专利名称：含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列国内外所有的检测方法并没有完全解决转基因产品的检测问题，新的检测方法在不断出现，并在继续完善之中。首先，目前国内外常用的几套筛选引物，不能完全检测出目前已商品化的转基因品种；传统的的PCR技术较难控制污染的产生；另外，质量不过关的检测试剂，经常影响检测结果的判断和检测出证工作。
到目前为止，最有发展前途的检测技术为实时荧光PCR技术。实时荧光PCR技术具有很多优点使用了杂交探针，提高了检测的准确性；荧光检测的高灵敏度；不用对PGR产物后期处理，较好地降低了检测过程中的污染；边扩增边检测，提高了检测速度；可以使用国际标准品对检测样品进行定量。这个技术的核心环节是首先要获得能高效、特异并灵敏地扩增目的片断DNA的引物。
据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001年全世界转基因作物种植面积为5260万公顷，十多个国家已种植转基因作物，其中99％的转基因作物种植在美国、阿根廷、加拿大和中国，已批准商品化转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。
对转基因产品的安全性，特别是转基因食品对人和动物的健康及对生态环境的影响，自转基因技术出现以来，就一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点问题，2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定，其中最重要的措施之一就是对转基因产品要进行检验，以明确其种类，确定是否为已批准的或已获得许可的转基因产品，以防止一些具有风险的转基因产品任意扩散，造成不可挽回的损失。2001年欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超过1％的转基因产品(阈值)则不用标识，这样转基因产品检测不但需要定性，还需要定量检测。不同国家阈值大小不一样，从1-5％不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，并于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法。目前全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律法规。总之，转基因产品的研究、生产、销售都要在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点进行。
事实上，最近几年已先后发现转基因产品研究、生产及进出口过程中出现安全及监管事故，存在各种各样的转基因产品扩散、污染及安全隐患，加大对转基因产品的检测监管是非常必要的。
2002年欧盟执行新的转基因产品管理法规，要求对转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程的“跟踪”、检测，以保证转基因产品不污染非转基因产品。美国提出了品种“个性保存”方案，所不同的是要求对非转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程的“跟踪”检测，以确保非转基因产品不被转基因产品污染(事实上完全不被污染是不可能的，但要控制在一定的许可范围之内)。许多国家对进口非转基因食品，要求出口商提供经检测合格的非转基因产品证明。
综上所述，转基因食品从研究、生产、贮存、运输、销售、进出口等环节都需要检验监控，不但要求检测出是否含有转基因，而且要检测出转基因产品的含量。
对转基因产品的检测，主要想解决如下几个方面的问题是否为转基因产品；如果含有转基因产品、又是某国已批准商品化的转基因产品，则要检测出转基因产品的含量是否达到允许值；如果是尚未批准的转基因产品，原则上不允许进口或销售。所有这些都离不开确实可靠的GMO检测方法。
一个好的GMO检测方法首先要有较广泛的GMO针对性。虽然转基因作物的获得性状的多种多样，但为了使转入的基因成功表达，均需要插入一定的外源性调控序列，例如启动子、终止子等等。花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子(或其人工改建序列)就是一种最常见的插入序列，大约70％的转基因作物均含有该序列。因此，35s启动子成为GMO检测的一个理想的标志性DNA序列。
发明内容
本发明的目的就是要提供针对35s启动子序列的特异性好、灵敏度高的扩增引物，用于转基因作物的PCR的检测。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列，所述的引物序列包括由上游引物35s7248，其序列为CGACAGTGGTCCCAAAGAT和下游引物35s2R，其序列为AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC组成的引物对，在该引物对的上游引物位置前延10个碱基得到35s7238，后延10个碱基得到35s7258，而引物对的下游引物位置前延10个碱基得到35s7290，后延10个碱基得到35s7310，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内，得到的引物序列。
含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列，所述引物序列包括由上游引物35s7201其序列为TGCCATCATTGCGATAAAG和下游引物35s7345R其序列为CCCTTACGTCAGTGGAGAT组成的引物对，在该引物对的上游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，而引物对的下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内，得到的引物序列。
含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列，所述引物序列包括由上游引物35s7190其序列为GCTCCTACAAATGCCATCA下游引物35s7165序列为GATAGTGGGATTGTGCGTCA组成的引物对，在该引物对的上游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，而引物对的下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内，得到的引物序列。
含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列，所述引物序列包括由上游引物35s7240其序列为GCCTCTGCCGACAGTGGT和下游引物35s7306R其序列为TTGAAGACGTGGTTGGAAC组成的引物对，在该引物对的上游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，而引物对的下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内，得到的引物序列。
最优引物序列如下35s7240GCCTCTGCCGACAGTGGT35s7306rTTGAAGACGTGGTTGGAAC
