专利名称：含有pat基因转基因作物核酸扩增用引物序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有Pat基因转基因作物核酸扩增用引物序列国内外所有的检测方法并没有完全解决转基因产品的检测问题，新的检测方法在不断出现，并在继续完善之中。首先，目前国内外常用的几套筛选引物，不能完全检测出目前已商品化的转基因品种；传统的的PCR技术较难控制污染的产生；另外，质量不过关的检测试剂，经常影响检测结果的判断和检测出证工作。
到目前为止，最有发展前途的检测技术为实时荧光PCR技术。实时荧光PCR技术具有很多优点使用了杂交探针，提高了检测的准确性；荧光检测的高灵敏度；不用对PCR产物后期处理，较好地降低了检测过程中的污染；边扩增边检测，提高了检测速度；可以使用国际标准品对检测样品进行定量。这个技术的核心环节是首先要获得能高效、特异并灵敏地扩增目的片断DNA的引物。
据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001年全世界转基因作物种植面积为5260万公顷，十多个国家已种植转基因作物，其中99％的转基因作物种植在美国、阿根廷、加拿大和中国，已批准商品化转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。
对转基因产品的安全性，特别是转基因食品对人和动物的健康及对生态环境的影响，自转基因技术出现以来，就一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点问题，2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定，其中最重要的措施之一就是对转基因产品要进行检验，以明确其种类，确定是否为已批准的或已获得许可的转基因产品，以防止一些具有风险的转基因产品任意扩散，造成不可挽回的损失。2001年欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超过1％的转基因产品(阈值)则不用标识，这样转基因产品检测不但需要定性，还需要定量检测。不同国家阈值大小不一样，从1-5％不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，并于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法。目前全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律法规。总之，转基因产品的研究、生产、销售都要在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点进行。
事实上，最近几年已先后发现转基因产品研究、生产及进出口过程中出现安全及监管事故，存在各种各样的转基因产品扩散、污染及安全隐患，加大对转基因产品的检测监管是非常必要的。
2002年欧盟执行新的转基因产品管理法规，要求对转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程的“跟踪”、检测，以保证转基因产品不污染非转基因产品。美国提出了品种“个性保存”方案，所不同的是要求对非转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程的“跟踪”检测，以确保非转基因产品不被转基因产品污染(事实上完全不被污染是不可能的，但要控制在一定的许可范围之内)。许多国家对进口非转基因食品，要求出口商提供经检测合格的非转基因产品证明。
综上所述，转基因食品从研究、生产、贮存、运输、销售、进出口等环节都需要检验监控，不但要求检测出是否含有转基因，而且要检测出转基因产品的含量。
对转基因产品的检测，主要想解决如下几个方面的问题是否为转基因产品；如果含有转基因产品、又是某国已批准商品化的转基因产品，则要检测出转基因产品的含量是否达到允许值；如果是尚未批准的转基因产品，原则上不允许进口或销售。所有这些都离不开确实可靠的GMO检测方法。
一个好的6MO检测方法首先要有较广泛的GMO针对性。不同的转基因作物的获得性状多种多样，BAR基因(或其人工改建序列)作为一种抗除草剂基因，不仅可以作为目的基因转入作物，而且可以作为转基因过程中的筛选基因，是一种常见的插入序列，在转基因作物中普遍存在。因此，BAR基因成为CMO检测的一个重要的DNA序列。
本发明的目的就是要提供针对Pat(筛选)基因序列的特异性好、灵敏度高的扩增引物，用于转基因作物的PCR的检测。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案一种含有Pat基因转基因作物核酸扩增用引物序列，所述的引物序列包括由上游引物PaT1u序列为GTCGACATGTCTCCGGAGAG和下游引物PaT173r，序列为GCAACCAACCAACCAAGGGTATC组成的引物对，在该引物对的上游引物位置后延10碱基得到Pat20，而下游引物位置前延10个碱基得到Pat163，后延10个碱基得到Bar183，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内得到的引物序列。
