专利名称：一种版纳链霉菌株以及利用该菌株发酵制备的手霉素及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及链霉菌属的新菌株以及该菌株发酵制备的产物和该产物的用途。
链霉菌可以培养发酵制备出多种抗生素。通过链霉菌(Streptomycesparvulus)发酵培养制备手霉素的方法是已知的(见文献The Journal of antibiofics1987 Vol 40 No.P1541-48)。
手霉素是1987年由Axel，Zeevk等发现的具有抗真菌活性的化合物。1993年Hara M等发现手霉素具有抑制Ras法尼基转移酶的作用。Ras基因被认为是人类癌细胞中的主要原癌基因，Ras主要是通过癌蛋白在质膜的锚定而起作用，在此过程中Ras法尼基转移酶起着至关重要的作用，因此通过抑制该酶的活性来抑制人类癌基因的Ras活性，从而达到治疗癌症的作用。最近研究结果表明手霉素具抑制IL-1β转化酶(ICE)活性，在抑制细胞凋亡过程中起重要作用，ICE成为研制治疗增殖性疾病的重要药物靶点。
本发明的目的就是要提供一种版纳链霉菌的新菌株，同时提供一种利用该菌株发酵制备的手霉素，以及该手霉素的用途。
本发明的目的是这样实现的提供的版纳链霉菌新菌株为版纳链霉菌(Streptomyces bannaensis)N98-1272菌株，CGMCC No0762。
该菌株已于2002年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No0762。
该菌株通过以下方法分离得到将98年从云南省西双版纳的森林土壤中采集的土样置于室温下自然风干一周后研成粉末状，在电热干燥箱中120℃干热20分钟，取干热土样1克，用水稀释到100毫升，混匀，分别取0.2ml均匀涂布于两种选择性培养基(228号Bennett，sagar和Composition of HV agar)的双碟表面，28℃培养2-3周，挑取单菌落，接斜面保存。
版纳链霉菌N98-1272菌株具有以下微生物学特性形态特征版纳链霉菌N98-1272菌株平板单菌落的直径约为2厘米，圆型，红色，边缘整齐，中间整齐，有3-6条纹线。斜面培养168小时后，颜色为暗灰色，菌丝生长致密，有孢子，背后有红色水溶性色素，孢子链较长，成不规则螺旋。
培养学特征版纳链霉菌N98-1272菌株在六种培养基上于28℃培养14天，在无机盐淀粉琼脂培养基上不生长，在其他五种培养基上生长良好，生长特征见表1。
表1版纳链霉菌N98-1272的培养特征
生理生化特性版纳链霉菌N98-1272菌株抗微生物活性均为阴性，其他生理生化特性见表2。
表2版纳链霉菌N98-1272菌株生理生化特性
版纳链霉菌N98-1272菌株的16S rDNA序列分析版纳链霉菌N98-1272菌株的16S rDNA核苷酸全序列长度为1499bp。将其与GenBanK数据库中其他放线菌菌株的16S rDNA相应序列进行比较，以Streptosporangium reoseum为外群(outgroun)，用GenBan软件进行系统化分析。从版纳链霉菌菌株N98-1272与从GenBanK数据库中相关联菌株共同构建的进化树可以看出，版纳链霉菌N98-1272菌株形成一个明显的单独分枝，而且该菌株与其它典型菌株之间序列差异率达2％以上(即序列同源性不到98％)。版纳链霉菌N98-1272菌株的16S rDNA的核苷酸全序列见附
图1。
另外从培养特征和生理生化特性方面来看，版纳链霉菌N98-1272菌株与链霉菌属的其他种有较大差别。根据现代微生物的分类标准确定该菌株为链霉菌属的一个新菌株，并将其命名为版纳链霉菌(Streptomyces bannaensis sp.nov)N98-1272菌株。
利用版纳链霉菌N98-1272菌株可以发酵制备的一种手霉素，它含有以下三种结构形式的手霉素 R＝ 手霉素AR＝ 手霉素BR＝ 手霉素C利用版纳链霉菌N98-1272菌株发酵制备手霉素的方法是包括在含有碳源、氮源、无机盐和其它营养物的培养基中培养版纳链霉菌的步骤和从菌丝体中提取手霉素的步骤，可以由链霉菌属放线菌版纳链霉菌发酵培养。
