来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子及其应用的制作方法

专利名称：：来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种启动子，尤其是涉及一种来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子，以及含有上述启动子的表达载体，用于在不同物种的细胞中表达外源基因。
背景技术：
：在基因工程领域中，目标基因的重组表达不论在理论研究还是在实际应用上都具有重要的意义。要使目标基因在宿主细胞中表达，就要将它克隆到带有基因表达所需要的各种元件的基因工程载体中，这种载体称为表达载体。基因表达系统可分为原核表达系统和真核表达系统。大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，能够方便且高效地表达、纯化重组蛋白。但是，当目标基因是真核基因时，原核系统就表现出许多缺陷，如没有真核细胞翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和正确的空间构像，因而产生的蛋白质常缺乏良好的生物学活性；而且重组蛋白常常以包涵体形式存在，复性困难。这种情况下就需要使用真核表达系统来表达目标基因(1、楼士林，杨盛昌，龙敏南，章军，基因工程，北京科学出版社，2002年，第一版)。常用的真核表达系统有酵母、昆虫、哺乳类细胞等表达系统。真核表达载体需要具备一些基本元件，包括在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件真核启动子、转录终止信号、poly-Α加尾信号、mRNA剪接信号、筛选标志基因以及供外源基因插入的多克隆位点等。此外，还需要在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、筛选标志等，以便能在大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆(1、楼士林，杨盛昌，龙敏南，章军，基因工程，北京科学出版社，2002年，第一版；2、萨姆布鲁克，拉塞尔著，黄培堂译，分子克隆实验指南，北京科学出版社，2002年，第三版)。真核启动子作为在真核细胞中启动基因转录的必需元件，是真核表达载体中一个关键的组成部分，它决定了目标基因的表达效果。现在最常见的商业化表达载体主要适用于4类表达系统，包括大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物；这些载体上的启动子，主要来源于细菌、酵母、动物、病毒等的基因组。其中来源于病毒的启动子，特别是来源于DNA病毒的启动子以其强活性在动物细胞表达系统中占有至关重要的位置。DNA病毒的基因根据其表达的时间可划分为极早期基因、早期基因和晚期基因。病毒入侵宿主的最初阶段，在无新病毒蛋白合成的情况下，一些病毒基因的启动子可以被宿主细胞中的转录调节因子识别，并利用宿主细胞RNA聚合酶II进行转录，这些基因称为病毒极早期基因(3、Buisson,M.，Manet,Ε.，Trescol-Biemont,Μ.C.，Gruffat,H.，Durand,B.，andSergeant，Α.(1989).TheEpstein-Barrvirus(EBV)earlyproteinEB2isaposttranscriptionalactivatorexpressedunderthecontrolofEBVtranscriptionfactorsEBlandR.JVirol63(12),5276-5284)。由于病毒极早期基因的转录完全依赖宿主细胞来完成，因此通常情况下这类基因的启动子是能够作为表达载体的元件在宿主细胞中启动下游基因表达的。例如来源于巨细胞病毒CMV的极早期启动子以及来源于猴空泡病毒SV40的早期启动子，是目前商业化的哺乳动物表达载体中最常用的强启动子(如Clontech公司以及Sigma公司的pCMV系列载体，Invitrogen公司的pcDNA系列载体)；而来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)极早期启动子以及黄杉毒蛾核型多角体病毒(OpNPV)极早期启动子，是昆虫表达载体中常用的启动子(例如Novagen公司pIEx系列载体，以及Invitrogen公司的pIZ/V5-His载体)。由此可见，DNA病毒的极早期基因是强启动子的良好来源。虽然在目前常用的几个表达系统中都具有功能强大的启动子，能保证基因的高效表达，但是由于载体所带启动子具有种属特异性，这些表达载体在不同的表达系统之间通用性并不强，因此当需要在不同的物种中表达外源基因时，人们需要通过基因扩增、酶切、连接等实验步骤来为目标基因更换适宜的表达载体，比较费时费力。虽然近年来有公司研发出一些基于DNA重组技术的方法(如Invitrogen公司的Gateway系统)，来方便目标基因在不同表达载体之间的转移，但是应用该方法仍然需要更换载体，且实验成本远高于传统的基因克隆方法(如Irwitrogen的Gateway系统，一次克隆实验中所用酶的价格需要100200元，而传统方法一次克隆所用的酶一般不到10元)，因此这种新方法的应用并不广泛，而构建一个能够在不同表达系统中通用的载体将是解决这一问题的一个有效途径。最近，在对一种危害对虾的病原体——白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus,WSSV)的研究中，人们发现1个白斑综合症病毒极早期基因的启动子在昆虫细胞Sf9中具有活性(4、Liu,W.J.，Chang,Y.S.，Wang,C.H.，Kou,GH.，andLo,C.F.(2005)·MicroarrayandRT—PCRscreeningforwhitespotsyndromevirusimmediate-earlygenesincycloheximide-treatedshrimp.Virology334(2),327-341),这予页不着来源于白斑综合症病毒的启动子具有一定的物种间通用性。
