表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒。是从质粒pIRES2-EGFP-hTERT中酶切获得目的基因hTERT，插入pSG218穿梭载体中巨细胞病毒启动子的下游，得到携带hTERT基因的重组穿梭载体，再将该重组穿梭载体与病毒骨架载体pPE3-F11B共转染至人胚肾293细胞，得到携带hTERT的非增殖型腺病毒。用该重组腺病毒感染人类多发性骨髓瘤细胞，可以使细胞过度表达hTERT基因，增强细胞对表阿霉素的耐药。本发明的主要用途是建立过表达hTERT基因的多发性骨髓瘤细胞株模型，并在此模型上进一步研究hTERT基因参与多发性骨髓瘤细胞耐药的机制。
【专利说明】表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种表达hTERT基因的重组腺病毒及其应用。
【背景技术】
[0002]端粒(telomere)是真核生物染色体末端的特殊帽状结构，随着每次染色体的分裂而缩短，当其长度达到临界状态是即诱发细胞衰老与死亡。人类端粒酶(telomerase)的主要作用是以自身RNA亚基(TERC)为模板，利用其逆转录酶亚基(hTERT)逆转录合成端粒重复序列(TTAGGG)并添加于染色体末端，从而维持端粒长度的稳定。hTERT是端粒酶活性的主要限速酶，在绝大多数的恶性肿瘤细胞中被激活，使细胞获得永生化能力；此外，hTERT的激活还能通过多种途径调节肿瘤细胞的增殖与凋亡，增强细胞对化疗药物、氧化损伤以及电离辐射的抵抗性。研究端粒酶功能的手段之一是通过构建合适的载体导入外源性hTERT基因，导致hTERT在细胞内过度表达。
[0003]端粒酶在多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等人类淋巴系统恶性肿瘤中同样被激活。这类恶性疾病目前面临的主要问题是无法彻底治愈。目前，hTERT基因表达变化对细胞内信号通路与基因表达的影响，并不明确。调节hTERT基因的表达可能有助于找到治疗上述疾病的新途径；而且hTERT作为肿瘤通用抗原，本身也是理想的肿瘤治疗靶点。构建高效的负载hTERT基因的载体是进行上述研究的重要前提。
[0004]腺病毒表达载体具有一系列独特的优点:1.与人类基因同源，因而目的蛋白的表达水平高，功能完全；2.腺病毒基因不会与宿主染色体基因整合，因而不会影响宿主结构基因的正常表达，也不会导致插入性突变，从而使目的基因准确表达；3.可以插入较大的外源基因片段(8.5kB) ;4.感染效率高，对增殖细胞与非增殖细胞均有感染力；4.腺病毒基因组进入细胞核的效率高达40% ;5.安全性好，对人的致病力与致突变力低。由于腺病毒载体在人类细胞上进行基因转移与蛋白表达的高效性，因此成为当今使用最多的病毒载体之一。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒，先用内切酶 EcoR I 从质粒 pIRES2-EGFP-hTERT 中酶切获得目的基因 hTERT(SEQ ID N0.l,4015bp),插入质粒PSG218 (3926bp)中巨细胞病毒启动子的下游的EcoR I (1008)酶切位点，得到携带hTERT基因的重组腺病毒质粒pDC318-hTERT(7941bp)，再将该重组腺病毒载体与病毒骨架载体PPE3-F11B用脂质体介导法共转染至人胚肾293细胞(HEK细胞)进行包装，得到携带hTERT的重组非增殖型腺病毒VDC318-hTERT，hTERT基因插入pSG218穿梭载体后，转化的细菌为E.coli DH5 α，随后在该细菌内重组、扩增。
[0006]所述携带hTERT基因的腺病毒表达载体命名为pDC318_hTERT。
[0007]本发明的另一个目的是提供所述一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒在hTERT基因过表达研究中的应用。该重组腺病毒感染靶细胞后可以使靶细胞过度表达hTERT基因，可用于进一步研究hTERT基因介导肿瘤细胞耐药及其机制的研究。
[0008]本发明公开的携带hTERT基因的重组非增殖型腺病毒VDC318_hTERT，可高效感染人类多发性骨髓瘤细胞株，并在细胞内过度表达hTERT基因。本发明的主要用途是建立了过表达hTERT基因的多发性骨髓瘤细胞株模型，并在此模型上进一步研究hTERT基因参与多发性骨髓瘤细胞耐药的机制。实验证明，受本发明的携带hTERT基因的重组非增殖型腺病毒VDC318-hTERT体外感染的人类多发性骨髓瘤细胞株RPM1-8226，可分别在基因水平和蛋白水平检测到hTERT的表达上调；并且，上调hTERT基因表达后，RPM1-8226细胞对表阿霉素的抗药性显著增强。
