专利名称：结合纤连蛋白ed－b结构域的抗体及其构建和应用的制作方法
背景技术：
本发明涉及纤连蛋白(FN)的胎儿期同工型ED-B的特异结合成员，通过免疫组织化学方法和对癌的体内靶向定位显示，ED-B在肿瘤形成的新生血管中也有表达。本发明还涉及与这些特异结合成员相关的材料和方法。
大部分现有癌症治疗方法的主要目的是尽可能多地杀死癌的组成型细胞。化疗和放疗的局限性在于治疗缺乏特异性和对正常组织的毒副作用。提高肿瘤治疗特异性的一个方法是通过结合蛋白将药物携带到肿瘤，这种结合蛋白一般包含一个对在肿瘤细胞表面表达、正常细胞不表达的标记抗原有特异性的抗体的结合区。这种形式的靶向治疗，粗略定义为“魔弹”，其实例主要是来源于鼠类的对细胞表面表达的所谓“肿瘤相关”抗原有特异性的单克隆抗体。这些单抗或者以化学键与具细胞毒性的物质(例如，毒素或药物)连接，或者作为编码单抗和毒素的基因相连并串联表达的重组融合蛋白产生。
“魔弹”技术虽然意义重大，在治疗人类癌症中有一定效果，尤其是对发生于淋巴的肿瘤的定向治疗效果显著，因为这种肿瘤的癌细胞易在循环系统中受到治疗药物的作用，但对“魔弹”的研究受到限制。然而治疗肿瘤块仍具有严重的临床困难，因为仅有小部分的细胞，主要是肿瘤的最外层细胞才暴露在循环系统中的治疗性免疫连接剂作用下。这些周边的靶细胞形成了对肿瘤内部所谓的“结合位点屏障”(Juweid等，1992,癌症研究，52 5144-5153)。肿瘤的组织结构因含有纤维基质和堆积甚紧的肿瘤细胞而很紧密，抗体大小的分子很难进入。而且，肿瘤因缺乏淋巴外排而有更高的细胞间压力，也阻碍了外来分子的流入。治疗药物进入肿瘤影响因素的最近综述，参看Jain,R(1994)，美国科学，27158-65。
通过对“肿瘤相关”抗原的靶向定位来治疗肿瘤块有明显的局限性，但这些肿瘤确有一些共同特征，为抗体疗法提供了其他的抗原靶位。肿瘤增长超过一定大小后，它们就靠独立的供血系统来提供足够的氧和养料维持生长。如果能干扰或排除这些供血系统，就能饿死大量肿瘤细胞。肿瘤形成过程，血管生成表型发生转变，产生变化了的血管生成因子，作用于邻近的毛细血管的内皮细胞，诱发它们增殖和转移。与正常组织毛细血管的高度有序性形成鲜明对比，这些新形成的血管组织结构混乱，有盲端和导致渗漏增强的孔洞。血管生成的诱发过程伴有某些细胞表面抗原的过量表达，多数这样的表面抗原与正常组织血管相同。因此，鉴定出肿瘤新生血管的特殊抗原是通过对血管定向攻击进行固形肿瘤治疗的主要限制因素。本发明所涉及的抗原即针对这一问题。
在肿瘤增生过程，其周围组织的胞外基质通过两个过程重新构建(1)正常组织胞外基质成分的蛋白质降解和(2)肿瘤诱发的细胞因子促进肿瘤细胞和基质细胞重新合成胞外基质成分。这两个过程在稳定情况下，产生一种“肿瘤胞外基质”，它提供更适合肿瘤增生的环境，并在质和量上有别于正常细胞。这种基质的成分中有肌腱蛋白和FN的大同工型。称这些蛋白为同工型因为它们存在转录、转录后和转译后水平的结构差异。本发明的主题是这种纤连蛋白的同工型即所谓的B+同工型(B-FN)。
作为胞外基质和体液组成成分的纤连蛋白(FN)是多功能、高分子量的糖蛋白。它们参与多种生物过程，如正常细胞形态的形成和维持、细胞迁移、凝血和溶血、伤口愈合及肿瘤转化(综述见Alitalo等，1982；Yamada,1983；Hynes 1985；Ruoslahti等，1988；Hynes,1990；Owen等，1986)。FN的结构多样性是FN的初始转录产物的三个区域(ED-A、ED-B和Ⅲcs)经选择性剪接形成的(Hynes,1985；Zardi等，1987)，选择剪接产生了至少20种不同的同工型，其中一些在癌变和正常组织中表达不同。FN-pre-mRNA剪接方式有组织和发育特异性，在转化细胞及癌细胞中这种调节方式被破坏(Castellani等，1986；Borsi等，1987；Vartio等，1987；Zardi等，1989；Carnemolla等，1989；Oyama等，1989,1990；Borsi等，19926)。事实上，包含ED-A、ED-B及Ⅲcs序列的FN的同工型在转化及癌变细胞中比正常细胞表达增加，尤其是含ED-B序列的FN同工型(B+同工型)在胎儿及癌变组织和伤口愈合过程高度表达，而在正常成人组织中表达受到抑制(Norton等，1987；Schwarzbauer等，1987；Gurman和Kornblihtt 1987；Carnemolla等，1989；Ffench-Constant等，1989；Ffench-Constant和Hynes,1989；Laitinen等，1991)。B+FN分子在成熟血管中检测不到，但在正常的(如子宫内膜发育)、病理的(如糖尿病性视网膜病变)和癌变过程中的新生血管表达提高(Castellani等，1994)。
ED-B序列是一个由单个外显子编码的包含91个氨基酸的完整的Ⅲ型重复。与由不同剪接方式形成的带有细胞类型特异性结合位点的ⅢCS同工型不同的是，A+和B+同工型生物功能尚在研究中(Humphries等，1986)。
B+同工型本身即是一个肿瘤诱导的新抗原。另外，ED-B的表达暴露了在Ⅲ型重复7(位于ED-B之前)中原本隐蔽的一个抗原；由于这个位点在缺乏ED-B的FN中没有暴露，因此可认为ED-B的表达直接或间接地诱导了该抗原的表达。隐蔽抗原位点形成了单抗BC-1的靶位(Carnemolla等，1992)。BC-1的特异性及生物学功能在EPO 344 134131中有描述并且可以从保存在欧洲动物细胞保藏中心(PortonDown,Salisbury UK)的杂交瘤细胞(保藏号88042210)中得到。该单抗已成功地用于定位肿瘤的增生血管，而和成熟血管的内皮细胞没有交叉反应，显示FN同工型作为血管定位的抗体的潜力。
但是，对BC-1的特异性应有清醒认识。BC-1不直接识别B+同工型，令人怀疑是否在某些组织中，BC-1识别的位点在没有ED-B存在下也会暴露，因而间接引起我们不希望的BC-1的交叉反应。此外，BC-1对人的B+FN有严格的特异性，意味着在动物中利用BC-1的分布进行肿瘤定位是不可能的。虽然已经生产出含有B+同工型的融合蛋白的多克隆抗体，但它们只与N-聚糖酶处理的，暴露出结合位点的FN反应。
应用小鼠单抗更大问题是人的抗小鼠抗体(HAMA)反应(Schroff等，1985；Dejager等，1988)。HAMA反应有一定负作用，从中和药用抗体导致治疗剂量降低，到过敏反应，血清疾病和视网膜损伤。
虽然已确证多抗血清与重组ED-B的反应性，但在免疫小鼠中分离与BC-1有相同特异性的单抗是很困难的，因为人和鼠的ED-B显示100％的序列同源性。因此鼠对这种貌似自身抗原的人的蛋白不会产生免疫反应。事实上，本领域经十多年研究，只鉴定出一种单抗能间接地与B+FN反应，而不直接识别ED-B(即BC-1)。BC-1的特异性是针对一个因ED-B而暴露的原本隐蔽的位点，而不是ED-B本身，这一点意义重大，因为小鼠FN中不存在ED-B，其免疫系统不会将ED-B作为“自己人”。