发明内容本发明的第一目的是提供一种来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子。本发明的第二目的是提供用于克隆来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的两条引物。本发明的第三目的是提供一种含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体。本发明的第四目的是提供一种含有本发明第三目的所述表达载体的重组宿主细胞。所述来源于白斑综合症病毒的物种间通用型启动子是具有下述任一特征的DNA分子1)由SEQIDNO.1碱基对1-331定义的DNA分子；2)与SEQIDNO.1碱基对1_331定义的序列具有>70%同源性，且能够控制下游基因转录的DNA分子；3)是SEQIDNO.1的片段、遗传变体或缺失体，且能够控制下游基因转录的DNA分子。所述SEQIDNO.1为ctcgcccaccaccagatatctgggaagccttaggcgagtcatgtttcttgcaccatgtat60ttctaggaatttcgctgacgtcaataaactggtttgtcatcctgttttatccagtttgct120gacgtcaatagaccatatttgggcatctcgcccacacagaaacaggatatgatatcatag180atttctgggaagagggtgttttttgtgccgatctgggtgtataaaagagcgctgcggaga240ggcagaaacatcagacagacttgatctgtacagctagcagcagcagtagcagcagccaag300agaagatcggacgcaaaccattctcgcagcc331所述用于克隆来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的两条引物是由SEQIDN0.2和SEQIDNO.3定义的DNA分子。所述SEQIDNO.2为5，gaagatctctcgcccaccaccagata3，所述SEQIDNO.3为5，ggaattcggctgcgagaatggtttg3，。所述重组宿主细胞是通过在宿主细胞中转染含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体获得的，所述重组宿主细胞能够表达由来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子控制的目标蛋白基因。所述宿主细胞可选自昆虫细胞，哺乳动物细胞或白斑综合症病毒宿主的细胞等。本发明具有以下突出优点和技术效果。本发明提供了一个来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子，该启动子是白斑综合症病毒极早期基因的启动子。这个来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子可以在昆虫细胞、哺乳动物细胞，以及白斑综合症病毒宿主细胞(包括螯虾、对虾细胞)中高效启动下游基因的表达。它具有以下突出的优点1)在不同物种间具有很强的通用性，可用于构建在多个物种之间(包括无脊椎动物和脊椎动物之间)能够通用的表达载体，以省却在不同物种中表达外源基因时需要不断更换载体的麻烦，提高分子生物学实验的效率。2)具有很强的活性，可以用于改进现有的昆虫表达载体和哺乳动物表达载体。3)可以用于构建适用于虾类的载体，解决目前缺乏适用于水生甲壳动物的表达载体的问题。图1为RT-PCR验证WSV249是否是白斑综合症病毒极早期基因。通过RT-PCR的方法，检测在加入了100yg/ml放线菌酮抑制细胞蛋白合成的情况下，感染白斑综合症病毒的细胞中候选极早期基因WSV249，以及文献报道证明为极早期基因的WSV069(iel)(4、Liu,W.J.,Chang,Y.S.,Wang,C.H.,Kou,G.H.,andLo,C.F.(2005).MicroarrayandRT-PCRscreeningforwhitespotsyndromevirusimmediate-earlygenesincycloheximide-treatedshrimp.Virology334(2)，327-341)，还有两个非极早期基因DNA聚合酶基因和结构蛋白基因VP28的转录情况。