[0009]所述受本发明的重组腺病毒VDC318-hTERT感染的过表达hTERT的RPM1-8226骨髓瘤细胞模型也属于本发明的保护范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为pDC318-hTERT载体酶切鉴定电泳图；将hTERT基因插入pSG218穿梭载体中巨细胞病毒启动子的下游，得到携带hTERT基因的重组穿梭载体的酶切鉴定结果。图中Ml 为 ADNA/EcoRI+Hindlll marker, M2 为 lOObpDNALadder，泳道 I 为 BamH I 单酶切获得1519bp + 6422bp 片段，泳道 2 为 Kpn I + Sac I 酶切获得 1431bp + 2465bp + 4045bp 片段，泳道 3 为 Pvu II 单酶切获得 330bp + 441bp + 526bp + IlOObp + 1515bp + 4029bp片段，泳道 4 为 Pst I 单酶切获得 30bp + 185bp + 496bp + 825bp + 1260bp + 5145bp 片段。
[0011]图2为通过PCR扩增11型Fiber鉴定重组腺病毒VDC318-hTERT的结果；PCR产物长度731bp。其 中M为IOObp DNA Ladder ；N为阴性对照；P为阳性对照(上述已构建的pDC318-hTERT质粒)；1_3分别为包装好的1_3号病毒样本，目标条带731bp。
[0012]图3为通过PCR扩增hTERT鉴定重组腺病毒VDC318_hTERT的结果；PCR产物长度1085bp。其中M为IOObp DNA Ladder ;N为阴性对照；P为阳性对照(上述已构建的pDC318-hTERT质粒)；1_3分别为包装好的1_3号病毒样本；目标条带1085bp。
[0013]图4为不同MOI值的重组腺病毒VDC318-hTERT对多发性骨髓瘤细胞株RPM1-8226活力的影响。用MOI值为0，2，10,50的VDC318-hTERT腺病毒数转染RPM1-8226细胞24及48小时后用MTT法检测细胞活力。
[0014]图5A为重组腺病毒VDC318-hTERT转染RPM1-8226细胞的hTERT表达上调的RT-PCR鉴定结果。转染后扩增hTERT基因，产物长度304bp。
[0015]图5B为重组腺病毒VDC318-hTERT转染RPM1-8226细胞的hTERT表达上调的RT-PCR鉴定结果。转染后扩增hTERT基因，产物长度196bp。
[0016]图6为重组腺病毒VDC318-hTERT转染RPM1-8226细胞的hTERT表达上调的Western Blot鉴定结果。
[0017]图7为MTT法检测重组腺病毒VDC318-hTERT转染RPM1-8226细胞对表阿霉素抗药性增强的鉴定结果。其中A.用不同浓度的表阿霉素处理24小时后，8226-hTERT细胞株的细胞活力显著高于对照细胞株用不同浓度的表阿霉素处理48小时后，8226-hTERT细胞株的细胞活力显著高于对照细胞株；C.8226-hTERT细胞株对表阿霉素的24小时IC50值较对照细胞提高55.06% ；48小时IC50值较对照细胞提高59.31%。
【具体实施方式】
[0018]本发明结合附图和具体实施例作进一步的详细说明。
[0019]下述实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法，具体步骤可参见《MolecularCloning: A Laboratory Manual)) (Sambrook, J., Russell, David ff., MolecularCloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0020]所述百分比浓度如无特殊说明均为质量/体积百分比浓度(W/V)或体积/体积百分比浓度(V/V)。
[0021 ] 所用引物由上海生工生物技术有限公司合成。