在本发明的版纳链霉菌N98-1272菌株发酵培养中所使用的碳源可包括但不限于淀粉、葡萄糖。在本发明的发酵培养中所使用的氮源可包括但不限于酵母粉、脱脂豆粉。在本发明的发酵培养中所使用的无机盐可包括但不限于磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸亚铁和氯化钴等。
本发明的发酵培养可在26-28℃和PH6.0-7.0下，在需氧条件下进行8-9天。
由本发明菌株产生的手霉素主要存在于菌丝体中。通过离心，收集菌体，使用有机溶剂如丙酮或甲醇或乙醇浸泡，蒸去有机溶剂，残渣用有机溶剂如乙酸乙酯抽提，使用硅胶柱层析法，优选使用氯仿-甲醇(100∶0-0∶100)的混合溶剂分离，用高效液相色谱法，优选甲醇-水(85-90％)与磷酸(0.1-0.3％)分离手霉素A、B、C组分，洗脱液流速为0.8ml/min，检测波长为210nm，根据手霉素A、B、C的保留时间的不同得到手霉素A、B、C单组分。手霉素A、B、C的保留时间分别为10.25min，15.84min和25.68min。
手霉素A、B、C的特征如下1.手霉素A、B、C的分子式和分子量见表3表3手霉素A、B、C的分子式和分子量
版纳链霉菌N98-1272发酵制备的手霉素可以在用于制备治疗阿尔茨海默氏病药物中得到应用。它与药用辅料可制备成各种用于治疗阿尔茨海默氏病的药物制剂。其成人用量为20-150mg/日。
用本发明版纳链霉菌N98-1272发酵制备的手霉素(以下简称手霉素)具有抑制乙酰胆碱酯酶(AchE)的作用，故可用于在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中应用。其药物活性通过以下试验得到证实。
手霉素对乙酰胆碱酯酶(AchE)的抑制活性试验材料1、反应底物丁酰硫代胆碱2、显色剂二硫硝基苯甲酸药物及配制实验样品分别取手霉素A、B和C适量，用50％乙醇溶解，使成0.8mg/ml溶液。
对照品取他克林适量，用50％乙醇溶解，使其成为0.8mg/ml溶液。
实验方法(1)测定原理以丁酰硫代胆碱为底物，二硫硝基苯甲酸为显色剂，丁酰硫代胆碱在乙酰胆碱酯酶(AchE)的作用下，丁酰硫代胆碱可被水解为丁酸和巯基胆碱，巯基胆碱与显色剂二硫硝基苯甲酸反应生成2-硝基-5-巯基苯甲酸，2-硝基-5-巯基苯甲酸在410nm处具有特征吸收，以此间接测定乙酰胆碱脂酶(AchE)的活性。
(2)乙酰胆碱酯酶的酶反应曲线绘制乙酰胆碱酯酶储备液配制取乙酰胆碱酯酶0.1mg(369U)溶于150ml的0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.7)中，加甘油150m1，白蛋白30mg，混匀，终浓度为1230U/L，于-20℃冰箱内保存。
乙酰胆碱酯酶稀释液配制取乙酰胆碱酯酶储备液1ml，用磷酸盐缓冲液(PH＝7.7)稀释到10ml，使成123U/L。
依次取0ul、25ul、50ul、75ul、100ul和125ul的乙酰胆碱酯酶稀释液于96孔板中，依次加入磷酸盐缓冲液(PH7.7)125ul、100ul、75ul、50ul、25ul和0ul，30℃保温15分钟，再加入丁酰硫代胆碱液使终浓度为6mmol/L和0.25mmol/L的二硫硝基苯甲酸75ul后，30℃保温2小时后，在410nm测定吸收度A，以酶含量为横坐标，A值为纵坐标绘图，得到乙酰胆碱酯酶的酶反应曲线(见图2)。当乙酰胆碱酯酶的浓度在0-61.5U/L范围内，与反应物吸光度之间可呈现出良好的线性关系，其相关系数r＝0.9997。
手霉素对乙酰胆碱酯酶抑制活性测定方法样品孔中加入手霉素样品25ul，乙酰胆碱酯酶稀释液75ul；对照孔加入50％乙醇25ul，乙酰胆碱酯酶稀释液75ul；空白孔加入50％乙醇25ul，磷酸盐缓冲液(pH7.7)75ul；用酶联免疫检测仪在410nm测定每孔吸收度为A本底，30℃保温15分钟后，向每孔中分别加入底物和显色剂，使在每孔中的终浓度分别达到6mmol/L和0.25mmol/L，30℃保温2小时，用酶联免疫检测仪在410nm测定每孔吸收度为A，样品孔、对照孔、空白孔的吸收度分别为A样品、A对照、A空白，样品对乙酰胆碱酯酶抑制率计算公式如下 手霉素对乙酰胆碱酯酶的IC50测定对照品他克林(Sigma公司，货号A3773)为乙酰胆碱酯酶抑制剂，以此为对照测定手霉素对乙酰胆碱酯酶的IC50值。