一种含有Bar基因转基因作物核酸扩增用引物序列，所述的引物序列包括由上游引物Patn33u，序列为CAGTTGAGATTAGGCCAGCTACA和下游引物Patn150r序列为AACCTCTCTAGATCTCAATCCA组成的引物对，在该引物对的上游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，而下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，在上述引物对的上、下游所延伸位置的区域范围内得到的引物序列。
引物序列有PAT 1uGTCGACATGTCTCCGGAGAGPAT 173rGCAACCAACCAAGGGTATCPatn33uCAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAPatn 150rAACCTCTCTAGATCATCAATCCA(Pat基因全序列见附录一)
具体实施例方式
图1，利用荧光PCR筛选引物荧光变化图谱图2 Pat1u/Pat173r(627U/816R)扩增转基因油菜籽DNA电泳图引物设计对GMO中选用的多种Pat基因序列(包括Pat基因的天然序列以及人工改建序列)进行比较，选择其中缺乏二级结构且保守的基因区设计多对引物。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。根据上述原则设计出的引物如下上游PAT1u，PAT14，PAT43，PAT161，PAT173，PAT189，PAT202，PAT353，PAT358，PAT413，Patn33u下游PAT173r，PAT216，PAT239，PAT243，PAT277，PAT461，PAT463，PAT510，PAT512最优引物序列如下PAT 1uGTCGACATGTCTCCGGAGAGPAT 173rGCAACCAACCAAGGGTATCPatn33uCAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAPatn 150rAACCTCTCTAGATCATCAATCCA反应体系的建立及优化反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得用已确证的转入该基因的转基因油菜籽为材料，以Promega Purification kit提取基因组核酸，再分别用上述检测序列区域中的最长的扩增片段的引物进行PCR扩增。扩增产物用1×TE进行10倍梯度稀释，选取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共5个稀释度为系列阳性模板，并取其中Ct值27至29之间者作为以后反应体系优化时的模板。
引物的筛选引物筛选实验中将上述上游引物和下游引物任意配对进行实验。
根据本公司既往经验，引物筛选结合特异的探针，采用荧光PCR，并辅以琼脂糖电泳，荧光PCR仪采用Roche Light-Cycler。所采用的PCR反应体系如表1所示。
表1.PCR反应体系
PCR条件的选择依据本公司以往的经验，PCR条件的选择如下93℃3min；
40个循环(60℃末收集荧光)。
在同样的模板量、同样的反应条件下，以Pat基因序列的特异荧光探针信号所获得的Ct值和Rn值为指标(这两者能反映扩增片断的量和质)，比较不同引物对组合的扩增情况；同时再将同一PCR产物进行琼脂糖电泳。选择扩增条带单一者而且Ct值和Rn值高者，做为待选的DNA/PCR检测的引物对。见图1图1中，2为Pat14u/173r引物对，Ct为27.20，5为Pat14u/216r引物对，Ct32.79，6为Pat14u/239r引物对，Ct为27.79，10为Pat111u/173r引物对，Ct为26.85，15为Pat43u/173r引物对，Ct为32.95，29为Pat43u/216r引物对，Ct29.94，31为Pat430/239r引物对，Ct为34.39。
从图1中可以看出pat1u/173r这对引物的扩增线Ct值比较小(26.85)，其荧光强度Rn也有一定高度，初步选定其做为待用的DNA/PCR检测的引物对。
最初筛选出能扩增Pat基因的最佳引物对为上游Pat1和下游Pat173；其Ct值为26.85。为考察此区域附近其它的引物位置是否具有同样扩增效果，遂又在此引物对位置(Pat1)的基础之上，将上游引物前延10个碱基得到Pat20；同理改变下游引物位置(Pat173)得到Pat163、Pat183。经过与前述同样条件做荧光PCR的筛选，引物对Pat20/Pat163的Ct值为27.48；引物对Pat20/Pat183的Ct值为27.69。这些结果提示，在初筛最佳引物对的上下游各延伸10个碱基的区域范围内，仍能选到很好的bar基因的扩增引物。