[0022]实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律或道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0023]实施例1构建携带hTERT基因的重组质粒pDC318_hTERT。
[0024]取本实验室先前构建的质粒pIRES2-EGFP_hTERT，用内切酶EcoR I内切，回收4015bp处条带(hTERT基因 )。取pSG218载体，用内切酶EcoR I内切，回收3926bp处条带。将上述两种酶切回收产物12°C连接12小时。然后将连接产物转化DH5 α大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板(含100ug/ml AMP)后培养12小时，挑克隆，37°C摇床扩增12小时。抽提阳性克隆的质粒DNA，分别用BamH I,Kpn I +Sac 1.Pvu IKPst I进行酶切鉴定，结果如图1所示(Ml 为 ADNA/EcoRI+Hindlll marker,M2 为 IOObpDNALadder，泳道 I 为 BamH I 单酶切获得 1519bp + 6422bp 片段，泳道 2 为 Kpn I + Sac I 酶切获得 1431bp + 2465bp + 4045bp片段，泳道 3 为 Pvu II 单酶切获得 330bp + 441bp + 526bp + IlOObp + 1515bp + 4029bp片段，泳道 4 为 Pst I 单酶切获得 30bp + 185bp + 496bp + 825bp + 1260bp + 5145bp 片段)。构津的重组质粒的酶切结果与预期结果一致，即目的基因hTERT (4015bp) (SEQ IDN0.1)插入质粒DSG218 (3926bp)中巨细朐病毒(CMV)启动子下游的EcoR I (1008)酶切位点，得到檇带hTERT某闵的重纟目质粒(794IbD),命名为pDC318-hTERT。
[0025]实施例2脂质体介导重组质粒pDC318-hTERT与腺病毒骨架载体PPE3_F11B共转染人胚肾293细胞进行病毒包装，以及重组病毒的鉴定、扩增与滴度测定。
[0026]一、脂质体介导重组质粒pDC318_hTERT与腺病毒骨架载体PPE3_F11B共转染人胚肾293细胞进行病毒包装
在转染前一天，在60mm平皿中接种7.5 X IO5个人胚肾293细胞，置于37°C、5%C02细胞培养箱内培养。转染前3-4小时进行全量换液，加入5ml无血清培养基，以保证细胞呈指数生长。准备转染实施例1获得的重组质粒pDC318-hTERT、病毒骨架载体质粒PPE3-F11B和脂质体Lipofectamine 2000 (购自Invitrogen公司)转染293细胞(具体步骤省略)，培养
7-14天后出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化后收集细胞，于-80°C和37°C之间反复冻融3次，然后4°C、5000rpm离心10分钟，去除细胞碎片，将包装好的腺病毒颗粒分装后_80°C保存备用。
[0027]二、重组腺病毒的鉴定1.应用QIAGEN DNA Blood Mini Kit (购自QIAGEN公司)提取重组腺病毒DNA。具体步骤略。
[0028]2.用 PCR 扩增 11 型 Fiber，上游引物序列为:5’ -CAACCACAGGCGGATCTCTAC-3’ (SEQ ID N0.2)，下游引物序列为:5’ -GTTCCAGGACCAAGTTATACG-3’ ( SEQ ID N0.3)。反应条件为:95°C 3 分钟，(95°C 40 秒，48°C 40 秒，72°C 60 秒)X35 cycles，72°C终末延长 10分钟。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示(M为IOObp DNA Ladder [NEB公司];N为阴性对照；P为阳性对照[上述已构建的pDC318-hTERT质粒];1_3分别为包装好的1-3号病毒样本)，检出731bp目标条带，与阳性对照一致。
