病原诱导启动子P_Xa13及其在病原诱导下调控目标基因表达的应用的制作方法

专利名称：病原诱导启动子P_Xa13及其在病原诱导下调控目标基因表达的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一段水稻DNA片段的功能验证和应 用前景分析。所述的DNA片段包含一个水稻基因的启动子，它能够在病原物的诱导下特异 性地增强基因表达。
背景技术：
植物在生长的过程中，会受到多种病原物如病毒、细菌、霉菌和线虫等的侵害。病 原物侵入植物导致两种结果(1)病原体在寄主植物内繁殖，引起相关的病害；(2)寄主植 物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防 病害同时又保护环境的根本出路。采用转基因技术将抗性基因导入植物是目前改良农作物抗病性的主要途径之一。 但是目前的遗传转化体系存在一些不足，很重要的一点便是转化载体中的启动子大多是组 成型表达启动子。这不仅造成了植物体的负担，使植物在不需要发生抗病反应时表达额 外的蛋白，造成了浪费；严重的还造成了植物体生理和代谢的紊乱，致其产生变异或死亡 (Ehsani 等，2003 ；Karlowski 等，2003 =Miyao 等，2003 ；Durrant 和 Dong，2004)。为了解决以上问题，申请人试图使用特异性启动子调控目标基因的表达。启动子 是一段对基因的表达起调控作用的DNA片段。启动子在原核生物和真核生物中均存在，它 是一段对基因转录的时间，空间和表达量起调控作用的DNA序列。在原核和真核生物中， 启动子的结构有所不同。真核生物有三种RNA聚合酶，每一种都有其识别的不同启动子。 RNA聚合酶II负责蛋白质基因和部分snRNA基因的转录，结构最为复杂。人们比较了上百 个聚合酶II识别的真核启动子的序列，发现了一些共同的结构。如1)帽子位点，即转录起 始位点，其碱基大多为A，两侧各有若干个嘧啶核苷酸，其中A为转录起点。2) TATA框，又称 Hogness框或Goldberg-hogness框，其一致序列为TATAAAA或TATATAT，而在它的两侧由 富含G和C碱基对的序列组成，一般都位于一 35bp附近。TATA框决定了转录起始点的选 择，它是RNA聚合酶和DNA链结合的部位。3) CAAT框，其一致序列为GGC (T) CAATCT。一般 位于一 75bp附近，该框的碱基一旦缺失或突变，将会造成转录效率的急剧降低，CAAT框可 能控制着转录起始的频率。4)增强子(enhancer)，又称为远上游序列，一般都在一 IOObp 以上，它对依赖和不依赖TATA框的转录均有增强转录的作用。另外，不同的启动子上还有 其他不同的顺式(cis)调控元件，它们是反式(trans)调控因子或转录调控蛋白的结合位 点。不同的反式调控因子/转录调控蛋白特异性的与顺式调控元件结合，对基因的表达时 间，空间或表达量进行特异性的调控。特异性的启动子分为二类，一是受诱导表达的特异启动子，二是组织特异性表达 的启动子。诱导型的启动子对外界的某些物质，如病原物，化学物质或逆境作出反应，启动 植物体内相应的基因表达。组织特异型的启动子则驱动基因在特定的组织中表达。特异性 的启动子可避免基因过量表达对植物体产生伤害。因此，利用水稻来源的病原物诱导表达的启动子驱动抗性基因的表达，是改良水稻抗性的最佳选择之一。

发明内容
本发明的目的是对水稻中分离克隆的一个感病基因Xal3启动子区段进行功能验 证，探索利用这个启动子调控抗性基因的表达、从而改良水稻的抗病性的前景。这个启动子 被命名为 P5ial3 (promoter of Xal3)。本发明涉及鉴定水稻基因Xal3启动子的DNA片段(Pxal3)。该片段包含对病原产 生应答反应的元件。其中，所述片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，或者基本 上相当于SEQ ID NO 1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO 1所示序列的亚片 段。可以采用已经克隆的Pxal3启动子作探针，从基因组文库中筛选得到本发明的启动子或 同源的启动子。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组中扩 增得到本发明的Pxal3启动子以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上 技术，可以分离得到包含Pxal3的序列，将这一序列与基因连接并与合适的载体连接，可以转 入植物细胞，产生转基因植物。将克隆的启动子连接抗性基因转入植物，可以避免植物过量表达目标基因造成的 不利影响，这是传统的组成型启动子在转基因的过程中无法做到的。在本发明的实施例部分，申请人阐述了验证Pxal3启动子的过程以及该启动子的特
点ο


序列表SEQ ID No 1.是本发明所涉及的Xal3基因启动子的核苷酸序列。图1.基因启动子和遗传转化DNA片段结构。(A)Xal3基因启动子的基本结构。+1 是预测的转录起始位点；ATG是翻译起始位点；预测的TATA框是RNA聚合酶和DNA链结合 部位；预测的CAAT框控制转录起始的频率。(B)本发明用于功能验证的Xal3基因启动子
