专利名称：淄曲霉菌云南变种Ym3221的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物，特别涉及到一种能够发酵原植物三七的真菌微生物。
三七作为中国地方民族特色的传统名贵中药材，它与人参有关相似的性质和功效，如滋补、镇静、抗溶血、抗疲劳、抗糖尿病、抗血小板凝集、促进癌细胞转化、抑制癌细胞成长等。例如，原人参二醇型皂甙Rd可以增强免疫功能，抑制癌细胞成长；Rh能够促进癌细胞转化；原人参三醇型皂甙Rg具有抗血小板凝集的作用。可见，上述三类物质是开发治疗人类心脑血管疾病和抗肿瘤的一种重要而珍贵的药物资源，原三七植物含有达玛烷型四环三帖皂甙成分为20个左右，总皂甙含量为12~15％，主要属于原人参二醇(Protopanaxadiol)或原人参三醇(Protopanaxatriol)及其衍生物。如何以三七为基质，通过固体发酵方式，得到治疗人类心脑血管疾病和抗肿瘤的药用成份一直是人们研究重点之一。
本发明的目的旨在提供一种通过微生物发酵途径，以三七中药材为基质，从发酵产物中，获得抗人类心脑血管疾病或抗肿瘤化合物的天然药用成分的真菌微生物——淄曲霉菌云南变种Ym3221。
本发明所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221命名为Aspergillus tamariivar.Yunnanensis n.var chen et al.Ym3221淄曲霉菌云南变种Ym3221，分离自我国西南地区云南省土壤，该菌株已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2002年3月27日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM 202015。
本发明所述的微生物经微生物分类学及分子生物学鉴定，它的分生孢子不仅壁厚、粗糙，而且具有小刺，明显区别于已知淄曲霉菌。
本发明所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221的培养特征如下PDA培养基28℃培养7天，菌落直径5.0cm，13天5.0cm。菌落绒毛状，白色带米糠色粉状颗粒，疏松隆起，边缘整齐。背面白色。
麦芽汁培养基28℃培养7天，菌落直径6.5cm，13天6.5cm。菌落绒毛疏松，白色带米糠色粉状颗粒，中心不规则疏松隆起，边缘整齐，背面乳白色。
察贝克培养基28℃培养7天，菌落直径2.5cm，13天3.0cm。菌落浅乳白色，粉状颗粒，中间疏松隆起，边缘整齐，有白色水珠。背面白色，具放射条纹。
本发明所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221的菌株的形态特征无性世代 菌丝无色有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的足细胞垂直生出，光滑无色；顶囊半球形，顶部2/3密生小梗；小梗双层；分生孢子穗圆筒形，肉桂色；分生孢子球形光滑。孢子直径1.8微米。
有性世代未发现。
本发明所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221已于2002年3月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NOM 202015，分类命名为Aspergillus tamarii var.Yunnanens is n.var chen et al.Ym3221淄曲霉菌云南变种Ym3221，保藏单位地址中国.武汉.大学，邮政编码430072。
本发明涉及一种微生物，该微生物能够以三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)为发酵基质，通过人工纯培养方式，而获得的三七发酵产物，与原三七植物比较，药物成分的种类及含量都发生了系列变化。
本发明所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221系一株能够发酵原植物三七、促使三七总皂甙组分在质量和含量方面都发生变化的高效药用小型丝状真菌微生促使原植物三七皂甙成分发生变化。具体表现为发酵产物的主体皂甙元由nR1、Rg1和Rh(Rh1、Rh2)组成；显著特点之一是发酵产物总皂甙含量总体提高10~15％；原人参二醇型皂甙Rg1组分含量提高60％左右；原人参三醇型皂甙Rh含量提高20~25％。其二是原人参二醇型皂甙nR1含量降低48~52％；原人参二醇型皂甙Rd、Rb1及原人参三醇型皂甙Re等组分消失。可见，该菌株通过人工发酵三七，可作为筛选人类抗心脑血管疾病天然药物成分的一种新型微生物资源。且以三七为基质，通过淄曲霉菌微生物固体发酵方式，既能改变三七皂甙原药用成分的种类，又可以使三七药用成分的含量得到提高。
图1为本发明所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221的菌落图片。
图2为本发明所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221的菌株分生孢子穗显微图。
图3为本发明所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221的菌株显微图。
下面结合附图对本发明作进一步的描述。
取YM3221(淄曲霉菌云南变种Ym3221Aspergillus tamariivar.Yunnanensis n.var.)菌种，在无菌条件下(无菌室或超净工作台)，用接种针挑取少许菌种，转接于已灭菌的固体PDA培养基试管(15×150mm)中，置培养箱内28℃±1℃活化培养96小时。取出活化96小时的菌种，在无菌条件下，以同样方式接入活化好的菌种到已灭菌的一级种子固体PDA培养基中，在28℃±1℃下培养96小时，即为YM31966一级种子。
采用500毫升玻璃三角瓶，装入配制好的液体PDA培养基100毫升，15磅灭菌30分钟备用。取YM3221菌一级种子，在无菌条件下，接种于装有100毫升液体PDA培养基的500毫升玻璃三角瓶中，一级种子接种量为每支斜面接三个三角瓶，置28℃±2℃摇床培养96小时后，作为三七发酵二级种子用。
根据发酵规模大小，发酵料按重量比率，称取50％三七粉(80~100目)，加入50％的新鲜黄豆渣，充分拌匀，发酵料水分不低于65％。三七发酵料配制好后，装入500毫升罐头瓶中，塑料薄膜、牛皮纸封口，置灭菌锅内15磅灭菌60分钟后，取出待冷却至30℃，接入液体二级种子，二级种子接用量为5％(v/w)。摇匀后放置28℃±2℃下，静止发酵12天。在发酵期间，注意发酵室保湿不低80％相对湿度，第2天分别进行摇瓶一次，并注意检查有无染菌现象。
发酵完毕，发酵产物置60℃下烘干，得到三七发酵产物。