实现本发明使用了不同于以前的技术，不必先用纤连蛋白或ED-B进行免疫。从丝状噬菌体表面展示的人类抗体的可变区文库中得到作为ED-B同工型的特异抗体的单链FVS(scFvs)(Nissim等，1989；也可参看WO92/01047,WO92/20791,WO93/11236,WO93/19172)。
我们发现，把带有ED-B结构域的重组FN片段和重组ED-B本身作为抗原包被于固体表面，都能从抗体噬菌体文库中分离到特异的scFvs(淘选)。同样来源的抗原通过亲合力成熟也已成功地产生比上代克隆性能更好的第二代scFvs。分离到的scFvs可与不经聚糖酶处理的人类FN的B+同工型强烈并特异性反应。
本发明提供的人抗体抗原结合区应用于抗肿瘤具有不引起HAMA反应的优点。并且如文中示例，它们也可用于对肿瘤组织进行免疫组织化学分析。上述及其它用途文中将进一步讨论，且对本领域的普通技术人员也是显而易见的。
术语特异结合成员描述特异结合的一对分子中的一个成员。特异结合对成员可以是天然产品、全部或部分合成物。分子对中的一个成员在表面有一区域或洞穴，与该分子对的另一成员的特定空间和极性结构特异结合且因而互补。因此该分子对的成员具有互相间特异结合的特性。这类特异结合对的例子有抗原-抗体，生物素-抗生物素蛋白，激素-激素受体，受体-配基，酶-底物。
抗体描述天然的、部分或全部合成的免疫球蛋白。这个术语也包括任何带有抗体结合区或与抗体结合区相似的区域的多肽或蛋白，它们可以是天然的、部分或全部合成的。抗体的例子是不同类型的免疫球蛋白及其亚型；包含抗原结合区的片段如Fab、ScFv、Fr、dAb、Fd；diabodies。
用单抗和其他抗体通过重组DNA技术可产生保持原抗体特异性的其它抗体或嵌合体分子。这种技术涉及将编码免疫球蛋白的可变区或决定互补性的区域(CDR)的DNA连入不同的免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见示例，EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400。杂交瘤或其它细胞经过基因突变或其它改变可能会/不会改变所产生抗体的特异性。
因为抗体能被许多方法修饰，“抗体”这一术语应认为涵盖任何特异性结合分子或其结合区具有特异性的物质。因此，这个术语包括抗体片段，衍生物、功能等同物或抗体的同源物，其中包括天然的、全部或部分合成的任何带有免疫球蛋白结合区的多肽。免疫球蛋白的结合区或其等同物与其它多肽融合形成的嵌合体分子也包括在内。嵌合抗体的克隆及表达见EP-A-0120694和EP-A-0125023。
完整抗体的片段也能行使结合抗原的功能，结合片段的例子是(ⅰ)包含VL、VH、CL和CH1结构域的Fab片段；(ⅱ)包含VH和CH1结构域的Fd片段；(ⅲ)包含一个抗体的VL和VH的Fv片段(ⅳ)包含一个VH区的dAB片段(Ward等，1989)；(ⅴ)分离的CDR区域；(ⅵ)F(ab＇)2片段，包含两个相连的Fab片段的双价片段；(ⅶ)单链Fv分子(scFv)，其中VH和VL区通过多肽接头连接形成抗原结合位点(Bird等，1988；Huston等，1988)；(ⅷ)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ⅸ)“diabodies”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger等，1993)。
“diabodies”是多肽的多聚体，每个多肽包括带有免疫球蛋白轻链结合区的第一个结构域和带有免疫球蛋白重链结合区的第二个结构域，这两个结构域的相连(通过多肽接头)不能构成多肽内的抗原结合区，抗原结合区的形成是通过多聚体中一个多肽的第一个结构域与另一个多肽的第二个结构域接近而形成的(W094/13804)。
使用双特异性抗体时，可以是用不同方法(Holliger和Winter,1993)如化学制备或从杂交瘤制备的常规双特异性抗体，或是上述双特异性抗体片段的一种。可能我们宁可使用ScFv的二聚体或diabodies而不是整个抗体。只用可变区构建的不合Fc片段的diabodies和scFv，大大降低了抗独特型反应的效力。其它形式的双特异性抗体包括由Traunecker等(1991)描述的单链“Janusins”。
双特异性的diabodies与双特异性完整抗体相反，因容易构建并可在大肠杆菌中表达，或许特别有用。结合特异性适宜的diabodies(和其它多肽如抗体片段)能很容易地从噬菌体展示库中选出(WO94/13804)。若diabodies一条臂保持恒定，如具对抗原X的特异性，则可以构建一个另一条臂是可变的抗体的文库，由此筛选合适特异性的抗体。
抗原结合区描述抗体的一部分，包括与抗原的部分或全部特异结合、并互补的区域。当抗原很大时，抗体可能只结合抗原的特定部位，这个部位被定义为“表位”。一个抗原结合区可能由一个或多个抗体的可变区构成。优选的是，抗原结合区包括抗体的轻链可变区(VL)和抗体的重链可变区(VH)。
特异性表示特异结合对中的一个成员不会与不是其特异结合配偶体的分子有任何明显结合的状态。该术语也适合于，如，一个抗原结合区特异结合一个存在于许多抗原的特定表位，这种情况下，携带该抗原结合区的特异结合成员将能结合有此表位的各种抗原。
功能等同的变异体形式表示虽在结构上有别于另一分子(亲本)，但仍保持着一些明显的同源性并至少有亲本分子的某些生物功能的一种分子(变异体)，如结合特定抗原或表位的能力。变异体可以是片段、衍生物或突变体的形式。一个变异体、衍生物或突变体可以通过在亲本分子中增加、删除、替代和插入一或多个氨基酸，或者与另一个分子相连而获得。可以在核酸或蛋白水平上进行这种改变，例如编码的多肽可以是一个Fab片段连接上一个不同来源的Fc尾巴，或者连接上一个标记物如酶、荧光素等。
发明概述本发明提供了对纤连蛋白(FN)的ED-B癌胚结构域有专一性的一种特异结合成员。
本发明的特异结合成员能直接结合ED-B结构域。在一个实施方案中特异结合成员能结合一个、任何或全部经嗜热菌蛋白酶处理后的含ED-B的FN。在另一实施方案中特异结合成员结合一个、任何或全部带有ED-B结构域的Ⅲ型同源重复的FN。Carnemolla等，1989；1992在两篇论文中鉴定了已知的FNs。“所有含ED-B的FNs”的参考文献应理解为这些论文中研究过的含ED-B的所有FNs的参考文献。
这一特异结合成员优先结合人类ED-B，并且优先结合至少一个其他种如小鼠、大鼠和/或鸡的B+FN。我们希望这一特异结合成员能结合人FN ED-B和一种非人的FN ED-B如小鼠FN ED-B，就能在模式动物中检验和分析这一sbp成分。
本发明的特异结合对成员能结合ED-B，但不与讨论过的保存在ECACC、公众可得到的单抗BC-1竞争。BC-1对人类B+FN有严格特异性，该特异结合成员不与BC-1结合同样的表位。
它与B+FN的结合可被ED-B结构域抑制。
在本发明的一个方面，测量提纯的单体时，结合区对ED-B FN的解离常数Kd为6×10-8M或更小。
在本发明的一个方面，结合区能与未经N-聚糖酶预处理的FN ED-B反应而结合。