(Pxal3)。图2.用Xal3基因的完整启动子Pxal3和系列5’端(P
Xal3-934 Λ Pxal3-394、Pxal3-121、
Pxal3-J以及5’端和3’端双向截短启动子(PXal3_72)调控遗传转化的报告基因 GUS ( β -glucuronidase, β -葡萄糖醛酸酶)。图3.是遗传转化载体PCAMBIA1381的结构。图4.携带不同Xal3基因启动子截短片段遗传转化植株在接种白叶枯病菌后GUS 表达量。GUS的表达量通过测定每分钟每毫克蛋白中由GUS催化产生的4-甲基伞形酮 (4-methylumbelliferone, Mu)的量表示。(A)为转基因植株接种白叶枯病菌PX099后的 ⑶S表达量。(B)为转基因植株接水(对照)处理后的⑶S表达量。图5.携带不同Xal3基因启动子截短片段的水稻品种中花11愈伤组织在接种白 叶枯病菌和GUS表达量。GUS的表达量通过测定每分钟每毫克蛋白中由GUS催化产生的 4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone，Mu)的量表示。每个时间点来源于约15ml愈伤 组织的平均数。ck，病原接种前或接水(对照)前。㈧为转基因愈伤组织接种白叶枯病菌 PX099后的⑶S表达量。(B)为转基因愈伤组织接水处理后的⑶S表达量。图6.用Xal3基因的完整启动子Pxal3和系列点突变启动子(ΡΜ3Δ79Τ，ΡΜ3Δ74Α，Pxal3M8A和Pxal3A77J调控遗传转化的报告基因⑶S (β -glucuronidase，β _葡萄糖醛酸酶)。图7.携带不同点突变的Xal3基因启动子的遗传转化植株在接种白叶枯病菌后 ⑶S表达量。⑶S表达量通过测定每分钟每毫克蛋白中由⑶S催化产生的4-甲基伞形酮 (4-methylumbelliferone, Mu)的量表示。ck，病原接种前或接水(对照)前。㈧为转基 因植株接种白叶枯病菌PX099后的⑶S表达量。(B)为转基因植株接水处理后的⑶S表达 量。
具体实施例方式本发明的前期研究工作结果显示白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 生理小种PX099可特异性的诱导水稻感病基因Xal3表达(Yuan等，2009)。前期研究还 发现Xal3基因启动子上有一个顺式调控元件一 UPT(up-regulated by transcription activator-like effector)盒，白叶枯病菌PX099中的一个效应蛋白(effector)可以特异 性的与UPT盒结合，诱导Xal3基因表达(Rijmer等，2010)。但是人们不清楚是否这个UPT 盒是Xal3基因启动子上唯一一个受PX099调控的顺式调控元件。以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期研究工作结果的基础 上验证Pxal3启动子功能的方法和结果。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可 以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出 各种修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1 :PXal3启动子的结构分析采用一系列启动子分析软件，如 Softberry 网站(http://www. sofiberry. com) 的 TSSP 软件、I3ROSCAN 软件(http //bimas. dcrt. nih. gov/molbio/proscan)、PLACE (A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNAElements)中的 Signal Scan 分析 工 具(http//www, dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan. html)、TESS 软 件(http// searchlauncher, bcm. tmc. edu/seq~search/gene-search.html)、Match 1. O 软 件 (http//www, gene-regulation, com/cgi-bin/pub/programs/match/bin/match.cgi)、以 及 AliBata2. 1 软件(http: //www, gene-regulation, com/pub/programs/alibata2/index, html)等分析Xal3基因启动子的结构。发现在Xal3启动子的_34bp处是TATA框，_332bp 是与转录频率有关的CAAT框(图1A)。实施例2 :Xal3基因启动子的病原诱导功能区分析1.