实验样品分别取手霉素A、B和C适量，用50％乙醇溶解，使成0.8mg/ml溶液。然后再逐级稀释成0.24mg/ml、0.08mg/ml、0.024mg/ml、0.008mg/ml、0.0024mg/ml的样品溶液。
对照品称取他克林适量，用50％乙醇溶解，使其成为0.8mg/ml溶液。然后再逐级稀释成0.24mg/ml、0.08mg/ml、0.024mg/ml、0.008mg/ml、0.0024mg/ml的对照品溶液。
测定方法同手霉素对乙酰胆碱酯酶抑制活性测定方法。
结果表明手霉素A、B和C对乙酰胆碱酯酶抑制活性与手霉素A、B和C的浓度成线性关系(见表4)。
表4手霉素A、B、C和他克林对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
手霉素A IC50＝6.88∫g/ml(12.5μmol/L)手霉素B IC50＝7.65∫g/ml(15μmol/L)手霉素C IC50＝6.16∫g/ml(11.5μmol/L)他克林IC50＝2.6∫g/ml(13μmol/L)本发明用于制备制备治疗阿尔茨海默氏病药物具有毒副作用小的优点。
试验表明手霉素A和他克林对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性抑制的倍数分别为2.48倍和0.0092倍(以摩尔浓度计)。
丁酰胆碱酯酶和胆碱能传递没有直接关系，主要分布在血浆、肝脏及肠粘膜上参与体内生理活动，当乙酰胆碱酯酶抑制剂对丁酰胆碱酯酶活性抑制较强时，可破坏丁酰胆碱酯酶的生理功能，而引起其功能紊乱，产生毒副反应。
其实验方法如下手霉素对丁酰胆碱酯酶的IC50测定其中丁酰胆碱酯酶的配制方法为，取丁酰胆碱脂酶0.3mg溶于200ml 0.02mol/L的磷酸缓冲液(PH7.7)中，加入200ml甘油与30mg白蛋白，混匀，于-20℃冰箱内保存，用前稀释10倍。
实验样品、对照品及测定方法同手霉素A、B、C对乙酰胆碱酯酶的IC50测定。实验结果见表5。
表5手霉素和他克林对丁酰胆碱酯酶活性的抑制作用
手霉素A IC50＝17.05μg/ml(31umol/L)他克林IC50＝0.024μg/ml(0.12umol/L)手霉素抑制胆碱酯酶的活性位点测定取手霉素22mg溶于5ml甲醇中，加入6.1mg硼氢化钠，反应15分钟后，向反应液中加水150ml，用0.5mol/L草酸调pH至3.0，用氯仿进行分次抽提，合并提取液，蒸去氯仿后得到氢化手霉素粗品，用制备高效液相色谱仪进一步纯化，用75％甲醇-水与0.1％磷酸混合液进行洗脱，得到开环的氢化手霉素。氢化手霉素结构式如下
用手霉素对乙酰胆碱酯酶活性抑制作用的测定方法测定手霉素和氢化手霉素对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。在药物浓度为1mg/ml时，氢化手霉素未显示对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，而手霉素的抑制率高达97.5％，手霉素抑制胆碱酯酶的活性位点为其结构中的环氧乙烷环。
本发明为公众提供了一种新菌株，该新菌株可以用于制备手霉素，同时还可在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中得到应用，其毒副作用也较小。
图1是版纳链霉菌N98-1272菌株的16SrDNA核苷酸全序列图。
图2是乙酰胆碱酯酶反应曲线图。
实施例1版纳链霉菌N98-1272菌株的分离。
将98年从云南省西双版纳的森林土壤中采集的土样置于室温下自然风干一周后研成粉末状，在电热干燥箱中120℃干热20分钟，取干热土样1克，用水稀释到100毫升，混匀，分别取0.2ml均匀涂布于两种选择性培养基(228号Bennett，s agar和Composition of HV agar)的双碟表面，28℃培养2-3周，挑取单菌落，接斜面保存。
实施例2版纳链霉菌N98-1272菌株发酵培养制备手霉素。
培养基为1号斜面培养基葡萄糖4％、酵母粉4％、麦芽膏5％、琼脂粉20％、复合维生素B 0.035％、微量元素0.001％，PH7.2。