本发明的特异结合成员可以分离物或纯化的形式给出，即在制备液或配方中无其它特异结合成员，如抗体或抗体片段；或者没有能结合FNED-B的其它特异结合成员。优选本发明的特异结合成员以足够纯度提供。在来自一个克隆的意义上它们可以是“单克隆”，而不仅有传统杂交瘤技术获得的抗体才是。该特异结合成员可以用噬菌体展示技术和/或在重组的，如细菌宿主细胞中表达而获得。结合FN ED-B的单克隆的特异结合成员以前未有公开。
优选特异结合成员含有一个抗体，该成员含有的多肽序列可以是抗体片段，如单链Fv(scFv)的形式，另一些可选用的抗体片段可以是Fab、Fab＇、F(ab＇)、Fabc,Fabc或双抗(Winter和Milstein,1991；WO94/13804)。该特异结合成员也可以是完整抗体的形式,完整抗体可以是抗体的不同类型如IgG、IgA、IgD、IgE和IgM及其亚类如IgG1或IgG4。
抗体可以来源于，如人、鼠、猪、兔，及其它本领域技术人员知道的来源。优选人源抗体。“人源”表示抗体部分或全部来源于人类cDNA、蛋白或多肽库。该名词包括非人源的、经修饰而获得某些人类抗体分子特点以躲过人类免疫系统攻击的人源化多肽及蛋白。
该特异结合成员也可以是基因工程改造的抗体形式，如一个双特异性抗体分子(或F(ab＇)2的一个片段)其一个抗原结合臂(即特异性结构域)抗FN ED-B，另一臂抗另一特异抗原；或双价或多价分子。
除了抗体序列，特异结合成员可以包含其它一些氨基酸，如形成肽或多肽，或赋予分子除结合抗原之外的另一些功能，如包含一个标记、一种酶或一个片段等。
结合区可以包含由一个种系片段或重排基因片段编码的部分或全部VH结构域。该结合区可以包括部分或全部VL k结构域或一个VLλ结构域。
结合区可以包含一个VH1、VH3和VH4种系基因序列或其重排序列。
本发明的特异结合成员可以包含来源于人类种系DP47(序列如图1a所示，残基1-98)的一个重链可变区(VH结构域)。DP的命名如Tomlinson等人(1992)所述。CDR3的氨基酸序列可以是Ser Leu Pro Lys，也可以是Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu。本发明的特异结合成员的结合区可包含一个VH结构域，它包含图1(a)所示的CGS-1和CGS-2的氨基酸序列。
结合区可以包含从人种系DPL16得来的一个轻链可变区(VL)，序列如图1(b)所示，密码子1-90。
VL结构域可以包含一个CDR3序列Asn Ser Ser Pro Val Val LeuAsn Gly Val Val，也可包含一个CDR3序列Asn Ser Ser Pro Phe Glu HisAsn Leu Val Val。
本发明的特异结合成员包括功能等同的变异体，其序列由图1所示的序列插入、删除、替代或添加一或多个氨基酸，而性能不变。如CDR3序列可以被改变，对框架区进行一个或多个改变，或者原来的框架用另一个框架或其修饰形式取代，只要该特异结合成员仍结合ED-B。
将第一个抗体的一或多个CDR序列放到并非此抗体，如另一个抗体的框架中即所谓CDR移植，如EP-B-0239400所公开。本文公开的来源于一个抗体的抗原结合区的VL或VH结构域的一或多个CDR可用于这一技术。CGS1和CGS2的CDR序列如图1(a)和1(b)所示。
本发明的特异结合成员可以是与抗体或所述scFV竞争结合FN ED-B的分子。结合成员之间的竞争可以方便地在体外检测，例如通过给一个结合成员标记上一个报告分子，可以从其它未标记的结合成分中检测出这一结合成员，以此能确定结合同样或重叠位点的特异结合成员。
本发明的特异结合成员在一个包括导致或允许该成员与它的表位结合的方法中的用途。将特异结合成员饲喂哺乳动物，如人或啮齿动物，鼠，发生结合。
本发明还提供了上述特异结合成员作为肿瘤诊断试剂的应用。下面描述的动物模型实验表明该特异结合成员可用于活体内肿瘤定位。
优选的特异结合成员包括那些能与人类肿瘤发生结合，如在冷冻切片中显示扩散的、血管增生的表型和那些在冷冻切片中结合胚胎组织的成员。结合可用免疫细胞化学染色显示。
在一个优选实施方案中，特异结合成员不结合或不显著结合肌腱蛋白，一种胞外基质蛋白。
在另一个优选实施方案中，特异结合成员不结合或不显著结合人的正常皮肤，如在冷冻切片中和/或用免疫细胞化学染色显示的结果。
在进一步的实施方案中，本发明的特异结合成员不结合或不显著结合一或多个正常组织(如在冷冻切片中和/或用免疫细胞化学染色显示的)，组织选自肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、卵巢、尿道、膀胱、胰脏、肾上腺、骨胳肌、心脏、肺、胸腺和脑。
ED-B的特异结合成员可以在体内作为一个靶向试剂，用来特异显示表达ED-B或与之有关的肿瘤的存在和定位。也可以作为一个成像试剂。本发明提供了确定表达FN ED-B或与之相关的一个细胞或肿瘤的方法。该方法包括所述特异结合成员与细胞接触，然后检测两者的结合。此方法可在体内或在从人体分离的细胞样品中进行。
一个细胞样品中抗体的反应活性可用适当的方法检测。用单个报告分子标记是一种可行选择。报告分子可直接或间接产生可测信号，能计量的信号更好。报告分子的连接可以是直接或间接的，共价如通过肽键，或非共价连接。通过肽键的连接可以是编码抗体和报告分子的融合基因表达的重组产物。
优选方法是将每个抗体与单个的、吸收或发射光谱分离的荧光、磷或激光染料共价连接。可选用的荧光染料包括荧光素、若丹明、藻红蛋白和Texas红。发光染料可选二胺联苯胺。
其它的报告分子包括大分子胶质颗粒或颗粒物质，如有色的，磁性、顺磁性、有生物学或化学活性的乳胶粒，能直接或间接产生目测、电子检测或其它方法记录的信号。这些分子可以是催化着色或变色反应，或引起电学特性改变的反应的酶。它们在分子水平被激发，在能级间电子跃迁产生特征性的光谱吸收或发射。还包括与生物传感器配合的化学物质。可以用生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉菌抗生素蛋白和碱性磷酸酯酶检测系统。
检测结合的方法不是本发明所及内容，本领域技术人员可根据他们的喜好及一般知识选择合适的方法。
由单个的抗体-报告分子融合体产生的信号可以得出在细胞样品中该抗体的绝对或相对结合量。另外，可用常用的核染色剂如碘化丙烷给样品中的细胞群计数，从而给出单个细胞群相对于全部细胞的数量比率。用放射性核苷如125I、111In或99mTc连接抗体，若抗体优先在肿瘤而不是正常组织上定位，在肿瘤上出现的放射性标记可用Y摄像机检测和定量，所得肿瘤图像的质量与信噪比有关。
抗体可以作为诊断试剂跟踪血管增生的肿瘤，也可以其修饰形式携带细胞毒素或诱发血管凝结，导致新生肿瘤中氧及养料供应不足，形成间接肿瘤疗法。
本发明还涉及上述特异结合成员作为治疗试剂的应用。例如该成分通过偶联、结合或基因工程产生融合蛋白后，会具备疗效。本发明的一个特异结合成员可用来将毒素、放射性物质、T细胞、杀伤细胞或其它分子定位于表达目标抗原或相关的肿瘤。