分离Xal3基因启动子的系列截短片段用Xa 13 基因启动子特异性的 PCR 引物 Xal3P~F (5’-GGATCCGATGTTGAGCTTTAGGATT AGCGGGTT-3，)和 X13_promR(5，-GGCAAGCTTGGCCTTGGCCATGGCTCAGT-3‘)扩增 Xal3 基因启 动子的完整DNA片段Pxal3 (序列长度为1413个碱基)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 1所示，共计1413个核苷酸(图IB)。分别用Xal3基因启动子特异性的PCR引物5' dele tion-1147 (5，-GGATCCTCCCTTTCTTCAAGTTACCTCTCTC-3，)、5‘ deletion-608(5’-GGATCCGCA TCATTGTCCATGGTTGT-3，)、XP_90F(5，-GGATCCGAAATATCAAGCACAAG-3，)和 XP_60F(5，-GGAT CCCTGTACACCACCAAAAG-3‘)与Xa 13基因启动子特异性的PCR引物X13_promR配对扩增5’ 端截短的Xal3基因启动子片段PXal3_934(934个核苷酸；序列表SEQ ID NO 1的480_1413bp 所示核苷酸序列)、PXal3-394 (394个核苷酸；序列表SEQ ID N0!的1020_1413bp所示核苷
5酸序列)、PXal3-i2i (H6个核苷酸；序列表SEQ ID NO 1的1298_1413bp所示核苷酸序列) 和PXal3-66(61个核苷酸；序列表SEQ ID NO 1的1353_1413bp所示核苷酸序列)(图2)。用 PCR 引物 XP-90F 和 Xa 13 基因启动子特异性的 PCR 引物 XP_60R(5，-AAGCTTCTTTTGGTGGTGT ACAG-3’)扩增5’端和3’端双向截短的Xal3基因启动子片段PXal3_72 (72个核苷酸；序列表 SEQ ID NO 1的1298-1369bp所示核苷酸序列)(图2)。这些PCR引物均包含一个限制性 内切酶的消化位点(引物序列的下划线处)。PCR扩增获得的DNA片段与pGEM -T载体 (购自美国Promega公司)连接。采用M13-R和M13-F通用引物(购自上海生工生物工程 有限公司)和美国Applied Biosystems公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)对连接了启动 子片段的克隆进行测序，验证PCR扩增产物序列的准确性。2.遗传转化载体的构建所用载体是pCAMBIA1381。pCAMBIA1381载体是国际上常用的植物农杆菌介导 的遗传转化载体pCAMBIA1301(Sim等，2004)的系列载体。该载体携带无启动子的报告 基因⑶S(β-glucuronidase，β -葡萄糖醛酸酶)(图3)。pCAMBIA1381载体由澳大利亚 CAMBIA (Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriculture)惠赠。遗传转化载体的构建采用常规重组质粒构建方法(Sambrook和Russell，2001)。 主要步骤是用限制性内切酶BamHI和HindIII消化上述测序验证后的，连接了不同大小 启动子片段的克隆和遗传转化载体PCAMBIA1381。酶切完毕，用氯仿异戊醇(体积比为 24 1)抽提，纯化酶切产物；然后用去磷酸化酶Alk对纯化的酶切产物进行去磷酸化处 理；用包含不同长度启动子的酶切片段和去磷酸化的PCAMBIA1381载体做连接反应，使其 驱动报告基因⑶S的表达(图2)。通过酶切筛选阳性克隆，并通过BamHI和HindIII酶切 筛选外源片段正向插入的阳性克隆。获得的重组质粒分别被命名为PXal3，PXal3_934，PXal3_394， PXal3-m，PXal3-6f^nPXal3-72。将以上质粒电转化(Sambrook 和 Russell，2001)进入农杆菌菌株 EHA105(Sun 等，2004)。3.不同长度启动子的功能验证采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将EHA105菌株携带的 PXal3GUS,卩&13_934 :6旧和？&13_394 :6旧分别导入感病水稻品种牡丹江8(0巧2& sativa ssp. japonica)。本发明共获得独立阳性遗传转化水稻植株69株，其中携带Pxal3⑶S的19株， 携带PXal3-934 :GUS的20株，携带PXal3_394 :GUS的20株。在分蘖早期将这些遗传转化植株分 蔸，每株一分为二。在分蘖晚期，采用剪叶法(Sim等，2004)将其中一份接种白叶枯病菌 PX099,另一份接水作为对照。⑶S基因的表达量通过测定每分钟每毫克蛋白中由⑶S催化 产生的4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone，Mu)的量表示。Mu的测定按照Jefferson 和BeVan(1987)报道的方法。其主要步骤是取约IOOmg水稻叶片，加入500 μ 1提取液 [50mM磷酸二氢钠(NaH2PO4)UOmM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0. 1 %聚乙二醇辛基苯基醚 (TritonX-100)、0· 十二烷基肌氨酸钠(Sodium lauryl sarcosine) UOmM β-巯基乙 醇(β-mercaptoethanol)]，在研碎中研磨，离心后收集上清液，在Iml预热的提取液中加 入20μ g的总蛋白，在37°C下反应10分钟后取100 μ 1加入到900 μ 1反应中止液(0. 2Μ Na2CO3)中，然后在激发波长365nm和发射波长458nm下用分光光度计测定样品含量。样品 中蛋白质含量的测定采用Bradf0rd(1976)报道的方法。