本发明是淄曲霉菌云南变种Ym3221(Aspergillus tamarii var.Yunnanensis n.var.)的三七发酵。采用人工固体发酵方法，发酵产物与三七原植物比较，主要药用皂甙成分由nR1、Rg1和Rh(Rh1、Rh2)构成。该菌株发酵三七能够提高总皂甙含量10~15％范围之间；能使原人参二醇型皂甙Rd、Rb1和原人参三醇型皂甙Re组分消失；nR1组分含量降低48~52％；原人参二醇型皂甙Rg1组分含量能够提高60％左右；原人参三醇型皂甙Rh组分含量提高幅度在20~25％范围内。
综上所述，淄曲霉菌云南变种Ym3221(Aspergillus tamarii var.Yunnanensis n.var.)YM3221菌种是发酵转化三七皂甙，筛选抗人类心血管疾病或抗肿瘤药用成分的又一天然微生物药源。
本发明所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221序列及系统进化分析，该菌分子的18SrRNA部分序列为序列表GGTTTGACCAACTTTCCGGCCCTGGGGGGTCGTTGCCAACCCTCCTGGGCCAGTCCGAAGGCCTCACCGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCGGACCTCTCGGTCAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCCTAAGAAGCCAGCGGCCCGCAAACGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGGGTCATCATAGAAACACCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGCCATGAGGTTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCCGAAGTCGAGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAAAGTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATGACTACTGGCAGAATCAACCAGA
权利要求
1.一种淄曲霉菌云南变种Ym3221，其特征在于命名为淄曲霉菌云南变种Ym3221Aspergillus tamarii var.Yunnanensis n.var chen et al.Ym3221，该菌株已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2002年3月27日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM 202015。
2.根据权利要求1所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221，其特征在于所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221的培养特征如下PDA培养基28℃培养7天，菌落直径5.0cm，13天5.0cm。菌落绒毛状，白色带米糠色粉状颗粒，疏松隆起，边缘整齐，背面白色；麦芽汁培养基28℃培养7天，菌落直径6.5cm，13天6.5cm。菌落绒毛疏松，白色带米糠色粉状颗粒，中心不规则疏松隆起，边缘整齐，背面乳白色；察贝克培养基28℃培养7天，菌落直径2.5cm，13天3.0cm。菌落浅乳白色，粉状颗粒，中间疏松隆起，边缘整齐，有白色水珠；背面白色，具放射条纹。
3.根据权利要求1所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221，其特征在于所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221的菌株的形态特征无性世代菌丝无色有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的足细胞垂直生出，光滑无色；顶囊半球形，顶部2/3密生小梗；小梗双层；分生孢子穗圆筒形，肉桂色；分生孢子球形光滑；孢子直径1.8微米。有性世代未发现。
4.根据权利要求1所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221，其特征在于所述的淄曲霉菌云南变种Ym3221的菌分子的18SrRNA部分序列为GGTTTGACCAACTTTCCGGCCCTGGGGGGTCGTTGCCAACCCTCCTGGGCCAGTCCGAAGGCCTCACCGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCTAGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCGGACCTCTCGGTCAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCCTAAGAAGCCAGCGGCCCGCAAACGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGGGTCATCATAGAAACACCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAA TAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGCCATGAGGTTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCCGAAGTCGAGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAAAGTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATGACTACTGGCAGAATCAACCAGA
全文摘要
本发明涉及一种微生物，特别涉及到一种能够发酵原植物三七的真菌微生物。本所述的菌种命名为淄曲霉菌云南变种Ym3221Aspergillus tamariivar.Yunnanensis n.var chen et a1.Ym3221，该菌株已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2002年3月27日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM 202015。本发明所述的菌种是发酵转化三七皂甙，筛选抗人类心血管疾病或抗肿瘤药用成分的又一天然微生物药源。
文档编号C12N15/31GK1467288SQ0212507
公开日2004年1月14日 申请日期2002年7月9日 优先权日2002年7月9日
发明者陈有为, 李治滢, 杨丽源, 李绍兰, 周斌, 张琦 申请人:云南省微生物研究所