本发明进一步给出相应的治疗方法，包括所述特异结合成员、含有该特异结合成员的药物组合物以及这种特异结合成员在生产药品中的应用，如生产药物或药用组合物的方法，包括将该特异结合成员配合适于药用的赋形剂。
本发明提供的组合物可因人而异，给药优先考虑“治疗有效量”，这对病人足够产生有益效果，表现在至少有一个症状得到最起码的改善。实际服药剂量和服药周期取决于症状的性质和严重程度。治疗处方，如决定用药量由普通医师和其它内科医生负责。抗体的适宜剂量在本领域内是公知的，见Ledermann等1991；Bagshawe K.D.等1991。
一种组合物可以根据治疗的需要，单独服用或与其它治疗措施同时或相继进行。
本发明的药用组合物和应用，包括除活性成分以外，本领域技术人员所熟知的适用药用的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂和其它原料。这些原料不应有毒性且不干扰活性成分的效力。载体或其它原料的确切性质取决于给药途径，可以口服或注射，如静脉点滴。
口服药用组合物可以是片剂、胶囊、粉末和液体形式。药片可包含明胶或一种佐剂作为固体载体。液态药用组合物通常包含如水、油、动物或植物油、矿油或合成油等液体载体，也可包含生理盐溶液、右旋糖或其它糖溶液或乙二醇、丙三醇、聚乙二醇等醇类。
用于静脉点滴、注射或病灶处注射，活性成分应采用不合热源、pH适宜、等渗、稳定、不被肠道吸收的溶液形式。本领域技术人员易于找到等渗溶媒如NaCl注射液，Ringer＇s注射液、乳酸化的Riger＇s注射液来制备溶液。根据需要，可使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂或/和其它添加剂。
本发明的特异结合成员可以通过表达核酸序列制备。任何特异结合成员的核酸编码本身及该成分的包括在适宜条件下培养重组宿主细胞以表达此核酸的制备方法都是本发明的内容。
核酸序列编码所述抗体抗原结合区或任何功能等同体的氨基酸序列。在核酸水平上通过增加、删除、替代或插入一或多个核苷酸引入突变，但由于基因编码的简并性，这些变化可能会/不会在氨基酸水平上体现。
已知有多种不同的宿主细胞可作为多肽的克隆或表达系统。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本技术可选用的表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、Hela细胞、小仓鼠肾细胞和其它，一个常用、优选的细菌宿主是大肠杆菌。
在原核细胞如大肠杆菌中表达抗体和抗体片段方法成熟。综述见pliickthun(1991)。也可应用真核细胞培养物来表达特异结合成员，近期综述见Reff,(1993)；Trill等(1995)。
选择或构建带有合适的调节序列的载体，序列包括启动子序列、终止序列、多聚腺苷酸序列、增强子序列、标记基因和其它。载体可以是质粒、病毒如噬菌体或噬菌粒。参看如分子克隆实验室手册，第二版，Sambrook等，1989，冷泉港实验室出版社。核酸操作的技术及要领如核酸制备、基因突变、测序、DNA导入细胞和基因表达、蛋白质分析，《分子生物学简要方案》(第二版Ausubel等，John wiley和Sons,1992)中有详述。参看参考文献相关的内容。
在本发明的另一方面，提供了带有上述核酸序列的宿主细胞，及包括核酸导入宿主细胞技术的方法。导入可采用任何可行技术。对真核细胞，合适的技术包括磷酸钙转化、DEAE-右旋糖苷层析、电穿孔、脂质体介导的转染和用逆转录病毒或其它病毒如痘类病毒或对昆虫细胞用杆状病毒进行转导。对于细菌细胞，可采用的技术包括CaCl2转化、电穿孔和噬菌体转染。
导入核酸后即引发或允许核酸的表达，如通过在适合基因表达的条件下培养宿主细胞。
在一个实施方案中，将上述核酸整合到宿主细胞的基因组(如染色体)上，整合可以按标准操作，由内含的能促进与基因组重组的序列推动。
特异结合成员制备后可用于文中公开的任何一种方式的样品，如作为药品或诊断制品的配方，或制成包含特异结合成员和能鉴定该成分与细胞结合的其它一种或多种试剂的诊断试剂盒。
本领域技术人员易于理解本发明进一步的内容。为便于理解，以下实施例以例举而非限定的方式给出。
如下图1显示并列的scFvs CGS-1和CGS-2的VH和VL的氨基酸序列，1(a)VH序列；1(b)VL序列。CDR3(1,2和3)如图所示，与两个scFvs同源性最高的人种系VH是VH3家族的DP47片段；两个克隆的VL片段均为DPL16，它曾用于构建原始的scFvs文库(Nissim等，1994)加下划线的是两克隆不同残基。
图22A显示一个人FN亚基的结构域构型。图中表明ⅢCS、ED-A和ED-B的变化是由于FN pre-mRNA选择性剪接形成的。可看到其同源性及主要的含ED-B的嗜热菌蛋白酶降解产物(Zardi等，1987)。图ZB是血浆和WI38VA FN及其嗜热菌蛋白酶降解产物走4-18％SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色结果和以BC-1,IST-6,CGS-1和CGS-2作探针的免疫印迹结果。未降解(1道)和用1ug/mg FN(道)、10ug/mgFN(4道)嗜热菌蛋白酶降解的血浆FN。未降解(2道)和用1ug/mg(5道)、5ug/mg FN嗜热菌蛋白酶降解的WI38VA FN。右端数字代表图ZA所示的主要嗜热菌蛋白酶降解产物。左端数值表示千道尔顿计的分子量标准。
图33A表示在大肠杆菌中表达的融合和重组蛋白中的FNⅢ型重复序列及蛋白与CGS-1、CGS-2、单抗BC-1、IST-6的反应性。3B表示考马斯亮蓝染色的胶和用CGS-1、CGS-2、BC-1、IST-6作探针的免疫印迹。道与蛋白组成图编号方式对应。左侧数值是分子量标准(KD)。
图4红外鼠成像仪；用于定位实验的鼠成像仪，由一个黑的，不透光，配有本森卤灯、专用于红外荧光染料CY7的激发光和发射光滤光片的匣子和一个微机控制的8比特单色CCD-摄像机组成。
图5荧光标记结合B-FN的单体scFv(CGS-1)和二聚体scFv(CGS-1)2，定位F9鼠畸形瘤。特异结合溶菌酶的二聚体scFv(D1.3)2作为阴性对照。
图6荧光标记亲合成熟的scFv(CGS-2)和有同样B-FN结合位点但亲合力低的scFv(28SI)，定位F9鼠畸形瘤。检测大肿瘤(约0.6克)和小肿瘤(约0.2克)中的定位，前者在48小时用黑板覆盖使图象有所模糊。
本文提到的所有文献作为参考文献引用。
实施例实施例1——分离对人FN的ED-B结构域有特异性的人类scFvs。
实施例2——特异结合人FN ED-B区域的人scFvs的亲合力成熟。
实施例3——亲合力成熟的scFvs对含ED-B的纤连蛋白的特异性。
实施例4——亲合力成熟的抗ED-B的scFvs在人和鼠肿瘤切片免疫细胞化学染色中的应用。
实施例5——亲合力成熟的抗ED-B的scFvs在人肿瘤体内定位中的应用。
实施例6——裸鼠异种移植的鼠F9畸形瘤的定位。□实施例1——分离对人FN的ED-B结构域有特异性的人类scFvs.