在图1中，GenomicDNA表示以白斑综合症病毒基因组DNA为模板检验各个病毒极基因扩增体系是否正常；“WSSV”表示细胞中是否感染了白斑综合症病毒，“+”为感染，“_”为未感染；“CHX”表示细胞中是否加入了放线菌酮，“+”为加lOOug/ml放线菌酮，“_”为未加放线菌酮；“WSV249”:表示RT-PCR检测白斑综合症病毒基因WSV249的转录情况；“WSV069(iel)”表示RT-PCR检测白斑综合症病毒基因WSV069(iel)的转录情况；“DNApolymerase”表示RT-PCR检测白斑综合症病毒的DNA聚合酶基因的转录情况；“VP28”:表示RT-PCR检测白斑综合症病毒结构蛋白基因VP28的转录情况；“actin”:表示RT-PCR检测克氏原螯虾细胞的一个“看家基因”肌动蛋白基因actin的转录情况，“Intergeniccontrol"指示样品中是否有病毒基因组DNA的污染。图2为来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子在昆虫细胞中的活性分析。将包含来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体PIZA-P249-EGFP转染到昆虫细胞High-five(Invitrogen)中，通过显微镜观察(图2A)以及Western杂交(图2B)的方法，检测下游报告基因EGFP的表达情况；“阳性对照”指细胞中转染的是pIZ-EGFP质粒(5、TianLuo,FangLi,KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecμIarImmunology44(2007)1516-1523),‘‘阴性对照”指细胞中转染的是pIZAIE/EGFP质粒(5、TianLuo,FangLi，KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecμIarImmunology44(2007)1516-1523)，“P249”指细胞中转染的是ρΙΖΔ-P249-EGFP质粒；“GFP”表示报告基因EGFP的表达情况；“DAPI”:表示细胞核的染色；“tubulin”:表示图2B中杂交信号显示的是克氏原螯虾细胞看家基因微管蛋白基因tubulin的表达情况。图3为来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子在哺乳动物细胞中的活性分析。将包含来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体ρΙΖΔ-P249-EGFP转染到哺乳动物细胞Hela细胞中，通过显微镜观察的方法，检测下游报告基因EGFP的表达情况；阳性对照指细胞中转染的是pIZ-EGFP质粒(5、TianLuo,FangLi,KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecyIarImmunology44(2007)1516-1523)，“阴性对照”指细胞中转染的是ρΙΖΔIE/EGFP质粒(5、TianLuo,FangLi,KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecyIarImmunology44(2007)1516—1523)，“P249，，指细胞中转染的是ρΙΖΔ-P249-EGFP质粒；“GFP”表示报告基因EGFP的表达情况；“DAPI”:表示细胞核的染色。图4为来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子在螯虾原代血细胞中的活性分析。将包含来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体PIZA-P249-EGFP转染到螯虾原代血细胞中，通过显微镜观察的方法，检测下游报告基因EGFP的表达情况；阳性对照指细胞中转染的是pIZ-EGFP质粒(5、TianLuo,FangLi，KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecuIarImmunology44(2007)1516-1523)，“阴性对照”指细胞中转染的是ρΙΖΔIE/EGFP质粒(5、TianLuo,FangLi，KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecuIarImmunology44(2007)1516—1523)，“P249，，J旨细胞中转染的是PIZA-P249-EGFP质粒；“GFP”:表示报告基因EGFP的表达情况；“DIC”:表示光镜下通过微分干涉的方法观察到的细胞形态，箭头指示的是表达了报告基因EGFP的细胞。具体实施例方式本发明在筛选白斑综合症病毒极早期基因的基础上，通过对病毒极早期基因启动子的分析，获得了一种来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子，它可以在昆虫细胞、哺乳动物细胞，以及白斑综合症病毒宿主细胞中启动基因表达。以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。实施例1白斑综合症病毒极早期转录样品的制备为了进行极早期基因的筛选，首先需要制备白斑综合症病毒极早期转录样品。选用白斑综合症病毒的宿主之一，克氏原螯虾作为实验材料，抽取经检测不带病毒的克氏原鳌虾的血淋巴先用2ml的一次性注射器吸取抗凝剂(0.8%柠檬酸钠，0.05%柠檬酸，1.87%葡萄糖，0.42%氯化钠，pH5.0)，在克氏原螯虾心脏采血，所采血淋巴的体积不能超过抗凝剂体积。取血后立刻颠倒混勻，拔掉针头后，将针管内的血细胞和抗凝剂的混合液注入无菌离心管中。