另外还确定，lmM草酰乙酸盐和lmMa-酮戊 二酸盐具有与丙酮酸盐相当的效应，但二者均非肌肽实例所用接种物或补料培养基的 组份(上述文献)。然而，丙酮酸钠是以0.5 mM浓度存于接种物培养基中的初始组 份，其不用于肌肽添加而是用于在生物反应器系统中更好地模拟活体内条件并作为潜 在的替代能量源。接种物培养基也可以无血清，此将意味着肌肽将具有细胞毒性效应。 根据参考文献，向细胞培养基中添加肌肽将具有与在霍利迪(Homday)中在MEM培养 基中所看到类似的细胞毒性效应。利用本发明的方法和/或组合物，所述细胞毒性减少 或消除且细胞存活力和蛋白质产生得到提高。
在某些实施例中，肌肽以介于约5mM与约lOOmM之间的浓度提供于细胞培养 基中。在某些实施例中，肌肽以约10mM至约40mM浓度(例如，以约20mM的浓 度)提供于浓度细胞培养基中。在某些实施例中，肌肽以以下浓度提供于细胞培养基 中约5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100 mM或更高。在某些实施例中，在细胞培养中通过在细胞培养过程期间在多个时间处 添加肌肽(例如，在一种或一种以上的补料培养基中)达成肌肽的所述浓度。除其它 各种因素(包括细胞系或产物所寻求的期望效应)以外，所用肌肽的浓度取决于所用 细胞培养基和细胞系。肌肽类似物(例如乙酰基肌肽、高肌肽、鹅肌肽和卩-丙氨酸) 也可提供于细胞培养基中用于类似效应。这些类似物中的一个或一个以上可提供于细胞培养基中。在某些实施例中，所述类似物提供于缺少肌肽的细胞培养基中。在某些 实施例中，所述类似物与肌肽组合提供于细胞培养基中。在某些实施例中，所述类似 物以以下浓度提供约5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100 mM、或更高。
在某些实施例中，为产生所关注蛋白质，开始，将宿主细胞用编码蛋白质的外源 DNA转染或转化以供应经转化的细胞，所述细胞组成型产生期望蛋白质产物。在某些 实施例中，引入细胞中的核酸分子编码根据本发明想要表达的蛋白质。在某些实施例 中，核酸分子含有调控序列或编码诱导或增强期望蛋白质被细胞表达的基因产物。作 为非限制性实例，所述基因产物可为增加所关注蛋白质的表达的转录因子。
在某些实施例中，将引导蛋白质表达的核酸稳定地引入宿主细胞中。在某些实施 例中，将引导蛋白质表达的核酸暂时引入宿主细胞中。所属领域的技术人员应能够基 于实验需要、商业需要或其它需要来选择是稳定地还是暂时地将核酸引入细胞中。
编码所关注蛋白质的基因可任选地连接至一个或一个以上的调控型遗传控制元 件。在一些实施例中，遗传控制元件引导蛋白质的组成型表达。在一些实施例中，可 使用提供编码所关注蛋白质的基因的诱导型表达的遗传控制元件。使用诱导型遗传控 制元件(例如，诱导型启动子)允许调节蛋白质在细胞中的产生。可能用于真核细胞 中的有用诱导型遗传控制元件的非限制性实例包括激素调控的元件(参见，例如玛德 (Mader， S.)和瓦艾特(White, J.H.)，美国科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 90:5603-5607,1993)、合成配体调控的元件(参见，例如斯宾塞(Spencer， D.M.)等人， 科学(Science) 262:1019-1024, 1993)和电离辐射调控的元件(参见，例如曼农恩(Manome, Y.)等人，生物化学(Biochemistry) 32:10607-10613, 1993;德塔(Datta， R.)等人，美国科 学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 89:10149-10153， 1992)。根据本文所述的方法和 组合物可使用所属领域熟知的额外细胞特异性或其它调控系统。
根据本发明可使用对细胞培养物且对蛋白质表达敏感的任何宿主细胞。宿主细胞 通常为哺乳动物细胞，更特定来说动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。根据本 发明可使用的哺乳动物细胞的其它非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/1, ECACC编号85110503);人类成视网膜细胞(PER.C6 (克如赛(CruCell),莱顿(Leiden), 荷兰(The Netherlands));经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7， ATCC CRL 1651);人类 胚肾系(经亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞，格雷厄姆(Graham)等人， 普通病毒学杂志(J. Gen Virol.), 36:59 (1977));幼仓鼠肾细胞(BHK, ATCC CCL 10); 中国仓鼠卵巢细胞+Z-DHFR (CHO，阿卢布(Urlaub)和迟森(Chasin)，美国科学院院刊 (Proc.Natl.Acad.Sci. USA), 77:4216 (1980));小鼠塞尔托利(Sertoli)细胞(TM4，玛泽 (Mather),再生生物学(Biol. Reprod.), 23:243-251 (1980));猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76， ATCC CRL-1 587);人类宫颈癌细胞(HeLa， ATCC CCL