用一个人类scFvs的噬菌体文库(Nissim等，1994)筛选重组抗体，所用抗原为ED-B的两个同工型形式，均为重组人类蛋白。
在大肠杆菌中表达带有Ⅲ型重复片段2-11(B-)和2-11(B+)的重组FN多肽。
构建所用FN DNA来源于pFH154(Kornblihtt等，1985)，入F10和λF2(Carnemolla等，1989)。用Qiagen(Chatsworth,CA)的QIAexpress试剂盒将上述包含2229-4787号碱基序列的cDNA片段插入载体pQE-3/5。重组的FN-Ⅲ2-11(B-)和(B+)用与Sepharose 4B偶联的单抗3E3(Pierschbacher等，1981)通过免疫亲合层检纯化。制备带有Ⅲ型同源重复序列的FN片段7B89,789,ED-B和FN-6所用的DNA片段由PCR反应扩增生成，反应由UltMa DNA聚合酶(Perkin Elmer)催化，所用模板来自FN2-11(B-)和FN2-11(B+)的cDNA片段。设计的引物保证用QIAexpress试剂盒能将PCR产物插入pQE-12，转化大肠杆菌表达。用测序酶2.0DNA测序试剂盒对所有cDNA克隆进行测序。
重组蛋白利用FN片段C端的六组氨酸，通过Ni-NTA层析(IMAC)纯化，参见厂商使用说明。将ED-B cDNA插入噬菌体载体入gt11得到λED-B克隆，用以制备融合蛋白ED-B-β Gal，由鸡FN pchFN60(Norton等，1987)衍生的克隆可产生一个融合蛋白λch FN60(含部分ED序列)。
两个不同的重组抗原(7B89和ED-B)分别作三轮淘选来挑取人类ScFv噬菌体库。溶于PBS(20mM磷酸缓冲液，0.15M NaCl,pH7.2)的50μg/ml的抗原在免疫板中包被过夜。首先使用的抗原是重组FN片段7B89，其ED-B结构两侧连接的是邻位的Ⅲ型同源重复序列；该抗原4℃包被过夜。第二个抗原是C端有六组氨酸标记的重组ED-B(Zardi等，1987)；这个蛋白不含有赖氨酸，因此可利用其第一个氨基酸的末端氨基将ED-B位点特异地与ELISA板共价连接而固定化(Nunc；Covalink)。室温包被过夜。
三轮淘选后，稀释噬菌体并转染大肠杆菌HB1251，铺板(Nissim等，1994)。每一轮淘选后，95个氨苄抗性的单菌落用ELISA方法确定抗原特异的scFvs。选择在包被抗原上给出最强ELISA反应信号的克隆进一步分析并进行亲合力成熟。这些克隆用免疫细胞化学方法可将多形性成胶质细胞瘤和乳腺瘤的切片特异染色，详述见实施例4。
实施例2——特异结合人类FN的ED-B区域的人类scFv亲合力成熟选择克隆35GE(用7B89筛选得到)和28SI(用ED-B结构域筛选到的)做为亲合力成熟的待选抗体。多样化的轻链能指示亲合力的提高，采用一个简单的亲合力成熟技术，即用降解寡核苷酸和PCR扩增使轻链CDR3中的六残基(DSSGNH)随机化，因而提供206=6.4×107个可能的序列。这个区域(与重链CDR3)位于抗原结合区中心(Padlan,1994)。我们同时将紧接于六个氨基酸残基之前的精氨酸突变为丝氨酸，以免静电效应影响筛选。
从表达亲本scFv片段的单菌落中提取质粒用引物LMB3(5＇CAGGAA ACA GCT ATG AC3＇)和CDR-3-6-FOR(5＇CTT GGT CCCTCC GCC GAA TAC CAC MNN MNN MNN MNN MNN MNN AGAGGA GTT ACA GTA ATA GTC AGC CTC3＇)(94℃[1＇]-55℃[1＇]-72℃[1＇30″]，25个循环，缓冲液及反应条件见Mark等，1991)进行PCR扩增。产物经凝胶纯化(除去少量含原始scFv基因片段的质粒)作为模板进行第二次扩增，引物为LMB3和J1-NOT-FOR(5＇ATT GCTTTT CCT TTT TGC GGC CGC GCC TAG GAC GGT CAG CTT GGTCCC TCC GCC 3＇)(94℃[1＇]-55℃[1＇]-72℃[1＇30″],25个循环)。用Spin-Bind(FMC,Rockland,ME,USA)从PCR反应混合物中纯化得到在琼脂糖凝胶上能走出正确分子量的单一条带的PCR粗产物。产物经Nco1/Not1双酶切并连入凝胶纯化的Nco1/Not1双酶切的噬菌粒pHEN1(Hoogenboom等，1991)，该噬菌粒带有一个不表达的Nco1/Not1插入片段，以此可区别双酶切与单酶切的载体。载体用Qiagen(Chatsworth,CA,USA)质粒maxprep试剂盒制备。连接体系中有约5μg酶切的质粒和插入片段，用酚抽提一次，再用酚/氯仿/异成醇(25∶25∶1)抽提一次，然后用糖原(Boehringer,Mannheim,Grmany)作为载体进行乙醇沉淀，加速真空干燥。沉淀重新悬浮于20μl水中并电击转化入大肠杆菌TG1(Gibson,1984)。如果使用甘油保存物，得到滴度为109转化子/μg，如果用新鲜制备的电击感受态细胞，滴度为1010转化子/μg，用上述方法一般可得到＞107克隆。
用Nissim的处理方法(Nissim等，1994)处理成熟文库以产生噬菌体颗粒。这些颗粒用于在7B89(10μg/ml)为抗原的免疫板上做第一轮筛选，随后进行一轮动力学筛选(Hawkin等，1992)。这个筛选步骤是在2％牛奶-PBS(2％MPBS)中，将生物素标记的7B89(10nM)同第一轮筛选得到的噬菌体悬液(大约1012滴度单位)温育5分钟，然后加入未生物素标记的7B89(1μM)，竞争反应30分钟。将100μl链霉菌抗生物素蛋白包被的磁珠(Dynal:M480)在2％MPBS中预封闭后加入反应体系，混合2分钟，用磁场捕获。用(PBS+0.1％Tween-20)和PBS交替洗涤10次，用0.5ml100mM的三乙烯亚胺三嗪洗脱噬菌体。用pH7.4,0.25ml 1M Tris中和该溶液，感染对数生长期的HB2151细胞(Nissim等，1994)。用95个氨苄抗性的单菌落制得含scFvs的上清液，上清液用ELISA，免疫组织化学和BIAcore来确定结合最强的，然后将它们亚克隆到表达载体PDN268(Neri等，1996)的sfi 1/Not1位点。表达载体上带有可磷酸化的标记，FLAG位点和scFvC端的六组氨酸标记。
带有抗体亚克隆的PDN268形成的单菌落在含100mg/L氨苄和0.1％葡萄糖的2XTY中，37℃生长。当培养物达到OD600=0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM,30℃继续生长16-20小时。离心(GS-3 Sorvall转头，7000rpm,30分钟)，上清液过滤，浓缩，用Minisette(Filton)切线流设备将浓缩物改溶于上样缓冲液(50mM磷酸，pH7.4,500mM Nacl,20mM咪唑)，溶液吸附于1ml NiNTA(Qiagen)树脂，用50ml上样缓冲液洗一次，然后用洗脱缓冲液(50mM磷酸，pH7.4,500mM NaCl,100mM咪唑)洗脱。纯化后的抗体走SDS-PAGE分析(Laemmli,1970)并在4℃对PBS透析。产物再用配备S-75柱(pharmacia)的FPLC仪器进行凝胶层析。可能由于“贪婪”效应(Nissim等，1994；Crothers和Metzger,1972)，多价的scFv片段会在BIAcore上有假阳性结合(Johnson等，1991)。假定1mg/ml scFv溶液在280nm吸收值为1.4单位，测定经FPLC纯化的单体抗体的光吸收即可知其浓度。