采集适量血淋巴之后，室温500Xg离心3min。去掉上清，用加入15%FBS，100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素的L15培养基(pH7.2)重悬细胞，将细胞接种到一次性的细胞培养板上，在27°C细胞培养箱内培养。Ih后，更换培养基，在新的培养基内加入100yg/ml放线菌酮(CHX)，抑制细胞中新蛋白质的合成。放线菌酮处理2h后，在极早期基因筛选组中加入5XIO7的白斑综合症病毒粒子进行感染，阴性对照组不加病毒，病毒感染8h后，收集极早期基因筛选组和阴性对照组的细胞，用TRIREAGENT(MolecμIarResearchCenter公司)提取总RNA，这些RNA将用于后续的反转录、标记和芯片杂交工作。由于放线菌酮具有抑制蛋白合成的作用，所以在放线菌酮存在的情况白斑综合症病毒只能利用宿主原有的转录调节因子和RNA聚合酶进行自身基因的转录，因此极早期基因筛选组中只包含了病毒极早期基因和宿主细胞的mRNA，而阴性对照组样品中只包含了宿主细胞的mRNA。实施例2极早期基因的芯片筛选芯片的制备根据白斑综合症病毒(中国株)基因组的序列(GenBankno.AF332093)委托博奥生物有限公司(CapitalBio公司)应用计算机分析设计引物，以Ikb左右作为一个基本单位，利用PCR的方法扩增基因片段，得到了制备白斑综合症病毒全基因组芯片所需的探针。利用基因芯片点样机将探针点到玻片上，制备得到了白斑综合症病毒全基因组芯片，在芯片上还包括了阳性和阴性对照基因(详见参考文献6、FangLi,MingyuanLi,WeiKe,YongchangJi,XiaofangBian,XiuminYan.Identificationoftheimmediate-earlygenesofwhitespotsyndromevirus.Virology.2009Mar1；385(1):267_274)。芯片杂交将极早期基因筛选组RNA样品以及阴性对照组RNA样品分别进行反转录，并用不同颜色的荧光染料Cy3和Cy5进行荧光标记，采用双通道芯片杂交方法进行分析，并每对样品进行一次荧光交换，以校正不同颜色荧光之间的强度差异。杂交后采用LuxScan3.O图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号。数据处理中，在极早期基因筛选组样品以及阴性对照组样品中荧光信号值都在400以下的认为是无表达或者低表达的点，为无效点，不予采用。采用有效的信号值，采用看家基因对信号进行片内归一化。计算极早期基因筛选组样品与阴性对照组样品荧光强度的比值，该比值表示该点所对应的探针在两个样品中的mRNA量的差异(详见参考文献6、FangLi,MingyuanLi,WuiKe,YongchangJi,XiaofangBian,XiuminYan.Identificationoftheimmediate-earlygenesofwhitespotsyndromevirus.Virology.2009Mar1；385(1):267_274)。通过一次芯片分析发现seql44/145、seql46、seql47、seql48几个探针的“极早期筛选组样品/阴性对照组样品”的荧光信号强度比值很大，都在18倍以上，且在阴性对照组中的信号值较低(参见表1)，说明这5个探针中所包含的基因在极早期筛选组样品中有特异的表达。这5个探针在白斑综合症病毒(中国株)基因组中的位置以及长度参见表2。经过比对发现，5个探针中都包含wsv249基因的阅读框，该阅读框的位置在白斑综合症病毒中国株基因组中碱基对137589-139937。因此wsv249基因很可能是白斑综合症病毒极早期基因。表1用白斑综合症病毒基因组芯片进行病毒极早期基因筛选的结果平均荧光比值探针Cy5荧光强度Cy3荧光强度Cy5荧光强度Cy3荧光强度(极早期筛选组编号(极早期筛选组)(阴性对照组)(阴性对照组)(极早期筛选组)/阴性对照组)Seq144/145160558422857-----99.0674Seql44/145164418512783Seql44/145172617552892Seq1463096732975649416-----117.7246Seql463144534276150445Seql463416443680954338Seql47386141211205147836-----42.1739Seql47442941431213951668Seql47462531452228653868Seql4815801702164367-----18.8438Seql4817521882894953Seql4817992052804995表2.目标探针在白斑综合症病毒(中国株)基因组上的位置和开放阅读框<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例3RT-PCR验证WSV249是否是白斑综合症病毒极早期基因为了进一步检验WSV249是否是白斑综合症病毒极早期基因，制备4组样品1、放线菌酮处理的阴性样品克氏原螯虾细胞用放线菌酮处理，未感染白斑综合症病毒；2、放线菌酮处理的感染样品克氏原螯虾细胞用放线菌酮处理，之后在放线菌酮存在的条件下加入白斑综合症病毒感染的克氏原螯虾细胞；3、正常细胞样品未加放线菌酮且未感染白斑综合症病毒的克氏原螯虾细胞；4、正常感染细胞样品未加放线菌酮的条件下加入白斑综合症病毒感染的克氏原螯虾细胞。