142);犬肾细胞(MDCK， ATCC CCL 34);水牛鼠肝细胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442);人 类肺细胞(W138， ATCC CCL 75);人类肝细胞(Hep G2, HB 8065);小鼠乳瘤(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI细胞(玛泽(Mather)等人，纽约科学院学报(Annals N.Y. Acad. Sci.)， 383:44-68 (1982)); MRC5细胞；FS4细胞；和人类肝细胞瘤系(Hep G2)。 多肽根据本发明可产生可表达于宿主细胞中的任何多肽。多肽可自宿主细胞内源性基 因或自引入宿主细胞中的异源基因表达。多肽可为天然存在的一种多肽，或另一选择 可具有经人工工程化或选择的序列。根据本发明欲产生的多肽可由自然界中个别存在 的多肽片段进行组装。另外或另一选择，工程化多肽可包括一个或一个以上的非天然 存在的片段。蛋白质或肽可通过所属领域的技术人员熟知的任何技术来制得，其包括 通过标准分子生物技术表达蛋白质、多肽或肽、从天然源中分离蛋白质或肽、或化学 合成蛋白质或肽。己知基因的编码区可使用本文所揭示的技术或所属领域的技术人员 将熟知的技术进行扩增和/或表达。或者，蛋白质、多肽和肽的各种市售制剂已为所属 领域的技术人员熟知。根据本发明可能想要表达的治疗性蛋白质通常将根据所关注或有用的生物或化 学活性来选择。例如，可使用本发明来表达任何医药上或商业上有关的酶、凝血因子、 受体、抗体、激素、调控因子、抗体、结合剂等。根据本发明可产生的以下治疗性蛋 白质的列表仅为实例性的，且并不意欲作为限制性列举。所属领域的技术人员应了解 根据本发明可表达任何多肽且应能够根据其特定需要选择欲产生的特定多肽。齡歪力融合蛋白通常具有靶向肽的全部或相当大的部分，其在N-或C-末端连接至第二 多肽或蛋白质的全部或一部分。例如，融合可使用来自其它物种的前导序列以允许蛋 白质在异源宿主中重组表达。另一种有用融合包括添加免疫活性结构域(例如抗体表 位)以有利于融合蛋白的纯化。融合蛋白可包括靶向部分(例如，可溶受体片段或配 体)，和免疫球蛋白链、Fc片段、各种同种型的重链恒定区(包括例如lgGl、 lgG2、 lgG3、 lgG4、 IgM、 lgAl、 lgA2、 IgD、和IgE)。例如，融合蛋白可包括受体的胞外 结构域和(例如融合至的)人类免疫球蛋白Fc链(例如，人类lgGl或人类lgG4或其 突变形式)的胞外结构域。在一个实施例中，人类Fc序列在一个或一个以上的氨基酸 处突变，例如在来自野生型序列的残基254和257处突变以减少Fc受体结合。融合蛋 白可另外包括将第一部分接合至第二部分(例如免疫球蛋白片段)的连接体序列。例 如，融合蛋白可包括肽连接体，例如，长度为约4至20、更优选地5至10个氨基酸 的肽连接体；在某些实施例中，肽连接体的长度为8个氨基酸。例如，融合蛋白可包 括具有式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的肽连接体，其中y为l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、或8。 在其它实施例中，可将额外氨基酸序列加到融合蛋白的N-或C-末端以有助于表达、空 间灵活性、检测和/或分离或纯化。在融合接合点处或其附近纳入切割位点将有助于纯化后外来多肽的去除。其它有用融合包括连接功能结构域(例如酶的活性位点、糖基化结构域、细胞耙向信号或跨 膜区)。可纳入融合蛋白的蛋白质或肽的实例包括细胞生长抑制蛋白、杀细胞蛋白、 促凋亡剂、抗血管生成剂、激素、细胞因子、生长因子、肽药物、抗体、Fab片段抗 体、抗原、受体蛋白质、酶、凝集素、MHC蛋白、细胞粘附蛋白和结合蛋白。产生融 合蛋白的方法已为所属领域的技术人员熟知。所述蛋白质可(例如)通过使用双官能 交联剂化学链接、通过整个融合蛋白的重新合成、或通过将编码靶向肽的DNA序列 链接至编码第二肽或蛋白质的DNA序列、随后表达完整的融合蛋白来产生。 拔伴抗体是具有特异性结合特定抗体能力的蛋白质。已知有大量抗体目前正作为医药 或其它商业试剂在使用或在研究，因此根据本发明，抗体的产生尤为令人关注。例如， 可使用本发明以在细胞培养物中产生抗体，其中所产生抗体的错误折叠和/或聚集减 少。在某些实施例中，使用本发明的方法和/或组合物来产生对抗生长分化因子-8 (GDF-8)的抗体。GDF-8抗体的非限制性实例包括Myo29、 Myo28和Myo22。在某些 实施例中，根据本发明所产生的GDF-8抗体是以人类IgG同位素的形式产生。在某些 实施例中，使用本发明的方法和/或组合物来产生MY029抗体，例如在标题为对抗 GDF-8的中和性抗体和其用途(Neutralizing Antibodies Against GDF-8 and Uses Thereof) 的国际专利申请公开案第WO 2004/037861号中所阐述，其整体内容以引用的方式并 入本文中。根据本发明可产生的其它代表性市售治疗性蛋白质包括(例如)阿瓦斯丁 (AVASTIN)[贝伐珠单抗(Bevacizumab)]、坎帕斯(CAMPATH)[阿仑珠单抗 (Alemtuzumab)]、艾比特思(ERBITUX)[西妥昔单抗(Cetuximab)]、赫赛汀(HERCEPTIN) [曲妥珠单抗(TRASTUZUMAB)]、复迈(HUMIRA)[阿达木单抗(Adalimumab)]、卢森提 斯(LUCENTIS)[兰尼珠单抗(Ranibizumab)]、麦罗塔(MYLOTARG)[吉妥珠单抗奥佐米 星(gemtuzumab ozogamicin)]、麦斯恩替(MYCSCINT)[喷替酸英西单抗(Imicromab Penetate)]、跑斯坦森特(PROSTASCINT)[卡罗单抗喷地肽(Capromab Pendetide)]、瑞体 肤(RAPTIVA)[依法珠单抗(Efalizumab)]、类克(REMICADE)[英利昔单抗(Infliximab)]、 瑞博(REOPRO)[阿昔单抗(Abciximab)]、瑞图宣(RITUXAN)[利妥昔单抗(Rituximab)]、 司繆斯提(SIMULECST)[巴利昔单抗(Basilximab)]、索雷斯(SOLIRIS) [(Eculizumab)]、 西那吉斯(SYNAGIS)[帕利珠单抗(Palivizumab)]、塔赛布瑞(TYSABRI)[那他珠单抗 (Natalizumab)]、维斯提比斯(VECTIBIX)[帕尼单抗(Panitumumab)]、沃鲁娜(VERLUMA) [若莫单抗(Nofetumomab)]、西欧来耶(XOLAIR)[奥马珠单抗(Omalizumab)]、泽恩帕斯 (ZANAPAX)[达克珠单抗(Daclizumab)]、泽娃灵(ZEVALIN)[替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)]等。