[0029]3.用hTERT特异性引物I扩增hTERT，上游引物序列为:5’ -TCCTGCACTGGCTGATGAGTG -3’ ( SEQ ID N0.4),下游引物序列为:5’-CACCACTGTCTTCCGCAAGTTC-3’ ( SEQ ID N0.5)。反应条件为:95°C 3 分钟，(95°C 40秒，56°C 40秒，72°C 80秒)X 35 cycles，72°C终末延长10分钟。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果如 图3所示(M为IOObp DNA Ladder [NEB公司];N为阴性对照；P为阳性对照[上述已构建的pDC318-hTERT质粒];1_3分别为包装好的1_3号病毒样本)，检出1085bp目标条带，与阳性对照一致。
[0030]综上所述，所得重组非增殖型腺病毒鉴定正确，命名为VDC318_hTERT。
[0031]三、重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定
将人胚肾293细胞接种于75cm2培养瓶，加入20ml含10%FBS的DMEM培养基，至80-90%的细胞融合度时，换成含2%FBS的DMEM培养基15ml。取0.5ul经病毒空斑纯化获得的、鉴定正确的病毒保存液，小心加入培养瓶，十字形慢慢晃动3次。在37°C 5%C02培养箱中培养48小时后收集病毒上清或细胞沉淀，沉淀细胞加AD buffer保存液，-80°C至37°C冻融3次，600g离心20分钟后去沉淀取上清。按上述步骤反复扩增至需要的病毒量。然后HPLC法病毒纯化。用50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度为3.5 X IO9 PFU/ml。
[0032]实施例3检测重组腺病毒VDC318_hTERT体外转染目的细胞的转染效率以及表达情况。
[0033]以人多发性骨髓瘤细胞株RPM1-8226为例，检测本发明重组腺病毒VDC318_hTERT体外转染目的细胞后hTERT基因的表达鉴定，具体检测方法如下:
一、人多发性骨髓瘤细胞株RPM1-8226的培养
从液氮罐中取出冻存的RPM1-8226细胞株，37 V水浴融化后加入含10%FBS的RPM1-1640培养基，置于37 °C, 5% CO2的培养箱中培养6小时，1000rpm离心5分钟，用含10%FBS的RPM1-1640培养基全量换液以去除防冻剂DMS0。置于37°C，5% CO2的细胞培养箱，1-2天传代或半量换液一次。取处于对数生长期的细胞进行转染实验。
[0034]二、MOI值的估算:准备一块洁净的6孔板，每孔接种2 X IO5个人胚肾293细胞，培养24小时后，各孔分别加入0.25ul、0.5ul、lul、2ul、4ul上述实施例2中已测定滴度的重组腺病毒VDC318-hTERT，剩余I孔作空白对照。培养72小时后在显微镜下观察，发现加入Iul病毒的孔发生完全CPE，根据表1的公式计算MOI值。
【权利要求】
1.一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒，其特征在于，通过以下步骤获得:先用内切酶EcoR I从质粒pIRES2-EGFP-hTERT中酶切获得SEQ ID N0.1的目的基因hTERT，插入质粒PSG218中巨细胞病毒启动子的下游的EcoR I酶切位点，得到携带hTERT基因的重组腺病毒质粒pDC318-hTERT，再将该重组腺病毒载体与病毒骨架载体PPE3_F11B用脂质体介导法共转染至人胚肾293细胞，得到携带hTERT的重组非增殖型腺病毒VDC318-hTERT，其中hTERT基因插入pSG218后，转化的细菌为万.coli DH5 α，随后在该细菌内重组、扩增。
2.根据权利要求1所述的一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒，其特征在于，hTERT基因插入pSG218穿梭载体后，转化的细菌为万.coli DH5 α，随后在该细菌内重组、扩增。
3.根据权利要求1所述的一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒，其特征在于，所述携带hTERT基因的腺病毒表达载体命名为pDC318-hTERT。
4.权利要求1所 述的一种表达hTERT基因的重组非增殖型腺病毒在hTERT基因过表达研究中的应用。
【文档编号】C12N15/861GK103952380SQ201410194781
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月10日 优先权日:2014年5月10日
【发明者】张越峰, 金洁 申请人:浙江大学