其中放线菌酮处理浓度为100yg/ml，白斑综合症病毒感染量为IXIO7拷贝/孔(细胞培养的标准6孔板)。细胞准备如实施例1所述。在感染8h后，将RNA分离出来，以oligodT(18)为引物，用逆转录酶SuperscriptIII(invitrogen公司)在42°C反转录lh。再应用wsv249的特异性引物，SEQIDNO.2:5'gaagatctctcgcccaccaccagata3'与SEQIDNO.35'ggaattcggctgcgagaatggtttg3'。通过聚合酶链式反应对该基因进行扩增，同时还扩增了克氏原螯虾看家基因-肌动蛋白基因，白斑综合症病毒非极早期基因vp28基因和DNA聚合酶基因作为对照。克氏原螯虾看家基因_肌动蛋白基因引物为CrayActin-F5‘gacatggagaagatctgg3，，CrayActin-R5‘gggaagctcgtaggactt3，；白斑综合症病毒VP28基因的引物为vp28F5'ctgctgtgattgctgtattt3'，vp28R5‘cagtgccagagtaggtgac3‘；白斑综合症病毒DNA聚合酶基因的引物为dnapolF5‘tgggaagaaagatgcgagag3‘，dnapolR5‘ccctccgaacaacatctcag3‘。扩增DNA污染对照Intergeniccontrol的引物为control-F5;cagactattaatgtacaagtgcg3，control-R5^gaatgattgttgctggttagaacc3，结果如图1所示，wsv249的mRNA能在放线菌酮处理的感染样品中以及正常感染细胞样品中被检测到，而白斑综合症病毒非极早期基因结构蛋白基因vp28和DNA聚合酶基因只能在正常感染细胞样品中才能检测到表达。说明WSV249确实是白斑综合症病毒极早期基因。Actin扩增结果指示在4种样品中的RNA量一致。Intergeniccontrol的扩增结果指示样品中没有DNA污染。实施例4来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的克隆1、将来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子克隆到pMDIS-Tsimple载体中。首先根据白斑综合症病毒中国株的基因组序列(GenBankno.AF332093)，设计一对引物，用PCR的方法扩增极早期基因WSV249阅读框上游331bp个碱基对的DNA片段，预测该片段包含了WSV249基因的启动子，即权利要求书所述的“来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子”。引物序列如SEQIDNO.2与SEQIDNO.3所示。(I)PCR扩增使用50μ1的PrimeSTAR(TAKARA公司)的扩增体系5Xbuffer(Mg2+plus)10μ1dNTP(各2.5mM)4μ1引物各0·5μπι白斑综合症病毒基因DNAIOngPrimeSTAR0.5μ1加水至50μ1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(2)将PCR产物进行凝胶电泳，并将大小为382bp的电泳条带切下，用博大泰克公司的胶回收试剂盒进行回收。(3)用Taq酶(TAKARA)为回收的DNA片段进行末端加碱基A的反应。(4)用NEB公司的T4连接酶将回收的DNA片段与pMD18-Tsimple(TAKARA)载体链接DNA片段8.2μ1Τ4连接酶(NEB)0.5μ1pMD18-Tsimple0.3μ1IOXbuffer1μ1于16°C中放置16h。(5)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，并测序验证目标片段是否被成功克隆。通过上述实验获得了含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的质粒PMD18-Tsimple-P249。2、含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体的构建为了对上述来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的活性进行验证，我们将该启动子克隆到缺乏真核启动子的昆虫表达载体PlZΔIE/EGFP(参见文献5、TianLuo,FangLi，KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecyIarImmunology44(2007)1516-1523.)报告基因EGFP的上游，获得了本发明所述的含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体，简称为pIZA-P249-EGFP。具体步骤如下(1)用Bglll+EcoRI对pMD18-Tsimple_P249质粒进行双酶切。用博大泰克的胶回收试剂盒进行切胶回收，回收大约370bp的片段，该片段含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子。(2)将ρΙΖΔIE/EGFP载体也进行Bglll+EcoRI双酶切。(3)用NEB公司的T4链接酶，将双酶切好的载体和含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的DNA片段进行连接得到ρΙΖΔ-P249-EGFP。