在某些实施例中，上述单克隆、嵌合或人源化抗体含有自然界中在任何物种中在 任何抗体中不天然存在的氨基酸残基。可利用这些外来残基(例如)以赋予单克隆、嵌合或人源化抗体新颖或经改良特异性、亲和性或效应子功能。 凝麟7凝血因子己展示作为医药和/或商业试剂是有效的。血友病B是一种患病者的血 液不能凝结的病症。因此，任何导致出血的小伤口均是潜在危及生命的事件。已知重 组凝血因子在治疗诸如血友病等疾病中的重要性，因此根据本发明，凝血因子的产生 尤为令人关注。在某些实施例中，可使用本发明以在细胞培养物中产生凝血因子，其 中所产生凝血因子的错误折叠和/或聚集减少。例如，凝结因子IX (因子IX或"FIX")是缺乏其导致血友病B的单链糖蛋白。 FIX是作为单链酶原合成，所述单链酶原可通过释放活化肽活化成双链丝氨酸蛋白酶 (因子IXa)。因子IXa的催化结构域位于重链中(参见常(Chang)等人，临床研究杂 志(J. Clin. Invest.), 100:4， 1997，其整体内容以引用的方式并入本文中)。可根据本发 明产生的其它凝血因子包括组织因子和冯韦尔布兰德氏因子(von Willebrands factor)和 /或市售凝血因子。可根据本发明产生的代表性市售凝血因子包括(例如)阿替普酶 (ALTEPLASE)[组织型纤溶酶原激活物；t-PA]、本尼费斯(BENEFIX)阅子IX]、赫莫 菲(HEMOFIL)[抗血友病因子；因子XIII]、瑞康比尼特(RECOMBINATE)(重组抗血 友病因子)等。艨已展示可有效作为医药和/或商业试剂且可根据本发明的教示合意的产生的另一 类多肽包括酶。已知重组酶在治疗疾病和其它商业和医药用途中的重要性，因此根据 本发明，酶的产生尤为令人关注。例如，可使用本发明以在细胞培养物中产生酶，其 中所产生酶的错误折叠和/或聚集减少。可根据本发明产生的代表性市售酶包括(例如) 激活酶(ACTIVASE)[重组阿替普酶]、西利酶(CEREDASE)[阿糖脑苷酶(Alglucerase)]、 席瑞泽酶(CEREZYME)[伊米苷酶(Imiglucerase)]、阿法链道酶(PULMOZYME) [DNase] 等。^长房f/Z^^f号^导分7已展示可有效作为医药和/或商业试剂且可根据本发明的教示合意的产生的另一 类多肽包括生长因子和其它信号转导分子。生长因子通常是糖蛋白，其由细胞分泌且 结合至其它细胞上的受体并活化所述受体，以引发受体细胞中代谢或发育变化。已知 生长因子和其它信号转导分子的生物重要性和其作为潜在治疗剂的重要性，因此根据 本发明，这些分子的产生尤为令人关注。例如，可使用本发明以在细胞培养物中产生 生长因子或其它信号转导分子，其中所产生的生长因子或其它信号转导分子的错误折 叠和/或聚集减少。哺乳动物生长因子和其它信号转导分子的非限制性实例包括细胞因子；表皮生长 因子(EGF);血小板衍生的生长因子(PDGF);成纤维细胞生长因子(FGF)，例如aFGF 和bFGF;转化生长因子(TGF)，例如TGF-a和TGF-p，其包括TGF-P 1、 TGF-卩2、 TGF-卩3、 TGF-卩4、或TGF-p5;胰岛素样生长因子-I和-II (IGF-I和IGF-II); des(l-3)17-IGF-I(大脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，例如CD-3、 CD-4、 CD-8、 和CD-19;红细胞生成素(代表性市售红细胞生成素包括(例如)安然爱斯普 (ARANESEP)[达贝泊汀(darbepoetin)];铟-阿西莫单抗(CEA-SCAN)[阿西莫单抗 (Arcitumomab)]、依普定(EPOGEN)[阿法依伯汀(印oetin alfa)];普西定(PROCRIT)[阿 法依伯汀])等)；骨诱导因子；免疫毒素类；骨形态生成蛋白(BMP);干扰素，例如干 扰素-a、 -p、和-y (代表性市售干扰素包括(例如)埃克特缪恩(ACTIMUNNE)[(干扰 素y-lb)]、艾文奈斯(AVONEX)[(干扰素(3-la)]、利比(REBIF)[(干扰素P-la)]、贝斯恩 (BSERON)[(干扰素卩陽lb)])等);集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、 GM-CSF、和 G-CSF (其它代表性市售集落刺激因子包括(例如)格瑞恩由斯特(GRANUCYTE)、 来格司亭(Lenograstim)、路肯(LEUKINE)[沙格司亭(Sargramostim)])等)；白细胞介素 (TL)，例如，IL-1到IL-10;肿瘤坏死因子(TNF)a和p;胰岛素A-链;胰岛素B-链; 胰岛素原；促滤泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子VIIIC、 因子IX、组织因子、和冯韦尔布兰德氏因子；抗凝血因子，例如蛋白质C;心房利钠 因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物 (t-PA);铃蟾肽；凝血酶，造血生长因子；脑啡肽酶；RANTES (受激活调控正常T-细胞表达和分泌因子)；人类巨噬细胞炎性蛋白质(MIP-l-a);缪勒管抑制物质 (mullerian-inhibiting substance);松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠性腺促素 关连肽；神经营养因子，例如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、 -4、 -5、或-6 (NT-3、 NT-4、 NT-5、或NT-6)、或神经生长因子，例如NGF-p。所属领域 的技术人员应了解可根据本发明的方法和组合物进行表达的其它生长因子或信号转导 分子。
受体
已展示可有效作为医药和/或商业试剂且可根据本发明的教示合意的产生的另一 类多肽包括受体。已知受体的生物重要性和其作为潜在治疗剂的重要性，因此根据本 发明，这些分子的产生尤为令人关注。例如，可使用本发明以在细胞培养物中产生受 体，其中所产生受体的述错误折叠和/或聚集减少。