分析结果表明完整的Xal3基因启动子(Pxal3)在白叶枯病菌接种48小时后可诱导 报告基因的表达，接种120小时后报告基因的表达量达到高峰，大约是接水对照材料的21 倍(图4)。说明Pxal3是病原特异诱导的启动子。Pxal3从5'端截短一定长度后，启动子片 段PXal3-934和PXal3-394仍然可以被病原特异诱导，而且诱导水平与完整启动子Pxal3相似(图 4)。这些结果说明Pxal3启动子的-394到-6bp之间的区段可以受病原诱导，存在病原特异 诱导顺式调控元件。为了进一步确定病原特异诱导顺式调控元件的位置，本发明的研究人员采用瞬时 表达方法(蔡萌，2007)对进一步截短的启动子片段(PXal3-121，PXal3-6jPPXal3-72)进行了分析。 采用上述遗传转化方法制备感病水稻品种中花11 (Oryza sativa ssp. japonica)的愈伤组 织(Lin和Zhang，2005)。采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将EHA105 菌株携带的Pxal3 ⑶S、PXal3_121:GUS、PXal3_66:GUS和PXal3_72:GUS分别导入愈伤组织，然后用白 叶枯病菌PX099或者水(对照)处理愈伤一定时间。其中每个处理分别有约15毫升愈伤 组织。愈伤组织中GUS基因的表达量通过上述测定每分钟每毫克蛋白中由GUS催化产生的 4-甲基伞形酮(4-methylumbellifer0ne，Mu)的量表示。分析结果表明进一步做截短启动 子后，启动子片段PXal3_121仍然可以被病白叶枯病菌PX099特异诱导；与对照(接水)相比， 在接种8小时后PXal3_121调控的⑶S表达量增加了 7. 7倍，而且诱导水平与完整启动子Pxal3 相似(图5)。但是当Xal3基因启动子截短到？&13_66或？&13_72时，这两个启动子片段不受病 原诱导(图5)。而-121到-66bp之间包含病原特异诱导顺式调控元件UPT盒的部分序列 (RSmer等，2010)。这些结果说明Pxal3启动子的_121到_66bp之间可能有除UPT盒以外的 其他病原诱导顺式元件。实施例3 :Xal3基因启动子的功能分析为了验证Xal3基因启动子上是否存在除UPT盒以外的其他病原特异诱导顺式调 控元件，本发明的研究人员通过突变UPT盒研究Xal3基因启动子是否还可以被白叶枯病菌 PX099特异性诱导。1.分离Xal3基因启动子的点突变体^tM GeneTailor Site-directed Mutagenesis i^^O^ (_自__ Invitrogen ^ 司)对？&13启动子进行了定点突变。这种试剂盒的基本原理是用带有突变位点的引物扩增 甲基化的模板质粒，将扩增产物电转化入大肠杆菌中，宿主中的McrBC核酸内切酶将酶解 甲基化的模板，留下带有突变位点的没有甲基化的PCR产物。分别用以下四对引物Xal3PMlF(5，-AAAGCAAAGGTTAGATATTCATCTCCCCCT-3' )/Xa 13PM1R(5，-ATATCTAACCTTTGCTTTTTTTTTTC-3，)、Xal3PM2F(5，-CAAAGGTTAGATATGCATATCCC CCTACTG-3，)/Xal3PM2R(5，-ATGCATATCTAACCTTTGCTTTTTTTTTTC-3，)、Xal3PM4F(5，-AAGC AAAGGTTAGATATGAATCTCCCCCT-3' )/Xal3PM4R(5，-CATATCTAACCTTTGCTTTTTTTTTTC-3，)和 Xal3PM5F(5’ -AGCAAA GGTTAGATATGCGTCTCCCCCTAC-3')/Xal3PM5R(5’ -GCATATCTAACCTTT GCTTTTTTTTTTC-3’)以含有Pxal3片段的克隆为模板进行PCR扩增。其中点突变位点分别 在引物中以下划线标出。为了帮助选择，将扩增产物转化到大肠杆菌DH5a-Tl (购自美国 Invitrogen公司)，此菌株可以阻止甲基化的模板扩增。阳性克隆通过测序验证后，用限制 性内切酶BamHI和HindIII消化，酶切片段和用BamHI和HindIII消化的pCAMBIA1381载体 做连接反应，使其驱动报告基因GUS的表达(图6)，获得的重组质粒分别被命名为ΡΜ3Δ79Τ，