(4)连接产物转化大肠杆菌37°C培养过夜。(5)应用QIAGENplasmidMidikit(QIAGEN公司)提取ρΙΖΔ-P249-EGFP质粒。通过Bglll+EcoRI双酶切再次验证其中插入了目标片段。实施例5来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的活性检测为了检测来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的活性，我们将上述含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体分别转染到昆虫细胞、哺乳动物细胞、克氏原螯虾原代细胞中，检测报告基因的表达情况。1、来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子在昆虫细胞中的活性分析在12孔板的每一孔板中加入盖玻片，之后接种high-five(Invitrogen公司)细胞，使之覆盖约50%的培养板面积，培养基为Hyclone公司的SFX-insect，27°C培养过夜。第二天转染之前，更换新鲜培养基。转染的质粒有pIZA-P249-EGFP，阳性对照质粒pIZ-EGFP(5、TianLuo,FangLi，KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecμIarImmunology44(2007)1516-1523)，阴性对照质粒ρΙΖΔtE/EGFP(5、TianLuo,FangLi,KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecμIarImmunology44(2007)1516-1523)。转染步骤质粒DNA(500ng/孔)和50μ1SFX-insect混勻，室温下静置5min；转染试剂Cellfectin(Invitrogen公司)3μ1/孔，和50μ1SFX-insect混勻，室温下静置5min。将二者混勻，室温下静置25min后加入到培养细胞中，细胞在27°C培养24h。而后进行显微镜观察及Western杂交实验，检验报告基因EGFP是否表达。显微镜样品制备和观察将盖玻片取出，用PBS洗一次，加入500μ14%多聚甲醛，室温固定细胞lOmin，用500μ10.5%Trizon-X-100处理lmin，用500μ1PBS洗涤1次，加入500μ1DAPI染色液进行核染色，室温静置lmin，用500μ1PBS洗涤两次，用封片剂封片，干燥20min以上，于荧光显微镜下观察细胞中是否有绿色荧光。Western杂交细胞用0.5mLPBS洗一次，再加入0.5mLPBS，刮下细胞于EP管中，4°C，2000rpm，离心3min，在沉淀加入50μ1CoIPLysisbuffer(1%NP40,500mMNaCl,50mMH印es-K0HpH7.8,5mMEDTA,3mMDTT,0.5mMPMSF)冰浴30min，4°C，13000rpm，离心8min，取上清加入等体积2xSDSloadingbuffer，沸煮IOmin后作为电泳的样品。12%的SDS-PAGE凝胶进行在150V电压下进行蛋白电泳。电泳后凝胶在IOOV进行电转移lh，将凝胶上的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用20mL封闭液(TBST+5%脱脂奶粉)室温封闭Ih后，加入Goatanti-GFP抗体(sigma公司)室温温育2h。用TBST洗膜2次，加入二抗Dongkey-anti-goat-HRP抗体(sigma公司)，常温下温育lh。用TBST洗膜3次，再用水洗膜2次，之后用ECL显色液(Pierce公司)显色液对膜上的信号进行显色反应，并进行X-光胶片曝光。结果如图2所示，显微镜观察(图2A)和western杂交(图2B)的结果都表明，转染了含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体(PIZA-P249-EGFP)，以及阳性对照质粒pIZ-EGFP的昆虫细胞中均能检测到报告基因EGFP的表达，二者表达水平相当。而转染了阴性对照质粒pIZAIE/EGFP的昆虫细胞中报告基因EGFP无表达。说明来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子可以在昆虫细胞中启动报告基因的表达，其活性与阳性对照质粒pIZ-EGFP中含有的昆虫病毒启动子0pIE2相当。2、来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子在哺乳动物细胞中的活性分析在12孔板的每一孔板中加入盖玻片，之后接种Hela细胞，使之覆盖约50%的培养板面积，培养基为Hyclone公司的DMEM(高糖)，含100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10%胎牛血清，于37°C，5%C02培养过夜。第二天转染之前，更换新鲜培养基。转染的质粒有ρΙΖΔ-P249-EGFP，阳性对照质粒pIZ-EGFP(5、TianLuo，FangLi，KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecμIarImmunology44(2007)1516-1523)，阴性对照质粒pIZΔIE/EGFP(5、TianLuo，FangLi,KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecμtlarImmunology44(2007)1516-1523)。