受体通常是通过识别胞外信号转导配体起作用的跨膜糖蛋白。除配体识别结构域 以外，受体通常具有蛋白激酶结构域。此蛋白激酶结构域通过在胞内靶分子结合配体 后使其磷酸化而引发信号转导途径，从而导致细胞内的发育或代谢改变。在某些实施 例中，根据本文所揭示的方法和系统产生跨膜受体的胞外结构域。在某些实施例中， 根据本文所揭示的方法和系统产生跨膜受体的胞内结构域。
在某些实施例中，根据本发明的系统和方法表达肿瘤坏死因子抑制剂，所述抑制 剂为肿瘤坏死因子a和p受体形式(TNFR-1; 1991年3月20日公开的EP417,563; 和TNFR-2， 1991年3月20日公开的EP 417,014，其各自以其整体内容引用的方式并 入本文中)(关于评论，参见奈斯密特(Naism他)和斯普朗(Sprang),炎症杂志(J Inflamm.) 47(1-2): 1-7, 1995-96，其整体内容以引用的方式并入本文中)。根据一些实
18施例，肿瘤坏死因子抑制剂包含可溶TNF受体。在某些实施例中，肿瘤坏死因子抑制 剂包含融合至免疫球蛋白的任一部分(包括免疫球蛋白的Fc区)的可溶TNFR。在某 些实施例中，本发明的TNF抑制剂为可溶形式TNFRI和TNFRII。在某些实施例中， 本发明的TNF抑制剂是可溶TNF结合蛋白。在某些实施例中，本发明的TNF抑制剂 是TNFR-Fc，例如，依那西普(etanercept)。如本文所用，"依那西普(etanerc印t)"是 指TNFR-Fc，其是p75TNF-a受体的胞外部分的两个分子的二聚体，每一分子由人类 lgGl的235氨基酸Fc部分构成。根据本发明，使用抗衰老化合物(例如肌肽)来减 少TNFR-Fc产生期间错误折叠和/或聚集蛋白质的量。
在一些实施例中，根据本发明欲产生的受体是受体酪氨酸激酶(RTK)。 RTK家族 包括对于众多细胞类型的各种功能至关重要的受体(参见，例如，雅丹(Yarden)和瑞 奇(Ullrich)，生物化学年鉴(Ann. Rev. Biochem.) 57:433-478, 1988;瑞奇(Ullrich)和史列 辛格(Schlessinger)，细胞(Cell) 61:243-254, 1990，其各自以引用的方式并入本文中)。 RTK的非限制性实例包括肿瘤坏死因子a和(3受体、成纤维细胞生长因子(FGF)受体 家族的成员、表皮生长因子受体(EGF)家族的成员、血小板衍生的生长因子(PDGF)受 体、酪氨酸激酶与免疫球蛋白和EGF同源结构域-l(TIE-l)和TIE-2受体(佐藤(Sato) 等人，自然(Nature) 376(6535):70-74， 1995，其整体内容以引用的方式并入本文中)和 c-Met受体，其中的一些己经表明直接或间接地促进血管发生(慕斯托能(Mustonen) 和埃利特(AIitalo),细胞生物学杂志(J. Cell Biol.)129:895-898, 1995) 。 RTK的其它非限 制性实例包括胎肝激酶1 (FLK-1)(有时称为含激酶插入结构域的受体(KDR)(特曼 (Terman)等人，癌基因(Oncogene) 6:1677-83, 1991)或血管内皮细胞生长因子受体2， VEGFR-2) 、 fms样酪氨酸激酶-1 (Flt-1)(德弗里斯(DeVries等人，科学(Science) 255;989-991, 1992;涉谷(Shibuya)等人，癌基因(Oncogene) 5:519-524， 1990)，有时称为 血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR-1)、跨膜蛋白-1、内皮因子、内皮唾液酸蛋白和 Axl。所属领域的技术人员应了解可根据本发明表达的其它受体。
在某些实施例中，欲根据本发明产生的受体是G-蛋白偶联受体(GPCR)。 GPCR 是药物作用和研发的主要靶。实际上，受体己引导出目前已知药物的一半以上(德鲁 斯(Drews)，自然.生物技术(NatureBiotechnology), 14:1516， 19%)且GPCR代表治疗性 干预的最重要靶，其中30X的临床处方药对抗或与GPCR斗争(米尼根(MiUigan， G.) 和瑞斯(Rees,S.), TIPS, 20:118-124， 1999)。由于这些受体作为治疗靶具有已建立的被 证明的历史，因此根据本发明，GPCR的产生也尤为令人关注。
通常，本发明的从业者将选择其所关注的蛋白质或多肽，且应得知其精确氨基酸 序列。根据本发明欲表达的任何已知多肽将具有其自身特定的特征且可影响所培养细 胞的细胞密度或存活力，且可在比相同培养条件所生长的另一种多肽或蛋白质低的水 平下表达。所属领域的技术人员应能够适当改变本发明培养基和本文所述的方法以优 化细胞生长、效价、折叠或已知所表达多肽或蛋白质的任何其它性质。
所属领域的技术人员应了解可本发明的方法和组合物表达的其它有用和/或期望蛋白质。
细胞系可使用各种技术来培养以产生期望蛋白质产物。细胞培养可以小规模或大 规模实施，此取决于细胞培养基的目的或产物的用途。例如，细胞可在生物反应器中
生长。在某些实施例中，生物反应器的体积为至少1升且可为10、 100、 250、 500、 1,000、 2,500、 5，000、 8，000、 10,000、 12,000升或更多、或其间的任何体积。此外， 可使用的生物反应器包括(但不限于)搅拌罐式生物反应器、流动床反应器、中空纤 维生物反应器或滚瓶。这些系统也可以分批、补料分批或连续/灌注模式操作。生物反 应器和控制和监控细胞培养基的模式应为熟悉细胞培养领域的技术人员习知。在本发 明实例中，所用系统是搅拌罐式生物反应器且以补料分批模式操作。
生物反应器通常用接种物培养基和选定细胞系(例如TNFR融合蛋白细胞系)进 行接种，所述细胞系可经转染以稳定表达和产生期望蛋白质产物。可使用市售培养基 (例如最低必需培养基(MEM，西格玛(Sigma))、 Ham's F10 (西格玛(Sigma))、或达尔伯 克改良伊格尔培养基(DMEM，西格玛(Sigma))作为基础培养基。这些基础培养基可随 后补充氨基酸、维生素、微量元素、和/或其它组份以产生生产运行期间所用的接种物 或补料培养基。在某些实施例中，改变基础培养基以在肌肽的存在下使细胞健壮生长， 提高细胞存活力，提高细胞生产力，增加积分活细胞密度和/或提高所产生蛋白质的质 量。例如，基础培养基可补充有丙酮酸盐、草酰乙酸盐和/或a-酮戊二酸盐。所属领 域的技术人员应能够改变供本发明的方法和组合物使用的基础培养基而无需过多试 验。