后延伸后的两个上游引物Pat20CTCCGGAGAGGAGACCAGTTT前、后延伸后的两个下游引物Pat163CAAGGGTATCTATCTTGCAAPat183CTCAACCTCAGCAACCAA用选出的最佳上下游引物对进行PCR反应体系的优化a.引物浓度的优化实验中将引物浓度从0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L递增。对引物不同浓度的配比进行了比较。最佳引物终浓度结果如下
b.镁离子浓度的优化实验中将镁离子浓度从1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增。
从多次重复实验中选定2.5mmol/L MgCl2为试剂盒反应体系镁离子浓度。
c.Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化Taq酶用量(以单位U计)的优化实验结果，选定2U Taq酶作为试剂盒中使用Taq酶量。
d.dNTPs浓度的优化dNTPs浓度的优化实验中选定0.2mmol/L作为试剂盒dNTPs的终浓度。
e.综合以上反应体系优化实验结果，优化后的PCR反应体系见表2。
表2优化后的PCR反应体系
4.发明的效果经过反复筛选，得到pat1u/173r这对最佳引物对。其用途包括用于常规PCR(琼脂糖电泳)、PCR/ELISA检测或荧光PCR检测。将其用于做荧光PCR检测时，以0.1％转基因油菜籽提取的DNA做模板，得到的Ct值在31.0-32.0之间，这是目前不同荧光测定仪器的可靠检测下限；而0.1％的检测灵敏度已经达到了目前国际同类产品的检测标准。
实施例1定性检测选取转基因及非转基因的农产品如大豆、玉米、油菜、番茄、土豆，以Promega磁珠法提取基因组DNA，具体为称重l00mg植物材料，置于2ml离心管中；加入500ul Lysis Buffer A和5ul RNase A，与材料混匀；加入250ulLysis Buffer B，混匀，室温放置10分钟；加入750ul沉淀缓冲液，混匀后高速离心(13000×g)10分钟；吸取上清于干净的2ml离心管中，加入50u1磁粉液，混匀；混合液中加入0.8体积异丙醇，混匀，室温放置5分钟；将离心管置于磁架上1分钟，去澄清液；取出离心管，再加入250ul Lysis Buffer B，混匀后置于磁架上1分钟，去澄清液；用1ml 70％乙醇清洗磁粉，置于磁架上1分钟，去澄清液；步骤重复2次；取出离心管，于65℃干浴锅中干燥5分钟或室温下干燥15-30分钟；离心管中加入100ul去离子水，混匀后于65℃干浴锅中孵育5分钟，再移至磁架上1分钟，吸取澄清液于0.5ml干净离心管中，做为DNA模板备用。
用Pat1u/Pat173r引物做荧光PCR检测，具体为20ul反应体系中，含植物基因组DNA 2ul，进行荧光PCR检测，具体反应条件同前。经检测，上述转基因作物如含有Pat基因(如GMO canola)均呈阳性扩增，其检测灵敏度均可达到0.1％；而非转基因的农产品或不含Pat基因的转基因农产品则无扩增信号，提示该引物对具有良好的灵敏度和特异性。
实施例2电泳检测取符合国际标准的转基因油菜籽标准品为材料，基因组DNA提取方法同前，用Pat1u/Pat173r引物引物进行PCR扩增，PCR扩增条件如下93℃3min 1个循环93℃15 sec；60℃30 sec；72.℃ 1min 40个循环取上述扩增产物，采用1％琼脂糖，2V/CM电泳一小时，EB工作液浸泡15min，紫外灯下观察结果可见阳性标本均可见一条清晰的扩增带，而阴性样品无任何扩增带，具体见图2。
图2中，1)0.0％转基因油菜籽 2)0.1％转基因油菜籽3)0.5％转基因油菜籽 4)2.0％转基因油菜籽M)2000 ladder本发明的优点 本发明提供的Pat1u/Pat173r引物做荧光PCR检测，其检测灵敏度可达0.1％，而不含Pat1u/Pat173r的转基因农产品或非转基因的农产品大豆、玉米等均无扩增信号，说明这些引物具有良好的灵敏度和特异性。其检测效率可达到核酸扩增领域里该项目的国际水平。附录一Pat基因全序列PATGTCGACATGTCTCCGGAGAGGAGACCAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAGCAGCTGATATGGCCGCGGTTPAT 1u Patn33uTGTGATATCGTTAACCATTACATTGAGACGTCTACAGTGAACTTTAGGACAGAGCCACAAACACCACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGTTGCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTTPatn 150rPAT 173rGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGGGCCCTGGAAGGCTAGGAACGCTTACGATTGGACAGTTGAGAGTACTGTTTACGTGTCACATAGGCATCAAAGGTTGGGCCTAGGATCCACATTGTACACACATTTGCTTAAGTCTATGGAGGCGCAAGGTTTTAAGTCTGTGGTTGCTGTTATAGGCCTTCCAAACGATCCATCTGTTAGGTTGCATGAGGCTTTGGGATACACAGCCCGGGGTACATTGCGCGCAGCTGGATACAAGCATGGTGGATGGCATGATGTTGGTTTTTGGCAAAGGGATTTTGAGTTGCCAGCTCCTCCAAGGCCAGTTAGGCCAGTTACCCAGATCTGA