转染步骤质粒DNA(500ng/孔)和50μ1Opti-Mem(Invitrogen公司)混勻，室温下静置5min；转染试剂Lipofactamine2000(Invitrogen公司)2μ1/孔，和50μ1Opti-Mem混勻，室温下静置5min。将二者混勻，室温下静置25min。加入到细胞内，混勻，细胞在37°C培养24h后将盖玻片取出，用PBS洗一次，加入500μ14%多聚甲醛，室温固定细胞lOmin，用500μ10.5%Trizon-X-100处理lmin，用500μ1PBS洗涤1次，加入500μ1DAPI染色液进行核染色，室温静置lmin，用500μ1PBS洗涤两次，用封片剂封片，干燥20min以上，于荧光显微镜下观察细胞中是否有绿色荧光。结果如图3所示，转染了含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体，PIZA-P249-EGFP的Hela细胞中能检测到报告基因EGFP的高效表达，而转染了阳性对照质粒pIZ-EGFP的Hela细胞中报告基因EGFP表达较弱，而转染了阴性对照质粒ρΙΖΔIE/EGFP的Hela细胞中报告基因EGFP无表达。说明，来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子可以在哺乳动物细胞中启动下游基因的表达，其活性显著强于阳性对照质粒pIZ-EGFP中含有的昆虫病毒启动子0ρΙΕ2。3、来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子在螯虾细胞中的活性分析抽取经检测不带病毒的克氏原鳌虾的血淋巴先用2ml的一次性注射器吸取抗凝剂(0.8%柠檬酸钠，0.05%柠檬酸，1.87%葡萄糖，0.42%氯化钠，pH5.0)，在克氏原螯虾心脏采血，所采血淋巴的体积不能超过抗凝剂体积。取血后立刻颠倒混勻，拔掉针头后，将针管内的血细胞和抗凝剂的混合液注入无菌离心管中。采集适量血淋巴之后，室温500Xg离心3min。去掉上清，用加入15%FBS，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的L15培养基(pH7.2)悬勻细胞，将悬勻的细胞接种预先放入盖玻片的6孔细胞培养板上，27°C细胞培养箱内培养。Ih后，更换培养基，贴壁Ih更换培养基即可用于转染。转染的质粒有pIZA-P249-EGFP，阳性对照质粒pIZ-EGFP(5、TianLuo,FangLi，KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecμIarImmunology44(2007)1516-1523)，阴性对照质粒pIZΔIE/EGFP(5、TianLuo,FangLi,KaiyuLei,XunXu.Genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenePmAVfromtheshrimpPenaeusmonodon.MolecμIarImmunology44(2007)1516-1523)。转染步骤每转染6孔板的一个孔的单层细胞依如下方法制备转染试剂-DNA混合物2μgDNA溶于50μLOpti-MEM(Invitrogen)无血清培养基，充分混勻。4μLlipofectamine2000(Invitrogen)转染试剂溶于50yLOpti-MEM(Invitrogen)无血清培养基，充分混勻，室温静置5min。将上述两种溶液混勻，室温静置20min。再次混勻后将转染试剂-DNA混合液逐滴加入细胞中，使其混合均勻。27°C，培养24h后将盖玻片取出，用PBS洗一次，加入500μ14%多聚甲醛，室温固定细胞lOmin，用500μ10.5%Trizon-X-IOO处理lmin，用500μ1PBS洗涤1次，用封片剂封片，干燥20min以上，于荧光显微镜下观察细胞中是否有绿色荧光。由于螯虾细胞容易吸附染料造成高背景，因此不用DAPI进行细胞核染色，而是直接通过微分干涉方法观察细胞数目。结果如图4所示，转染了含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体，即PIZA-P249-EGFP的螯虾原代细胞中能检测到报告基因EGFP的表达，而转染了阳性对照质粒pIZ-EGFP和阴性对照质粒ρΙΖΔIE/EGFP的螯虾原代细胞中报告基因EGFP不能表达。由于螯虾原代细胞没有成熟的转染方法，因此本实验中转染效率较低，但是只要是转染了含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体PIZA-P249-EGFP的螯虾原代细胞中，EGFP的表达都比较强。结果说明来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子可以在螯虾细胞中启动下游基因的表达。上述实验表明，来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子可以在昆虫细胞、哺乳动物细胞、螯虾细胞中启动下游基因表达。该启动子以及含有该启动子的表达载体具有物种间的通用性。