7Ρχβ13Δ74Α' Ρχβ13Δ78Α 和 Pxal3A77G°2.突变启动子的功能分析所用载体是上述pCAMBIA1381。采用上述方法将突变启动子(ΡΜ3Δ79Τ，ΡΜ3Δ74Α， PXal3M8A和Pxal3M7e)分别与PCAMBIA1381载体连接并将重组质粒电转化进入农杆菌菌 株EHA105。采用上述农杆菌介导的遗传转化方法，分别将携SPxal3⑶S、ΡΜ3Δ79Τ⑶S、 PXal3,74A:(iUS、PXal3A78A:(;US 和 ΡΜ3Δ77(;⑶S 构件的 EHA105 菌株导入水稻品种牡丹江 8 (Oryza sativa ssp. japonica)。本发明共获得独立阳性遗传转化水稻植株147株，其中携带 PXal3GUS 的 20 株，携带 Pxal3環:GUS 的 22 株，携带 ΡΜ3Δ74Α⑶S 的 29 株，携带 Pxal3Δ78Α:GUS 的22株，携带Ρ&13Δ77(;⑶S的36株。在分蘖早期将这些遗传转化植株分蔸，每株一分为二。 在分蘖晚期，采用剪叶法(Sim等，2004)将其中一份接种白叶枯病菌ΡΧ099，另一份接水作 为对照。GUS基因的表达量通过上述测定每分钟每毫克蛋白中由GUS催化产生的4-甲基伞 形酮(Mu)的量表示。分析结果表明分别突变了 Xal3基因启动子的-77bp，_78bp或者_79bp位点后，这 三种突变启动子不能够被白叶枯病菌PX099诱导；携带这些突变启动子的转基因植株中病 原诱导后的GUS表达量与同样植株接水(对照)后的GUS表达量无明显差别(图7)。另 外，携带这些突变启动子的转基因植株中病原诱导后的⑶S表达量与携带Xal3基因的完整 启动子(Pxal3)的转基因植株中接水(对照)后的GUS表达量无明显差别(图7)。而突变 了 Xal3基因启动子的_75bp位点后，突变启动子仍然可以被PX099诱导，而且其被诱导水 平与Xal3基因的完整启动子(Pxal3)相似。这些结果说明Xal3基因启动子中只有一个可以被白叶枯病菌PX099特异诱导的 顺式调控元件，它就是UPT盒。只需要Xal3基因启动子的一个小片段，如PXal3_121就可以在 病原诱导下快速(如8小时；图5A)、高量驱动基因表达。可以用这个截短的启动子(PXal3_121) 调控抗病基因用于水稻抗性改良。参考文献蔡萌(2007)病原诱导启动子和组织特异性启动子的分离克隆和功能鉴定。华中 农业大学博士学位论文。Bradford MM(1976)A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72 :248-254.Durrant WE, Dong X (2004)Systemic acquired resistance.Annu. Rev. Phytopathol. 42 185-209.Ehsani PiMeunier A,Nato F,Jafari A,Nato A,Lafaye P (2003)Expression of anti human IL_4and IL—6 scFvs intransgenic tobacco plants. Plant Mol. Biol. 52 17-29.Jefferson RA, Bevan MW(1987)GUS fusions :beta_glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion markerin higher plants. EMBO J. 6 :3901-3907.Karlowski WM, Hirsch AM(2003)The over-expression of an alfalfa RING-H2 gene induces pleiotropic effectson plant growth and development. Plant Mol. Biol. 52 :121-33.
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权利要求
一种对水稻白叶枯病菌产生应答反应的启动子PXa13，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO1所示。
2.权利要求1所述的启动子的应用，其特征在于通过白叶枯病菌诱导目标基因表达。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻病原诱导启动子PXa13的DNA片段的分离克隆、功能验证及应用前景分析。所述的PXa13启动子对白叶枯病菌侵袭水稻产生特异性的应答反应。白叶枯病菌侵袭水稻可以迅速增强PXa13启动子所调控基因的表达。可以利用PXa13启动子调控抗性基因的表达，仅仅在病原侵袭时才启动抗性基因的表达，可以增强水稻对病害的抵抗能力，又不至于使水稻产生多余的蛋白质。
文档编号A01H5/00GK101974528SQ201010284708
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月13日 优先权日2010年9月13日
发明者王石平, 袁婷 申请人:华中农业大学