用BIAcore测定下列抗原与溶于PBS的0.1-1μM浓度范围内的单价scFv的结合。(ⅰ)1000共振单位(RU)的生物素标记的重组FN片段7B89，固定于链霉菌抗生物素蛋白包被的片上，可特异吸附250RU的scFv，(ⅱ)200RU的重组ED-B，借助N端氨基固定，可特异结合600RU的scFv(ⅲ)3500RU的富ED-B的FN WI38VA(见实施例3)，特异结合150RU的scFv，实验结果动力学分析见厂商说明。在对含有抗体的上清液进行BIAcore定性分析的基础上，挑选每个scFv克隆的亲合力成熟的克隆用7B89片段筛选出克隆CGS-1，用ED-B重组FN片段筛选出克隆CGS-2，它们的结合速率常数(Kon)和解离速率常数(Koff)及计算得到的这两种scFv和初始克隆28SI的平衡解离常数见表1。CGS-1和CGS-2的平衡解离常数(Kd)均在nM水平上，但在被测的三种蛋白中，克隆CGS-2相对初始克隆有最大的提高，其Kd由110nM变为1nM(表1)。测定单体抗体产物可知提高主要是由于它有更低的动力学解离常数(～10-4S-1)(未发表)。
上述成熟技术具有普遍意义，利用它已得到下列物质的亲合力提高的抗体麦芽糖结合蛋白，细胞色素C，鼠endoglin胞外区(D.N.,L.Wyder,R.Klemenz)，巨细胞病毒(A.P.,G.Neri,R.Botti,P.N.)，细胞核肿瘤标志HMGI-C蛋白(A.P.,P.Soldani,V.Giancotti,P.N.)和卵巢肿瘤标志胎盘碱性磷酸酯酶(M.Deonarain和A.A.Epenetos)。本技术与其它成熟技术(Marks等，1992；low等，1996)至少是同效的，且得到了与选自庞大的噬菌体抗体库(Griffiths等，1994；Vaughan等，1996)亲合力近似的抗体。
测定亲和力成熟的克隆CGS-1和CGS-2的序列，并用MocVector软件与人类种系抗体V基因的数据库(V-BASE)进行比较分析。两个克隆的VH基因与人类种系DP47(VH3)同源性极高，且各有一个不同的VHCD3序列(图1)。两者的VL基因就是Nissim等在构建人类合成scFv库时所用的DPL16种系，它们的VL CDR3序列的六个随机残基中的四个互有不同(图1b)。
表1单体scFv片段CGS-1和CGS-2对含有ED-B结构域的蛋白的动力学和解离常数
表1说明实验按材料与方法部分所述进行。
*Koff和Kon精确到±30％，取决于浓度测定的准确性，并与用于适应方法的反应图的不同区域获得的结果有关。
实施例3——亲合力成熟的scFv对含ED-B的纤连蛋白的特异性两个亲合力成熟的scFv:CGS-1和CGS-2，其免疫反应性首先用ELISA检测，并与单抗BC-1(识别B-FN同工型)和只识别缺失ED-B的FN同工型的单抗IST-6进行比较(Carnemolla等，1989；1992)。这些单抗的特性已有报道(Carnemolla等，1989；1992)。精确的特异性分析选用大范围的一组嗜热菌蛋白酶处理的FN片段和重组融合蛋白进行。
ELISA及免疫印迹中所用抗原制备如下所述从人血浆和WI38VA13细胞系的条件培养基中提纯FN(Zardi等，1987)。纯化的FNs用嗜热菌蛋白酶(蛋白酶X；Sigma Chemical Co.)降解(Carnemolla等，1989)。从一个FN降解物中提纯FN110KD(B-)和FN120KD(B+)片段(图2)(Borsi等，1991)肌健蛋白-C的大异构分子用Saginati等所述方法提纯(1992)。按照实施例1表达并纯化重组蛋白。用Carnemolla等(1989)所述方法进行SDS-PAGE和Western杂交。
PBS稀释用于ELISA的抗原至50～100μg/ml，在免疫板凹槽内4℃包被过夜(Nunc,Roskilde,Denmark)。未结合的抗原用PBS洗去，免疫板用含3％牛血清蛋白(BSA)的PBS封闭，37℃，2小时。用含0.05％Tween20的PBS(PBST)溶液洗涤四次，加入抗体37℃结合1.5小时；scFv在对标记序列抗性的抗血清中预温育单抗Mz(Kodak,New Haven CT)抗FLAG标记或9E10(ATCC,Rockville,MD)抗myc标记。单抗BC-1和IST-6作为对照抗体。PBST清洗四次后，加入1∶2000稀释度(在PBST+3％BSA中稀释)的生物素标记的羊抗小鼠IgG(Bio-SPADivision,Milan,Italy)，免疫板37℃温育1小时。反复清洗，加入链霉菌抗生物素蛋白-生物素化的碱性磷酸酯酶复合物(Bio-SPA Division,Milan,Italy)(1∶800稀释于含2mM MgCl2的PBST中)37℃，1小时。加入溶于pH9.8,10％二氨基乙醇中的磷酸酯酶片剂(Sigma)促进反应，405nm测光吸收，结果见表2。
表2
ELISA方法测定scFv和单抗与纤连蛋白衍生的抗原的免疫反应性。数据代表排除背景信号后405nm测得的OD。数据是四次实验的均值，标准误差最高为10％。
实验中所用不同结构的纤连蛋白如下所述血浆FN=人血浆纤连蛋白；WI38-VA FN=分离自SV40转化的成纤维细胞上清液的FN(Zardi等，1987)；n110KD=FN结构域4的嗜热菌蛋白酶处理片段，不合ED-B；n120KD=FN结构域4的嗜热蛋白酶处理片段，带有ED-B；recFN7B89=两则连接相邻Ⅲ型FN同源重复的ED-B结构域；recFN789=不带有ED-B结构域的Ⅲ型FN同源重复；rec ED-B=ED-B结构域；rec FN6=重组FN结构域6。
CGS-1和CGS-2均识别重组ED-B肽段，内源的或重组的带有ED-B序列的FN片段，而不结合不带ED-B的FN片段。CGS-1和CGS-2甚至不与肌腱蛋白(含15个Ⅲ型同源重复，Siri等，1991)反应，也不结合经嗜热菌蛋白酶消化后不含可测水平ED-B序列的血浆FN(Zardi等，1987)。相反，CGS-1和CGS-2与从SV40化细胞系WI38VA中提纯的FN强烈反应。从所述细胞系中纯化的FN分子70-90％带有ED-B，这一数值是将纯化的FN和总RNA进行嗜热菌蛋白酶降解及核酸酶S1实验得到的。scFv对FN中ED-B的特异性还表现在用可溶性的重组ED-B能抑制CGS-1和/或CGS2与WI38VA细胞上的FN的结合。
试验结果证明CGS1-1和CGS-2与WI38VA只特异性地与含ED-B结构域的FN生物反应。除了单抗BC-1不识别重组ED-B，衍生物与单抗BC-1具有相同的反应性，这两个scFv及单抗对照的ELISA反应信号强度的对比表明它们对带有ED-B的抗原的高度特异性。
对来自血浆和WI38VA细胞的FN及其嗜热菌蛋白梅降解产物做免疫印迹，进一步检测CGS-1和CGS-2的特异性。来自WI38VA细胞的FN(大部分带有ED-B)酶解产生一个120KD片段(带有ED-B)和一个110KD缺失ED-B的小片段(图2A,Zardi等，1987)。120KD片段再酶解产生两个片段羧基端带有近乎完整的ED-B序列的85KD片段和一个35KD片段(图2A,Zardi等，1987)。
图2B左端是免疫印迹蛋白条带考马斯亮蓝染色结果。血FN(1道)和该蛋白的嗜热菌蛋白酶解产物(3道，含110KD蛋白；4道，110KD蛋白的降解产物)不被CGS-1和CGS-2识别。相反，来源于WI38VA细胞的富含ED-B的FN，其完整(2道)和酶解程度递增形式(5、6、7道)均被两种scFv识别。CGS-1特异识别的最小的FN衍生物是120KD蛋白(内含Ⅲ型重复2-11)而CGS-2识别的85KD片段包括Ⅲ型重复2-7区域以及ED-B的N末端(图ZB,Zardi等，1987)。这些结果表明这两个scFv能与ED-B序列内不同的位点反应。CGS-2结合85KD片段表明这个克隆的结合位点位于ED-B的N端。120KD段酶解为85KD的片段不与CGS-1结合，表明CGS-1识别位点更趋向于ED-B分子的C端。