在某些实施例中，将细胞在含抗衰老化合物的多种化学上确定成分的培养基的任 一种中培养，其中培养基的各组份已知且受控。例如，确定成分的培养基通常不含诸 如血清或水解产物等复合添加剂。在某些实施例中，将细胞在含抗衰老化合物的各种 复合培养基的任一种中培养，其中并非培养基的各组份皆已知和/或受控。在某些实施 例中，此一抗衰老化合物包含肌肽。
生物反应器的条件通常受控制，其中？11设定在约6.5至约7.5之间。pH是使用 酸(通常C02)或碱(例如碳酸氢钠)来调节。在生长期期间，所溶解的氧控制在约 5与90%的空气饱和度之间，且温度保持在3(TC到42'C之间。熟悉细胞培养领域的技 术人员可根据所用细胞系和方法来改变生物反应器的条件以获得期望结果而无需过多 试验。
本发明的组合物和方法可与适合蛋白质表达的任何细胞培养方法或系统一起使 用。例如，表达所关注蛋白质的细胞可在分批或补料分批培养物中生长，其中蛋白质 经充分表达之后终止培养，此后将所表达蛋白质收获并任选地进行纯化。或者，表达 所关注蛋白质的细胞可在灌注培养物中生长，其中不终止培养，且其中定时或连续将 新的营养物和其它组份添加到培养物中，在此期间定时或连续收获所表达的蛋白质。
细胞进行接种后，其经过一个生长期，在此期间细胞的数目通常以指数增加。在 生长期期间，细胞培养物的温度或温度范围将主要根据细胞培养物保持存活、产生高含量的蛋白质、代谢废物的产生或累积最少、和/或这些的任何组合的温度或温度范围
或从业者认为重要的其它因素来选择。作为一个非限制性实例，CHO细胞在约37°C 下生长良好且产生高蛋白质水平。通常，大多数哺乳动物细胞在约25'C到42X:的范围 内生长良好和/或可产生高蛋白质水平，但本发明教示的方法并不限于这些温度。某些 哺乳动物细胞在约35X:到4(TC的范围内生长良好和/或可产生高蛋白质水平。在某些 实施例中，细胞培养物在生长期期间的一个或一个以上时间下在以下温度下生长20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、或45'C。所属领域的技术人员应能够选择使细胞生长的适当温 度或温度范围，此取决于细胞的需要和从业者的生产要求。
生长期之后是过渡期，在此期间细胞适应于周围环境中出现的任何变化，例如温 度变化。所出现的变化通常是针对生产期的参数。在本发明实例中，在第4天，温度
从约37'c降到约3rc。然而，温度改变可出现不止一次且未必必须在向下方向上进行。
而且，过渡期和温度改变可在生产运行期间的任一天出现。尽管大多数产生方法包括 多期过程，但肌肽也可用于单一期过程中。
当培养物的温度改变时，温度改变可相对缓和。例如，可能花费数小时或数天来 完成温度变化。或者，温度改变可相对较突然。温度可在培养过程期间稳定增加或降 低。另一选择为，温度可在培养过程期间的各时间下增加或降低不连续量。后续温度 或温度范围可低于或高于初始或先前的温度或温度范围。所属领域的技术人员应理解， 在这些实施例中涵盖多个不连续温度改变。例如，温度可改变一次(改变至更高或更 低温度或温度范围)，将细胞在此温度或温度范围下维持某一时期，此后温度可再次 改变至新的温度或温度范围，其可为高于或低于先前温度或温度范围的温度或温度范 围。每次不连续改变后培养物的温度可恒定或可维持在某一温度范围内。
最后是生产期，其中细胞数目并无实质增加，而是细胞产生期望蛋白质产物。然 而，所属领域的技术人员应了解，在某些实施例中，细胞在生产期期间可继续生长且 数目有所增加。在此时期期间，将生物反应器的环境控制在细胞可能更具有生产力的 条件下。例如，温度通常保持在不同于生长期温度且有益于蛋白质产物的产生的温度 (例如3rc)下。在整个生产运行期间，可给细胞补加含营养物和细胞可能需要的补 充物的补料培养基。例如，在某些情况下，在后续生产期期间用己被细胞耗尽或代谢 的营养物或其它培养基组份补充细胞培养物可为有益的或必需的。作为非限制性实例， 用激素和/或其它生长因子、特定离子(例如，钠离子、氯离子、钙离子、镁离子、和 /或磷酸根离子)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度 存在的无机化合物)、氨基酸、脂质、或葡萄糖或其它能量源补充细胞培养物可为有 益的或必需的。可将这些补充组份一次全部添加到细胞培养物中或将所述补充组份分 若干次添加到所述细胞培养物中。在某些实施例中，抗衰老化合物在生产期期间的一 个或一个以上的时间下提供于补料培养基中。
根据某些实施例，在生产期期间在细胞培养基中使用抗衰老化合物(例如肌肽)
21无论是提供于接种培养基中还是补料培养基中都提高细胞存活力和/或特异性蛋白质 产生，由此提高所产生蛋白质的总产量。
蛋白质产生过程的各个方面由熟悉细胞培养领域的技术人员决定。尤其诸如接种 密度、培养物的生产持续时间、收获期间的操作条件等参数(包括那些以上所提到者) 随细胞系和细胞培养基而变。因此，这些参数无需过多试验即可由熟悉细胞培养领域 的技术人员确定。
如同生长期期间的温度或温度范围一般，在生产期期间细胞培养物的温度或温度 范围主要根据细胞培养物保持存活、产生高含量的蛋白质、代谢废物的产生或累积最 少、和/或这些的任何组合的温度或温度范围或从业者认为重要的其它因素来选择。通 常，大多数哺乳动物细胞在约25'C到42'C的范围内仍能存活且产生高蛋白质水平，但 本发明教示的方法并不限于这些温度。在某些实施例中，哺乳动物细胞在约25'C到35 'C的范围内仍能存活且产生高蛋白质水平。在某些实施例中，细胞培养物在生产期期 间的一个或一个以上时间下在以下温度下生长20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、或45。C。 所属领域的技术人员应能够选择使细胞在生产期期间生长的适当温度或温度范围，此 取决于细胞的特定需要和从业者的生产要求。细胞可生长任何时间量，此取决于从业 者的需要和细胞自身的要求。