序列表<110>深圳市匹基生物工程股份有限公司国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所<120>含有Pat基因转基因作物核酸扩增用引物序列<130><160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1gtcgacatgt ctccggagag 20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>2gcaaccaacc aagggtatc 19<210>3<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>3cagttgagat taggccagct aca 23<210>4<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>4aacctctcta gatcatcaat cca 2权利要求
1.一种含有Pat基因转基因作物核酸扩增用引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物PaT 1u序列为GTCGACATGTCTCCGGAGAG和下游引物PaT173r，序列为GCAACCAACCAACCAAGGGTATC组成的引物对，在该引物对的上游引物位置后延10碱基得到Pat20，而下游引物位置前延10个碱基得到Pat163，后延10个碱基得到Bar183，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内得到的引物序列。
2.根据权利要求1所述的一种含有Pat基因转基因作物核酸扩增用引物序列，其特征在于所述的引物序列为上游引物序列为GTCGACATGTCTCCGGAGAG，下游引物序列为GCAACCAACCAACCAAGGGTATC。
3.一种含有Bar基因转基因作物核酸扩增用引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物Patn33u，序列为CAGTTGAGATTAGGCCAGCTACA和下游引物Patn150r序列为AACCTCTCTAGATCTCAATCCA组成的引物对，在该引物对的上游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，而下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，在上述引物对的上、下游所延伸位置的区域范围内得到的引物序列。
4.根据权利要求3所述的一种含用Pat基因转基因作物核酸扩增用引物序列，其特征在于所述的引物序列为上述引物序列为CAGTTGAGATTAGGCCAGCTACA，下游引物序列为AACCTCTCATAGATCTCAATCCA。
全文摘要
本发明提供了含有Pat基因转基因作物核酸扩增用引物序列，这些序列分布在两对最优引物的延伸区域范围内。其中一对最优引物，它由上游引物PaTlu和下游引物PaT173r组成的引物对，在该引物对的上游引物位置后延10个碱基，而引物对的下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，在上述引物对的上游延伸位置的区域范围内得到的引物序列；由Patn33u和Patn150组成的引物对，其延伸区域范围为上游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基。而下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基的延伸区域范围内得到的引物序列。对于上述区域范围内最优引物对作荧光PCR检测，其检测灵敏度可达0.1％，而不含Pat基因的转基因农产品成非转基因的农产品大豆、玉米等均无扩增信号，说明这些引物具有良好的灵敏度和特异性，其检测效率可达到核酸扩增领域里该项目的国际水平。
文档编号C12Q1/68GK1470643SQ0212563
公开日2004年1月28日 申请日期2002年7月26日 优先权日2002年7月26日
发明者朱文斯, 黄茜华, 朱水芳 申请人:深圳市匹基生物工程股份有限公司, 国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所