35s7201TGCCATCATTGCGATAAAG35s7345RCCCTTACGTCAGTGGAGAT35s7190GCTCCTACAAATGCCATCA35s7365rGATAGTGCGATTGTGCGTCA35s7248CGACAGTGGTCCCAAAGAT35s2rAAGACGTGGTTGGAACGTCTTC(基因组全序列见附录一)
表1.PCR反应体系
PCR条件的选择依据本公司以往的经验，PCR条件的选择如下93℃3min；
40个循环(60℃末收集荧光)。
在同样的模板量、同样的反应条件下，以35s启动子序列的特异荧光探针信号所获得的Ct值和Rn值为指标(这两者能反映扩增片断的量和质)，比较不同引物对组合的扩增情况；同时再将同一PCR产物进行琼脂糖电泳。选择扩增条带单一者而且Ct值和Rn值高者，做为待选的DNA/PCR检测的引物对。见下
图1图1中，26为35s7240/7370引物对，Ct为28.43，27为35s7201/7345引物对，Ct为24.96，28为35s7240/7306引物对，Ct为23.98，29为35s7190/7282引物对，Ct为32.67，30为35s7201/7305引物对，Ct为28.80，31为35s7190/7365引物对，Ct为26.34，32为35s7248/2R引物对，Ct为23.85。
图1中可以看出有四对引物的扩增线Ct值比较小，其荧光强度Rn也有一定高度，初步选定其做为待用的DNA/PCR检测的引物对。这四条扩增线的引物对分别是35s7248/35s2R、35s7240/35s7306、35s7201/35s7345和35s7190/35s7365，具体见表2表2四对扩增35s启动子的引物扩增效率比较
由图1、表2可见，35s7248/35s2R、35s7240/35s7306、35s7201/35s7345和35s7190/35s7365四对引物均有较好的扩增，其中尤以35s7248/35s2R最好。
最初筛选出能扩增35s启动子的最佳引物对为上游35s7248和下游35s2R；其Ct值为23.85。为考察此区域附近其它的引物位置是否具有同样扩增效果，遂又在此引物对位置(35s7248)的基础上，将上游引物前延10个碱基得到35s7238、后延10个碱基得到35s7258；同理改变下游引物位置(35s2R)得到35s7290、35s7310。经过与前述同样条件做荧光PCR筛选，引物对35s7238/35s7290的Ct值为25.12；引物对35s7258/35s7310的Ct值为25.43。这些结果提示，在初筛最佳引物对的上下游各延伸10个碱基的区域范围内，仍能选好很好的35s启动子的扩增引物。前、后延伸的两个上游引物35s7238ATGCCTCTGCCGACAGTG35s7258CCCAAAGATGGACCCCCAC前、后延伸后的两个下游引物35s7290AACGTCTTCTTTTTCCACG35s7290TTGCTTTGAAGACGTGGTTG用选出的最佳上下游引物对进行PCR反应体系的优化a.引物浓度的优化实验中将引物浓度从0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L递增。对引物不同浓度的配比进行了比较。最佳引物终浓度结果如下
b.镁离子浓度的优化实验中将镁离子浓度从1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增。
从多次重复实验中选定2.5mmol/L MgCl2为试剂盒反应体系镁离子浓度。
c.Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化Taq酶用量(以单位U计)的优化实验结果，选定2U Taq酶作为试剂盒中使用Taq酶量。
d.dNTPs浓度的优化dNTPs浓度的优化实验中选定0.2mmol/L作为试剂盒dNTPs的终浓度。
e.综合以上反应体系优化实验结果，优化后的PCR反应体系见表3。
表3优化后的PCR反应体系
4.发明的效果经过反复筛选，得到35s7248/35s2R、357240/35s7306、35s7201/35s7345和35s7190/35s7365四对最佳引物对。其用途包括用于常规PCR(琼脂糖电泳)、PCR/ELISA检测或荧光PCR检测。将其用于做荧光PCR检测时，以符合国际标准的Fluka大豆标准品0.1％转基因大豆提取的DNA做模板，得到的Ct值在31.0-32.0之间，这是目前不同荧光测定仪器的可靠检测下限；而0.1％的检测灵敏度已经达到了目前国际同类产品的检测标准。
图2中，11为转基因大豆，12为转基因油菜，15为转基因蕃茄，16为转基因土豆。
用35s7240/35s2R引物做荧光PCR检测，具体为20ul反应体系中，加入植物基因组DNA 2ul，进行荧光PCR检测，具体反应条件同前。经检测，上述转基因作物均呈阳性扩增，其Ct值分别为转基因大豆22.36；转基因油菜18.71；转基因番茄28.55；转基因土豆23.81，其检测灵敏度均可达到0.1％；而非转基因的农产品如普通玉米、白玉米等均无扩增信号，提示该引物对具有良好的灵敏度和特异性。实施例2定量检测取符合国际标准的Fluka大豆标准品，基因组DNA提取方法同前，用35s7240/35s2R引物做荧光PCR定量检测，荧光PCR仪采用RocheLight-Cycler。其结果如表4表4用35s7240/35s2R引物做荧光PCR定量检测标准品及样品ct值
从上述数据得到的回归曲线是y＝-0.346x+7.9383；相关性r2＝0.99；再用1.0％和2.0％的标准品当做被测样品，测得的GMO含量分别为0.94％和2.26％，定量偏差为5％-15％(欧盟的GENESCAN公司同类检测定量偏差为≤20％)，提示所用引物的检测效率已达到核酸扩增检测领域里的该项目的国际水平。
图3中1)0.0％转基因大豆标准品2)0.1％转基因大豆标准品3)0.5％转基因大豆标准品4)2.0％转基因大豆标准品M)2000ladder本发明的优点本发明提供的引物对做荧光PCR检测，其检测灵敏度可达0.1％，而非转基因的农产品大豆、玉米等均无扩增信号，说明这些引物具有良好的灵敏度和特异性。该引物对做PCR定量检测时，其定量误差为5-15％，其检测效率可达到核酸扩增领域里该项目的国际水平。附录一35S基因全序列35S PROMOTER880bpCCCCAGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCCACAGATGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTACCCGAGCAATAATCTCCAGGAAATCAAATACCTTCCCAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTAACTGCATCAAGAACACAGAGAAAGATATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTATTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTCACAAACCAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCCACTGAATCAAAGGCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTG GA35s719035s7201AAGGCCATCGTTGAAG GGACCCCCACCCACGAGGAGCATC35s724035s7248GTGGAAAAA AGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTA35s2r35s7306r35s7345RAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTG35s7365rGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAGGATCCATAGATCTGATAACAAAGATGAG