CGS-1和CGS-2的精确特异性用含或不含ED-B序列的重组FN片段和融合蛋白，做免疫印迹进一步研究。FN融合蛋白的制备如Carnemolla等(1989)所述。实验结果见图3。图示与人类FN结构域的结构的关系见Carnemolla等(1992)。得到的结合斑点形状印证了用ELISA和免疫印迹方法在纯化的FN及其酶解产物中已得到的实验结果CGS-1和CGS-2同带有ED-B的FN片段强烈反应(2道和4道)，但不与缺失ED-B的FN序列反应(1道和3道)。CGS-1与人(5道)或鸡(6道)的ED-B融合蛋白均不反应，而CGS-2与这两个片段反应(图3)。这个结果可能表明带有ED-B的FN的CGS-1识别位点在结构上易变。例如，位点对变性条件敏感或者经过SDS-PAGE分离并转移至固相表面如硝酸纤维素膜上，这个位点就不能正确地显现。
综上所述，实验结果说明CGS-1和CGS-2强烈并特异性地结合带有ED-B的FN，但结合位点互有区别，并且不同于单抗BC-1的ED-B识别位点。
实施例4——亲合力成熟的抗ED-B的scFv在人和小鼠肿瘤免疫细胞化学染色中的应用CGS-1和CGS-2均用于对人类某些正常和肿瘤组织中带有ED-B的FN进行免疫定位。选择皮肤为正常组织的示例，因为皮肤伤口愈合时，巨噬细胞和成纤维细胞中表达B-FN同工型(Carnemolla等，1989；Brown等，1993)。所选用的两个人类肿瘤，以前曾用于分析抗FN的单抗的染色特异性多形性成胶质细胞瘤已有详细研究，因为这种肿瘤血管的内皮细胞在血管增生过程中处于高度增殖状态，并伴随B-FN同工型的表达(Castellani等，1994)。分别用正常的，增生的和成瘤的人类乳腺组织所进行的研究提供了血管生成与B-FN表达相关性的更多证据。
本文所述实验中，将CGS-1和CGS-2的免疫组织化学染色结果与单抗BC-1(识别B-FN的同工型)的染色结果进行了比较，并与其它已知或同所有FN同工型反应(IST-4)，或同缺失ED-B的FN反应(IST-6)的单抗比较。上述对照抗体的特性已有报道(Carnemolla等，1989；1992)。
精确和灵敏地检测取自外科手术的正常和肿瘤组织中的FN分子，关键在制备和固定过程(Castellani等，1994)。免疫组织化学研究中，5μm厚度的冷冻切片风干，在冷的丙酮中固定10分钟，用链霉菌抗生物素蛋白——生物素化碱性磷酸酯酶复合物染色试剂盒(Bio-SPA,Division,Milan,Italy)和萘酚-AS-MX-磷酸盐及Fast Red TR(Sigma)进行染色。Gill＇s苏木紫为复染剂，按Castellani等方法(1994)在glycergel中装片。为进一步分析实验所得的组织阳性染色的特异性，将抗体与重组ED-B结构域预先温育，再做前述检测。
所有实验结果表明，与CGS-1、CGS-2反应的组织结构与单抗BC-1的相同。用CGS-1、CGS-2和BC-1对皮肤进行染色，所得模式表明在表皮中表达的FN缺乏ED-B。在对侵入性导管癌切片的染色中，CGS-1、CGS-2和BC-1呈现局限性分布的着色，局限在肿瘤细胞和基质间的边界上。这与虽然全部FN均匀分布在肿瘤基质中，但B-FN的表达仅限于一定范围的事实相吻合。用单抗BC-1已成功地将侵入性导管癌中这些区域定位(95％)(Kaczmarek等，1994)。
以前在成胶质细胞瘤多态性肿瘤的BC-1染色中的发现已被证实。Castellani等人(1994)曾观察到状如小球的血管结构这一典型染色模式。我们的实验中，CGS-1和CGS-2给出同样性质的结果。
然而，CGS-1和CGS-2与单抗BC-1有一重大区别这两个人类scFv均可与鸡和小鼠的B-FN结合，而BC-1对人B-FN有严格特异性。CGS-2可同鸡胚瘤反应(未发表)，CGS-1和CGS-2均可同小鼠肿瘤反应。
鼠的F9畸形瘤切片显示血管结构CGS-1染色的结果。相反，所有检测的小鼠正常组织(肝、脾、胃、肾、小肠、大肠、卵巢、尿道、膀胱、胰脏、肾上腺、骨胳肌、心脏、肺、甲状腺和脑)与CGS-1、CGS-2均表现负的染色(未发表)。用重组ED-B结构域可将染色完全抑制，表明在F9畸形瘤切片中被染色的结构是ED-B特异性。
实施例5——亲合力成熟的抗ED-B的scFv对人类肿瘤体内定位的应用将人类黑素瘤细胞系SKMEL-28皮下一侧注射(1×107细胞/小鼠)6～10周龄的裸鼠(Balb-c或MF-1；Harlan UK)，形成异种移植的肿瘤。肿瘤直经接近1cm时，从鼠尾部静脉注射100μl 1mg/ml scFv1,-Cy71的PBS溶液。
在1ml抗体的PBS溶液中(1mg/ml)加入100μl 1M碳酸氢钠、pH9.3和200μl CY7-bis-oSu(Amersham；Cat.Nr.PA17000；2mg/ml溶于DMSO)实现重组抗体的CY7标记。室温30分钟后，加入100μl 1M Tris,pH7.4，用经PBS平衡的PD10柱子(pharmacia Biotech,Piscataway,NJ,USA)将标记好的抗体与未反应的染料分离。洗脱出的绿色抗体流分用Centricon-10管(Amicon,Beverly,MA,USA)浓缩到1mg/ml左右，得到的标记比例大致为1分子CY7:1分子抗体。假定1mg/ml的抗体溶液在280nm光吸收1.4单位，CY7的摩尔消光系数在747nm是200＇000(M-1cm-1)，并忽略CY7在280nm光吸收，用1cm比色杯进行光谱测定可估算到上述比例。标记后抗体样品的免疫反应性由条带迁移(Neri等，1996b)、抗原柱亲合层析或BIAcore分析进行验证。在规律性的时间间隔内，使小鼠被动吸入氧/fluorothane被麻醉，用自制的小鼠成像仪给小鼠成像。对每个样品实验2-8只鼠以保证结果的可重复性。这个过程依照授予D.Neri的英国专利项目“肿瘤的靶向定位”(UKPPL 80/1056)进行。
所用小鼠红外成像仪改进了Folli等的光学检测系统(1994)，就可以使用红外荧光染料CY7，红外成像具有更好的组织穿透力。CY7所发荧光(＞760nm)对人是不可见的，因此需要使用微机控制的CCD摄像机。成像仪包括一个涂黑的，不透光匣子，内装100W本森卤灯及相配的专为CY7设计的50mm直径的激发滤光片(Chroma Corporation,Brattleboro,VT,USA；673-748nm)。成像仪产生的光束在5×10cm面积内近乎均一，鼠即置该处成像。荧光可用8-比特单色Pulnix CCD-摄像机检测。该摄像机配有C-固定镜头和一个50mm的发射光滤片(Chroma Corporation,Brattleboro,VT,USA；765-855nm)，加接Image DOK系统(KineticImaging Ltd.,Liverpool,UK)。该系统的微机备有捕获及整合连续图像的定格装置和分析软件。平均化过程中一般要用50ms内连续拍摄的三副图像；对每只试验鼠的一系列图像维持这一数值标准，以便在不同时刻对肿瘤的靶向定位进行直接比较。使用图像转化程序将TIFF模式的图像转为PICT文件，并用Power Macintosh 7100/66计算机所带MacDraw程序加以完善。
该仪器设计示意图见图4。
实验表明在肉眼可见的层次上，两种scFv均定位于肿瘤。这两种抗ED-B的scFv对增生肿瘤的新生血管靶向定位的显微结构如下详述。
体侧长有异种移植的SKMEL-28人类黑素瘤或鼠F9畸形瘤的裸鼠和/或SCID鼠，分别注射有FLAG标记的未生物素化的scFv片段，或生物素标记的scFv片段。