在某些实施例中， 一旦培养物达到一个或一个以上的相关培养条件，终止分批或 补料分批培养，如由从业者的需要所决定。在某些实施例中， 一旦所表达蛋白质达到 足够高的效价、 一旦细胞密度达到足够高的水平、 一旦所表达的蛋白质达到足够高的 细胞密度和/或为防止代谢废物(例如，乳酸盐和/或铵)不期望的产生或累积，终止分 批或补料分批培养。所属领域的技术人员应了解可根据试验、商业和/或其它考虑因素 用于决定何时终止分批或补料分批培养的其它相关培养条件。
在某些实施例中，生产运行之后，从细胞培养基中回收蛋白质产物并进一步使用 传统分离技术进行分离。例如，蛋白质最初可通过离心分离，保留含蛋白质的上清液。 另外或另一选择，蛋白质产物可结合至宿主细胞的表面。在所述实施例中，去除培养 基并使表达蛋白质的宿主细胞溶解作为纯化过程的第一步。哺乳动物宿主细胞的溶解 可通过所属领域的技术人员熟知的任何手段达成，其包括通过玻璃珠物理破坏和暴露 于高pH条件下。
使用常规蛋白质纯化方法，可对蛋白质进行额外分离。分离和纯化期望蛋白质产 物的方法已为细胞培养技术熟知。特定方法取决于所用细胞系和所寻求的蛋白质。
抗衰老化合物(例如肌肽)可在针对特定细胞培养过程优化的时间下添加到培养 基中。对于本发明实例涞水，肌肽的添加出现在生长期实质上结束之后且在过渡期中。 添加期间，细胞培养基适应由温度改变导致的新的温度。过渡期通常在添加试剂以帮 助引发生产期的时候。然而，肌肽可在生产运行期间产生最优结果的任何点下(包括 生长期和生产期)添加。肌肽也可与其它组份(例如补料培养基)组合添加。在某些实施例中，抗衰老化合物提供于接种培养基中且在整个细胞培养过程期间存在于细胞 培养物。在某些实施例中，将两种或两种以上的抗衰老化合物提供于细胞培养基中。 在某些实施例中，将两种或两种以上的抗衰老化合物提供于接种培养基中且在整个细 胞培养过程期间存在于细胞培养物中。在某些实施例中，提供两种或两种以上的抗衰 老化合物，其中一种抗衰老化合物提供于接种培养基中且在整个细胞培养过程期间存 在于细胞培养物中，而另一种抗衰老化合物在细胞培养已开始之后提供。
在某些实施例中，抗衰老化合物在细胞培养物中存在的浓度对于不同细胞类型和 产物有所不同。在某些实施例中，所存在肌肽的浓度对于不同细胞类型和产物有所不 同。通常，所述浓度应足以增强生产力和质量，而无毒性效应。对于本发明实例来说，
范围包括(但不限于)5mM到100mM。应了解，所用肌肽的浓度可随细胞培养基而 变。用于特定细胞系的肌肽的适当浓度可能需要理由常规小规模试验(例如，2L生物 反应器)使用传统方法来确定。所属领域的技术人员应能够使用细胞培养技术和所属 领域习知的诊断方法确定肌肽或其它抗衰老化合物的有利或最佳浓度，而无需过多试 验。
添加肌肽或另一种抗衰老化合物而非化学剂的一个优点是对存活力的效应。通 常，添加诸如丁酸钠等化学剂使细胞生长停止且活细胞数目减少(卡埃穆(Kim等人， 生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)， 71: 184-193,184)。然而，以下实例表明，将 肌肽添加到细胞培养基中使得在收获时的存活力比在没有抗衰老化合物(例如肌肽) 的情况下所生长的细胞培养物中所观测到的存活力高。此外，所述含肌肽的细胞培养 物展示比生产力增加。由于对细胞存活力和比生产力的正面效应，总产量较高。
另一优点在于抗衰老化合物(例如肌肽)使高分子量聚集体的量和/或酸性物质的 量减少。高分子量聚集体和酸性物质的量的减少简化了蛋白质产物的纯化。使蛋白质 能够更有效分离降低了产生蛋白质产物的成本。在某些实施例中，使用抗衰老化合物 (例如肌肽)来减少错误折叠和/或聚集蛋白质的量。在某些实施例中，使用除肌肽以 外的抗衰老化合物来减少高分子量聚集体和/或酸性物质的量。在某些实施例中，使用 两种或两种以上的抗衰老化合物来减少高分子量聚集体和/或酸性物质的量。
在某些实施例中，根据美国专利申请案第11/213,308号、第11/213,317号和第 11/213,633号中所阐述的任何细胞培养方法使细胞生长，所述申请案各自于2005年8 月25日提出申请且其各自以其整体引用的方式并入本文中。例如，在某些实施例中， 细胞可在累积氨基酸浓度大于约70mM的培养基中生长。在某些实施例中，细胞可在 累积谷氨酰胺对累积天冬酰胺的摩尔比小于约2的培养基中生长。在某些实施例中， 细胞可在累积谷氨酰胺对累积总氨基酸的摩尔比小于约0.2的培养基中生长。在某些 实施例中，细胞可在累积无机离子对累积总氨基酸的摩尔比介于约0.4到1之间的培 养基中生长。在某些实施例中，细胞可在合并的积累谷氨酰胺和累积天冬酰胺浓度介 于约16与36mM之间的培养基中生长。在某些实施例中，细胞可在含有两种、三种、 四种或所有五种前述培养基条件的培养基中生长。使用所述培养基允许产生高含量的
23蛋白质且使某些不期望因子(例如铵和/或乳酸盐)的积累减少。
在一些实施例中，细胞是在2006年7月13日提出申请且以整体引用的方式并入 本文中的美国临时专利申请案第60/830,658号中所阐述的一种或一种以上的条件下生 长。例如，在一些实施例中，细胞是在含有浓度介于约10与600nM之间的锰的培养 基中生长。在一些实施例中，细胞是在含有浓度介于约20与100nM之间的锰的培养 基中生长。在一些实施例中，细胞是在含有浓度为约40nM的锰的培养基中生长。在 糖蛋白生长中使用所述培养基使得以改良糖基化模式(例如， 一个或一个以上的寡糖 链中共价连接糖残基的数目较多)产生糖蛋白。
在本发明某些实施例中，根据本发明一种或一种以上的方法所产生的蛋白质将具 有药理活性且将用于医药的制备中。可将根据本发明一种或一种以上的方法所产生的 蛋白质投与给个体或或可首先经调配用于通过任何可用途径递送，所述途径包括(但 不限于)不经肠(例如，静脉内)、真皮内、皮下、经口、经鼻、经支气管、经眼睛、 经皮(局部)、经粘膜、经直肠和引导途径。本发明的医药组合物通常包括自哺乳动 物细胞系表达的纯化蛋白质、递送剂(即，阳离子聚合物、肽分子转运蛋白、表面活 性剂等，如以上所阐述)结合医药上可接受的载剂。本文所用词语"医药上可接受的 载剂"包括溶剂、分散介质、包覆层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等与 医药投与相适合的试剂。附加活性化合物也可纳入组合物中。