序列表<110>国家海洋局第三海洋研究所<120>来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子及其应用<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>331<212>DNA<213>白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus)<220><221>TATA_signal<222>(220)..(224)<400>1ctcgcccaccaccagatatctgggaagccttaggcgagtcatgtttcttgcaccatgtat60ttctaggaatttcgctgacgtcaataaactggtttgtcatcctgttttatccagtttgct120gacgtcaatagaccatatttgggcatctcgcccacacagaaacaggatatgatatcatag180atttctgggaagagggtgttttttgtgccgatctgggtgtataaaagagcgctgcggaga240ggcagaaacatcagacagacttgatctgtacagctagcagcagcagtagcagcagccaag300agaagatcggacgcaaaccattctcgcagcc331<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的正向引物，5'端包含一个BglII酶切位点<400>2gaagatctctcgcccaccaccagata26<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的反向引物，5'端包含一个EcoRI酶切位点<400>3ggaattcggctgcgagaatggtttg2权利要求来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子，其特征在于是具有特征1)由SEQIDNO.1碱基对1-331定义的DNA分子；或2)与SEQIDNO.1碱基对1-331定义的序列具有＞70％同源性，且能够控制下游基因转录的DNA分子；或3)是SEQIDNO.1的片段、遗传变体或缺失体，且能够控制下游基因转录的DNA分子；所述SEQIDNO.1为ctcgcccaccaccagatatctgggaagccttaggcgagtcatgtttcttgcaccatgtat60ttctaggaatttcgctgacgtcaataaactggtttgtcatcctgttttatccagtttgct120gacgtcaatagaccatatttgggcatctcgcccacacagaaacaggatatgatatcatag180atttctgggaagagggtgttttttgtgccgatctgggtgtataaaagagcgctgcggaga240ggcagaaacatcagacagacttgatctgtacagctagcagcagcagtagcagcagccaag300agaagatcggacgcaaaccattctcgcagcc331。2.用于克隆如权利要求1所述来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的两条引物，其特征在于为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3；所述SEQIDNO.2为:5'gaagatctctcgcccaccaccagata3'；所述SEQIDNO.3为:5'ggaattcggctgcgagaatggtttg3，。3.含有如权利要求1所述来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体。4.如权利要求3所述表达载体，其特征在于通过转染宿主细胞获得含有表达载体的重组宿主细胞。5.如权利要求4所述含有表达载体的重组宿主细胞，其特征在于能够表达由来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子控制的目标蛋白基因。6.如权利要求4所述含有表达载体的重组宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞选自昆虫细胞，哺乳动物细胞或白斑综合症病毒宿主的细胞。全文摘要来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子及其应用，涉及一种启动子。提供一种来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子、强启动子的两条引物和强启子的表达载体，以及表达载体的重组宿主细胞。该启动子是白斑综合症病毒极早期基因的启动子，可在昆虫细胞、哺乳动物细胞，以及白斑综合症病毒宿主细胞(包括螯虾、对虾细胞)中高效启动下游基因的表达。重组宿主细胞是通过在宿主细胞中转染含有来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子的表达载体获得的，所述重组宿主细胞能够表达由来源于白斑综合症病毒的物种间通用型强启动子控制的目标蛋白基因。文档编号C12N5/10GK101818149SQ20101004482公开日2010年9月1日申请日期2010年1月8日优先权日2010年1月8日发明者李钫,杨丰,林梵宇,柯韡,鄢秀敏申请人:国家海洋局第三海洋研究所