注射后在不同时间处死小鼠，制得肿瘤和非肿瘤切片，然后用抗FLAG的M2抗体(Kodak,181)或链霉菌抗生物素蛋白检测试剂按照常规免疫组织化学方法染色，最佳的靶向定位在注射后12小时。GS-1和CGS-2都与异种移植的人肿瘤和鼠畸形瘤新生血管结合。
实施例6——裸鼠异种移植鼠F9畸形瘤的靶向定位皮下注射4×106个鼠F9畸形瘤细胞后，裸鼠一侧形成肿瘤块。肿瘤在鼠中迅速生长，注射约1周其直径达1cm，血管高度增生。为了给抗体靶向定位成像，采用改进的Folli等(1994)的光学检测方法，可以对同一成像动物在不同时间进行肿瘤靶向定位和抗体消除的动力学检测(图4)。
为了增进抗体对肿瘤的靶向定位并便于检测，通过将抗体亚克隆到表达载体pGIN50的sfi1/Not1位点，使scFv(CGS-1)、scFv(CGS-2)和抗溶菌酶的scFv(D1.3)(McCafferty等，1990)带上一个同源二聚体标记(Pack等，1993)。所用载体是pDN268的衍生物(Neri等，1996)，带的标记的His6序列由下列序列取代GGC LTD FLQ AET DQL EDE KSA LQTEIA HLL KEK EKL EFI LAA H，序列中有一个半胱氨酸残基和一段Fos蛋白，后者是对抗体片段中的共价同源二聚体有两亲性的螺旋(Abate等，1990)。抗体未能达到完全二聚体化，大约30～50％的片段含共价连接的二聚体。
亲合层析纯化抗体片段，层析柱是将鸡卵清溶菌酶(D1.3)或7B89(抗ED-B的抗体；Carnemdla等，1996)偶联到CNBr活化的Sepharose上(Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ,USA)。上清液上样，PBS清洗，再用PBS+0.5M NaCl清洗，100mMEt3N洗脱。抗体对PBS透析。
抗体如上述进行标记，当鼠的肿瘤直径接近1cm时，向其尾静脉注射100μl 1mg/ml scFv1-CY71的PBS溶液。
图5所示，scFv(CGS-1)在肿瘤上定位三天，虽然此期间抗体会迅速消除，但在股骨中仍有一些染料。将C端含半胱氨酸的两亲性螺旋导入CGS-1，抗体的二聚化增强，由此对肿瘤的靶向定位大幅度增强(Pack等，1993)。事实上，二聚体化的scFv(CGS-2)2定位在24～72小时内不会显著降低，而阴性对照(scFv二聚体(D1.3)2，抗溶菌酶的抗体)迅速消除，在肿瘤或股骨中没有可测到的结合。
scFv(28SI)在6小时有微弱的肿瘤靶向定位(未发表)，24小时及以后均检测不到(图6)。亲合力成熟极大地提高了靶向定位；因此，scFv(CGS-2)无论其单体(图6)或双体(未发表)对小的和大的肿瘤均能有效地定位。
两天后，每克肿瘤注射抗体剂量百分比，scFv(CGS-2)单体约为2％，双体约3～4％。由CGS-2携带到肿瘤的剂量高于CGS-1(图5和图6)，这与它们亲合力的差异有关。但是scFv(28SI)和scFv(CGS-2)似乎易被蛋白酶降解，肝摄入量较高(图6),scFv(CGS-1)抗体明显更稳定且肝摄入量较低(图5)。
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权利要求
1．一种特异结合成员，它特异性识别纤连蛋白(FN)的ED-B癌胚结构域并与之直接结合。
2．根据权利要求1的特异结合成员，它包含一个抗体的抗原结合区。
3．根据权利要求2的特异结合成员，其中所述的抗体抗原结合区来源于人。
4．根据权利要求1到3任一项所述的特异结合成员，它结合用嗜热菌蛋白酶处理FN后含ED-B的所有FN。
5．根据权利要求1到4任一项所述的特异结合成员，它结合所有包含带有ED-B结构域的Ⅲ型同源重复的重组FNs。
6．根据权利要求1到5任一项所述的特异结合成员，它与B-FN的结合被ED-B结构域所抑制。
7．根据在前权利要求任一项所述的特异结合成员，它结合人，小鼠，大鼠，鸡以及其它ED-B结构域保守的物种的B-FN。
8．根据在前权利要求任一项所述的特异结合成员，它与不经N-聚糖酶处理FN的B-FN结合。
9．根据在前权利要求任一项所述的特异结合成员，其重链可变区(VH)序列来自人种系DP47(密码子1 Glu-密码子98 Arg，见图1)和CDR3序列Ser Leu Pro Lys。
10．根据权利要求1到8任一项所述的特异结合成员，其重链可变区(VH)序列来自人种系DP47(密码子1 Glu-密码子98 Arg，见图1)和CDR3序列Gly Val Gly Ala phe Arg pro Tyr Arg Lys His Glu。
11．根据权利要求1到8任一项所述的特异结合成员，其轻链可变区(VL)序列来自人种系DPL16(密码子1 Ser-密码子90 Ser，见图1)和CDR3序列的剩余部分Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val。
12．根据权利要求1到8任一项所述的特异结合成员，其轻链可变区(VL)序列来自人种系DPL16(密码子1 Ser-密码子90 Ser，见图1)和CDR3序列的剩余部分Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val。
13．根据权利要求1到8任一项所述的特异结合成员，其重链可变区(VH)序列来自人种系DP47(密码子1 Glu-密码子98 Arg，见图1)和CDR3序列。
14．根据在前权利要求任一项所述的特异结合成员，其纯化单体与ED-B的解离常数(Kd)测量为6×10-8M或更小。
15．根据在前权利要求任一项所述的特异结合成员，其中所说的结合成员包括一个scFv分子。
16．根据在前权利要求任一项所述的特异结合成员，其中所说的结合成员包括一个二聚体的scFv分子。
17．根据在前权利要求任一项所述的特异结合成员，其中所说的结合成员包括CGS-1或CGS-2。
18．一种药物组合物，包含有效量在前权利要求任一项所述的特异结合成员与药物上可接受的赋形剂结合。
19．一种编码根据权利要求1-17所述特异结合成员的核酸。
20．一种编码根据权利要求1-17所述的特异结合成员的噬菌体。
21．用根据权利要求19的核酸转化或转染的宿主细胞。
22．根据权利要求1到17任一项的特异结合成员用于治疗。
23．根据权利要求1到17任一项的特异结合成员用于制备对肿瘤成像或定位的医药制品。
24．根据权利要求1到17任一项的特异结合成员的制备方法，包括在宿主细胞中表达根据权利要求19的核酸。
25．根据权利要求1到17任一项的特异结合成员的制备方法，包括下列步骤a)用来自纤连蛋白的重组抗原筛选在噬菌体中表达的多肽或蛋白质文库；b)用阳性克隆感染宿主细菌细胞；c)对阳性噬菌体克隆作亲合力成熟；d)重复a)和b)步骤以选取对抗原亲合力提高的阳性噬菌体克隆；e)用阳性克隆感染宿主细胞并从所述宿主细胞提纯抗体分子。
26．根据权利要求25的方法，其中步骤a)包括用来自纤连蛋白的重组抗原筛选一个scFv噬菌体库。
27．根据权利要求26的方法，其中所述的噬菌体文库表达人来源的scFvs。
28．根据权利要求25的方法，其中在步骤a)中，用重组抗原TB89或ED-B筛选噬菌体克隆。
29．一种诊断试剂盒，包含权利要求1到17任一项的特异结合成员和一种或多种能检测该成员与细胞结合的试剂。
全文摘要
根据本发明,提供了一种特异识别并直接结合纤连蛋白(FN)的ED－B癌胚结构域的特异结合成员。本发明还提供了制备该结合成员的材料与方法。
文档编号A61P35/00GK1219968SQ9719490
公开日1999年6月16日 申请日期1997年5月23日 优先权日1996年5月24日
发明者D·尼里, B·加呢默拉, A·斯里, E·巴勒萨, P·卡斯特拉尼, A·皮尼, L·萨迪, G·温特, G·尼里, L·伯斯 申请人:菲罗根有限责任公司