可将医药组合物调配为与其打算的投与途径相适合。所述调配物应为所属领域的 技术人员熟知。在某些实施例中，将根据本发明产生的蛋白质调配成经口和/或不经肠 形式。在某些实施例中，为了易于投与和剂量的均匀性，将所述经口和/或不经肠形式 调配成单位剂型，其中每一单位包含经计算以产生想要的治疗效应的预定量的活性蛋 白质连同所需医药载剂。所属领域的技术人员应了解适于根据本发明产生的蛋白质的 单位剂量调配物。
在以上详细讨论了某些实施例和方面。本发明通过以下非限制性实例进一步加以 阐释。然而，所属领域的技术人员应了解，这些实施例的各种修改在随附权利要求书 的范围内。应注意，肌肽和/或其它抗衰老化合物的添加同样适用于其它哺乳动物细胞 培养物和蛋白质产物。权利要求书和其等效物界定本发明范围，本发明的范围并不且 不应限于某些实施例的此描述或由其限制。
实例
实例l:培养皿规模的肌肽试验
将MYO-29细胞系在无血清生产培养基中在具有1L工作体积的生物反应器中培 养且在第4天温度从37。C改变至31°C 。生物反应器的pH保持在7.00且所溶解的氧保 持在30%空气饱和度。然后在第4天、第7天和第10天将细胞培养基从生物反应器 中移出并放在具有8ml工作体积的培养皿中，并置于3rC培养器中，于其中将培养皿 培养物培养直到第12天。在第5天和地7天给细胞补充补料培养基。在第5天，将 10X(v/v)的补料培养基添加到细胞培养物中，且在第7天，将5X(v/v)的补料培养基添加到细胞培养物。分别在第4天、第7天和第10天将10mM的肌肽添加到培养皿 中并在第12天收获细胞培养基。
图la展示在第7天添加肌肽对培养物中酸性峰值的量的影响。图lb展示在第7 天培养中肌肽对高分子量聚集体的影响。图lc图解说明在第4天添加肌肽、与在第7 天添加、与在第IO天添加肌肽对酸性峰值的影响的对比。图ld展示同一试验但是针 对高分子量聚集体的结果。总之，肌肽通过减少酸性峰值和培养皿中的高分子量聚集 体而具有正面效应。
实例2:肌肽添加到细胞培养基中的影响
将5个生物反应器以0.9 xl(^个细胞/ml利用1L工作体积的存于无血清接种培养 基中的MYO-29细胞系进行接种。所有生物反应器均在14天运行的第3、 5、 7和12 天补给5% (v/v)的补料培养基。第10天将补料5% (v/v)的补料培养基添加到2个对 照生物反应器和一个含肌肽的生物反应器中。生物反应器的条件保持温度为37°C， pH 为7.00，且所溶解氧含量为30%空气饱和度。搅动速率为200rpm且喷射气体是空气 和7%二氧化钛的组合。
所有细胞均培养4天，此时将20 mM肌肽添加到生物反应器中，对照中未添加 肌肽，且同样在第4天所有生物反应器中的温度改变至3rC。在生产运行的第14天 自生物反应器收获。在整个运行期间通过取样来监控细胞培养基的进程。对照的表现 正如所预计的那样。
图2a展示每日活细胞密度。图2b展示，与没有肌肽的两个生物反应器相比，当 收获时具有肌肽的生物反应器的每日细胞存活力较高。图2c展示生物反应器的每日效 价且自存在肌肽的两个生物反应器收获时具有较高效价。具有肌肽的培养物具有较好 的积累比细胞生产力，如图2d中所示。图2e展示高分子量聚集体的量且展示在存在 肌肽的生物反应器中高分子量聚集体减少。
实例3:添加不同浓度的肌肽的影响
将4个生物反应器以0.4 xl(^个细胞/ml利用1L工作体积的存于无血清接种培养 基中的MYO-29细胞系进行接种。所有生物反应器均在14天运行的第7天补给5% (v/v)的补料培养基。生物反应器的条件保持温度为37°C， pH为7.00，且所溶解氧含 量为30%空气饱和度。搅动速率为200 rpm且喷射气体是空气和7%二氧化钛的组合。
所有细胞均培养4天，此时所有生物反应器中的温度改变至31'C 。同样在第4天， 将20 mM肌肽添加到一个生物反应器中，第二个添加40 mM的肌肽，且对照未添加 任何肌肽。在生产运行的第12天自所有生物反应器收获。在整个运行期间通过取样来 监控细胞培养基的进程。对照的表现正如所预计的那样，只是一个对照具有比先前所 见略低的每日存活力。
图3a展示每日活细胞密度，除具有4mM肌肽的生物反应器以外，不同的生物反 应器极其相似。图3b展示，与不具有肌肽的两个对照生物反应器相比，当自具有肌肽 的生物反应器每日细胞存活力收获时具有较高存活力。图3c展示每日效价；添加肌肽的生物反应器与一个对照相似。具有40 mM肌肽的生物反应器具有较高累积比细胞生产力。(图3d)。图3e展示高分子量聚集体的量；总之，与对照相比，添加肌肽使得高分子量聚集体减少。
实例4:在哺乳动物细胞培养中使用肌肽以改良重组TNFR融合蛋白的产物特征
将TNFR融合蛋白细胞系在无血清生产培养基中在具有1L工作体积的生物反应器中进行培养。在第1天，温度从37E改变至29.5°C ，添加丁酸钠至最终浓度为1 mM，并添加HMBA至最终浓度为3 mM。将生物反应器的pH保持在6.95且所溶解的氧在60%空气饱和度下。在第2天，将肌肽添加到培养物中至最终浓度为20mM。在第3、6、 8和10天给细胞补充5% (v/v)补料培养基。在第12天收获细胞培养基。运行4个单独的对照生物反应器，其中表达重组TNFR融合蛋白的CHO细胞在与以上所述相同的条件下生长，只是在第2天未添加肌肽。图4-11中的对照数据是4个对照生物反应器运行的平均值。
如在图4和5中可看出，细胞生长和细胞存活力并未因肌肽添加而明显受影响。图6展示，当细胞在含肌肽的培养基中生长时，错误折叠和/或聚集TNFR融合蛋白的量(如通过疏水作用色谱法(HIC)所测量)明显减少。图7展示，当表达TNFR融合蛋白的细胞在含肌肽的培养基中生长时，高分子量(HMW)聚集体的量(如通过尺寸排除色谱法(SEC)所测量)也明显减少。图8和9分别展示，当表达TNFR融合蛋白的细胞在含肌肽的培养基中生长时，产物效价和比细胞生产力增加。最后，图IO和ll展示，当细胞在含肌肽的培养基中生长时，所产生TNFR融合蛋白的糖基化无明显不同。
尽管本文己揭示本发明的一些实施例，但以上描述仅是说明性的。那些熟悉细胞培养领域的技术人员将想到本文所揭示实施例的其它修改且认为所有所述修改在由随附权利要求书所界定的实施例的范围内。