序列表<110>深圳市匹基生物工程股份有限公司国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所<120>含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列<130><160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gcctctgccg acagtggt18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2ttgaagacgt ggttggaac 19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3tgccatcatt gcgataaag 19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>4cccttacgtc agtggagat 19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5gctcctacaa atgccatca 19<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gatagtggga ttgtgcgtca 20<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>7cgacagtggt cccaaagat 19<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>8aagacgtggt tggaacgtct tc 2权利要求
1.一种含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物35s7248，其序列为CGACAGTGGTCCCAAAGAT和下游引物35s2R，其序列为AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC组成的引物对，在该引物对的上游引物位置前延10个碱基得到35s7238，后延10个碱基得到35s7258，而引物对的下游引物位置前延10个碱基得到35s7290，后延10个碱基得到35s7310，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内，得到的引物序列。
2.根据权利要求1所述的含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列，其特征在于所述的引物序列上游引物序列为CGACAGTGGTCCCAAAGGAT，下游引物序列为AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC。
3.一种含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列，其特征在于所述引物序列包括由上游引物35s7201其序列为TGCCATCATTGCGATAAAG和下游引物35s7345R其序列为CCCTTACGTCAGTGGAGAT组成的引物对，在该引物对的上游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，而引物对的下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内，得到的引物序列。
4.根据权利要求3所述的含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列，其特征在于所述引物序列上游引物序列为TGCCATCATTGCGATAAAG，下游引物序列为CCCTTACGTCAGTGGAGA。
5.一种含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列，其特征在于所述引物序列包括由上游引物35s7190其序列为GCTCCTACAAATGCCATCA下游引物35s7165序列为GATAGTGGGATTGTGCGTCA组成的引物对，在该引物对的上游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，而引物对的下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内，得到的引物序列。
6.一种含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因作物核酸扩增引物序列，其特征在于所述的引物序列上游引物序列GCTCCTACAAATGCCATCA，下游引物序列为GATAGTGGGATTGTGCGTCA3。
7一种含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列，其特征在于所述引物序列包括由上游引物35s7240其序列为GCCTCTGCCGACAGTGGT和下游引物35s7306R其序列为TTGAAGACGTGGTTGGAAC组成的引物对，在该引物对的上游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，而引物对的下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内，得到的引物序列。
8.一种含有花椰菜花叶病毒35S启动子转基因作物核酸扩增引物序列，其特征在于所述的引物序列上游引物序列为GCCTCTGCCGACAGTGGT AT，下游引物序列为TTGAAGACGTGGTTGGAAC。
全文摘要
本发明提供了含有花椰菜花叶病毒35s启动子转基因作物核酸扩增用引物序列，它们包含在四对最优引物序列延伸区域范围内，所述的每对引物序列延伸区域范围是由上游引物和下游引物组成的引物对，在该引物对的上游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，而引物对的下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内，得到的引物序列。本发明提供了最优引物对做荧光PCR检测的结果，其检测灵敏度可达0.1％，而非转基因的农产品大豆、玉米等均无扩增信号，说明这些引物具有良好的灵敏度和特异性。该引物对做PCR定量检测时，其定量误差为5－15％，其检测效率可达到核酸扩增领域里该项目的国际水平。
文档编号C12Q1/68GK1470645SQ0212563
公开日2004年1月28日 申请日期2002年7月26日 优先权日2002年7月26日
发明者朱文斯, 黄茜华, 朱水芳 申请人:深圳市匹基生物工程股份有限公司, 国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所