2号种子培养基淀粉24％、葡萄糖1％、蛋白胨3％、酵母粉5％、牛肉膏3％、碳酸钙4％，PH7.0。
3号发酵培养基可溶性淀粉4％、脱脂大豆粉2％、FeSO40.05％、NiCl20.05％、CoCl20.05％、K2HPO40.05％、KCl 0.03％、复合维生素B 0.003％，PH6.5。
用一铂环版纳链霉菌N98-1272给斜面培养基(1号)接种。在28℃下培养7天。将所得斜面培养物接种于750ml的三角瓶内的140ml种子培养基(2号)中，该培养基预先已调节到PH7.0并在121℃下灭菌30分钟。接种后，在旋转式培养机中200转份，28℃下培养2天。发酵培养基(3号)被调节到PH6.5，且在121℃下灭菌30分钟。将上述种子培养物接种到750ml的三角瓶内的140ml的发酵培养基(3号)中，使种子浓度达1％。在旋转式培养机中220转/分，28℃的条件下发酵6天，共得到发酵培养液5000ml。
将版纳链霉菌的发酵培养液5000ml分次用离心机离心15分钟，转速为3000转/分，上清弃掉，收集菌体，用3000ml丙酮分两次浸泡，经过滤，弃掉菌丝体，合并丙酮浸泡液，用旋转浓缩器蒸去丙酮，所得残渣用3000ml乙酸乙酯分二次进行提取，合并乙酸乙酯提取液，加适量无水硫酸钠脱水，至乙酸乙酯层澄清，将澄清的乙酸乙酯用旋转浓缩器蒸干，得到褐色物。取褐色物1克，用适量甲醇溶解，用φ2.5×25cm的硅胶柱层析，依次用氯仿150ml、氯仿∶甲醇(100∶1)300ml、氯仿∶甲醇(100∶2)150ml、氯仿∶甲醇(10∶1)150ml、甲醇150ml进行分布洗脱，流速为3ml/min。收集洗脱液10ml/管，用手霉素对乙酰胆碱脂酶抑制活性测定方法测定洗脱液活性，合并有活性洗脱液，蒸去溶媒，得手霉素混合物。
实施例3分离手霉素A、B、C单组分。
取实施例2中的手霉素混合物150mg，用适量甲醇溶解，使成50mg/ml溶液，用制备高效液相色谱仪分离，流动相为90％甲醇-水，0.1％磷酸，流速为6ml/min，用紫外检测器，按手霉素A、B、C的保留时间10.25min，15.84mm和25.68min收集活性组分，蒸去甲醇，用乙酸乙酯抽提，抽提液用无水硫酸钠脱水后，蒸去乙酸乙酯，得手霉素A、B、C单组分。
实施例4用实施例2制备的手霉素混合物与药用辅料制备成各种用于治疗阿尔茨海默氏病的药物制剂。
实施例5用实施例2制备的手霉素粉25克，加labrafil M 1944 Cs 300克、无水乙醇120克溶解后，橄榄油加至1000ml，制备成用于治疗阿尔茨海默氏病的药用口服制剂，分装为5ml/支。
实施例6用实施例3制备的用手霉素C粉25克，聚氧乙烯蓖麻油EL35 650克，无水乙醇330克，制备成用于治疗阿尔茨海默氏病的药用注射剂，25mg/ml。
权利要求
1.一种版纳链霉菌菌株，其特征在于它为版纳链霉菌(Streptomycesbannaensis)N98-1272菌株，CGMCC No0762。
2.一种利用版纳链霉菌N98-1272菌株发酵制备的手霉素，其特征在于它含有以下三种结构形式的手霉素 R＝ 手霉素AR＝ 手霉素BR＝ 手霉素C
3.版纳链霉菌N98-1272菌株发酵制备的手霉素用于制备治疗阿尔茨海默氏病药物的应用。
4.根据权利要求3所述的版纳链霉菌N98-1272菌株发酵制备的手霉素用于制备治疗阿尔茨海默氏病药物的应用，其特征在于手霉素的活性位点为其结构中的环氧乙烷环。
全文摘要
本发明提供了一种版纳链霉菌(Streptomycesbannaensis)N98－1272菌株的新菌株CGMCC NO0762。同时提供了一种利用版纳链霉菌N98－1272发酵制备的手霉素，该手霉素含有A、B、C三种结构形式。该手霉素可以在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中应用，其毒副作用较小。
文档编号C12N1/20GK1473927SQ0212541
公开日2004年2月11日 申请日期2002年8月6日 优先权日2002年8月6日
发明者吕渭川, 张华 , 董悦生, 姜成林, 郑智慧, 姜怡, 李文均, 路新华, 李韶菁, 任晓, 崔小龙, 林洁, 杨洁 申请人:华北制药集团有限责任公司, 云南省微生物研究所