权利要求
1、一种在细胞培养物中产生TNFR融合蛋白的方法，其包含以下步骤在包含抗衰老化合物的细胞培养基中培养含有编码所述TNFR融合蛋白的基因的哺乳动物细胞，所述基因在细胞培养条件下表达；和将所述培养物维持在容许所述蛋白表达的条件下并持续一段足以容许所述蛋白质表达的时间；其中所述细胞培养物展示经改良的细胞培养物特征，所述经改良的细胞培养物特征不同于在缺少所述抗衰老化合物且其它方面相同的培养基中于其它方面相同的条件下观测到的相应细胞培养物特征；其中所述经改良培养物特征选自由以下组成的群组效价提高、细胞比生产力提高、细胞存活力提高、积分活细胞密度增加、高分子量聚集体的积累减少、酸性物质的积累减少、和其组合。
2、 如权利要求l所述的方法，其中所述抗衰老化合物选自由肌肽、乙酰基肌肽、 高肌肽、鹅肌肽和卩-丙氨酸和其组合组成的群组。
3、 如权利要求1所述的方法，其中所述抗衰老化合物包含肌肽。
4、 如权利要求l、 2或3所述的方法，其中所述抗衰老化合物以介于约5mM与 约lOOmM之间的浓度存在于所述细胞培养基中。
5、 如权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞培养物进一步 提供有补充组份。
6、 如权利要求5所述的方法，其中所述补充组份提供于补料培养基中。
7、 如权利要求5或6所述的方法，其中所述补充组份选自由以下组成的群组 激素和/或其它生长因子、特定离子(例如，钠离子、氯离子、钙离子、镁离子、和磷 酸根离子)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度存在 的无机化合物)、氨基酸、脂质、葡萄糖或其它能量源、和其组合。
8、 如权利要求5、 6或7所述的方法，其中所述补充组份包括抗衰老化合物。
9、 一种产生TNFR融合蛋白的方法，其包含以下步骤在细胞培养基中在生长期期间于有助于细胞生长的第一温度或温度范围下培养 含有编码所述TNFR融合蛋白的基因的哺乳动物细胞，所述基因在细胞培养条件下表 达；将所述细胞培养基的所述温度或温度范围改变至有助于蛋白质产生的第二温度 或温度范围；在所述细胞培养基中于所述第二温度或温度范围下培养所述宿主细胞经过过渡 期并进入生产期中；其中向所述细胞培养物中添加抗衰老化合物以使所述细胞培养物展示经改良的 细胞培养物特征，所述经改良的细胞培养物特征不同于在缺少所述抗衰老化合物且其 它方面相同的培养基中于其它方面相同的条件下观测到的相应细胞培养物特征；其中所述经改良的细胞培养物特征选自由以下组成的群组效价提高、细胞比生 产力提高、细胞存活力提高、积分活细胞密度增加、高分子量聚集体的积累减少、酸 性物质的积累减少、和其组合。
10、 如权利要求9所述的方法，其中所述抗衰老化合物是在所述细胞培养过程开 始时添加到所述细胞培养基中。
11、 如权利要求9或10所述的方法，其中所述抗衰老化合物是在所述生长期期间添加到所述细胞培养基中。
12、 如权利要求9、 10或11所述的方法，其中所述抗衰老化合物是在所述过渡 期期间添加到所述细胞培养基中。
13、 如权利要求9到12所述的方法，其中所述抗衰老化合物是在所述生产期期 间添加到所述细胞培养基中。
14、 如权利要求9到13所述的方法，其中所述抗衰老化合物选自由肌肽、乙酰 基肌肽、高肌肽、鹅肌肽和P-丙氨酸和其组合组成的群组。
15、 如权利要求9所述的方法，其中所述抗衰老化合物包含肌肽。
16、 如权利要求9到15中任一权利要求所述的方法，其中所述抗衰老化合物以 介于约5 mM与约100 mM之间的浓度存在于所述细胞培养基中。
17、 如权利要求16所述的方法，其中所述细胞培养物进一步提供有补充组份。
18、 如权利要求17所述的方法，其中所述补充组份提供于补料培养基中。
19、 如权利要求17或18所述的方法，其中所述补充组份选自由以下组成的群组激素和/或其它生长因子、特定离子(例如，钠离子、氯离子、钙离子、镁离子、和磷 酸根离子)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度存在 的无机化合物)、氨基酸、脂质、葡萄糖或其它能量源、和其组合。
20、 如权利要求17、 18或19所述的方法，其中所述补充组份包括抗衰老化合物。
21、 如前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所产生的TNFR融合蛋白 是所述哺乳动物细胞的异源蛋白质。
22、 如前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO 细胞。
23、 如前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述TNFR融合蛋白包含 TNFR-Fc。
24、 如权利要求23所述的方法，其中所述TNFR-Fc是依那西普(etanercept)。
25、 一种根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法产生的TNFR融合蛋白。
26、 如权利要求25所述的蛋白质，其中所述TNFR融合蛋白包含TNFR-Fc。
27、 如前述权利要求中任一权利要求所述的制备蛋白质的方法，其进一步包含从 所述细胞培养基分离出所述蛋白质的步骤。
28、 如权利要求27所述的方法，其中所述蛋白质进一步经纯化或处理用于调配。
29、 如权利要求28所述的方法，其中将所述蛋白质调配成医药组合物。
30、 如前述权利要求中任一权利要求所述的制备蛋白质的方法，其中所述高分子 量聚集体包含错误折叠蛋白质。
全文摘要
本发明提供在包含诸如抗氧化剂肌肽等抗衰老化合物的细胞培养物中产生蛋白质的方法。依据本发明教示，在包含抗衰老化合物的细胞培养基中生长的细胞展示存活力和生产力提高。此外，在抗衰老化合物的存在下生长的细胞培养物展示高分子量聚集体在所述细胞培养基中的含量减少。
文档编号C12N5/00GK101668845SQ200880013317
公开日2010年3月10日 申请日期2008年4月22日 优先权日2007年4月23日
发明者乔斯·曼纽尔·戈梅斯, 格雷戈里·沃尔特·希勒, 王文格, 銮燕童 申请人:惠氏公司