专利名称：一种基于结构开关型适配体的高灵敏无标记荧光检测方法
技术领域：
本发明涉及生物分析检测技术领域，更具体地涉及一种基于结构开关型适配体、SYBR Gold和Exo I的无标记荧光检测法及其应用。
背景技术：
核酸适配体是具有特定二级结构的单链DNA或RNA，可以通过体外筛选获得，其靶标的种类很多，比如小分子，大分子如蛋白质、或细胞表面等，广泛应用于诊断，分子识别，靶向治疗，基因转录及药物释放等领域。适配体中有一类被称为结构开关型适配体，这类适配体与其靶标相互作用时会发生显著的构相变化。近年来，出现了很 多基于结构开关型适配体的检测方法，常用检测法有荧光检测法，颜色检测法，电化学检测法。在这些方法中，荧光检测法一直很受欢迎，因为荧光法灵敏度高、操作简单并且适合做高通量检测。然而，现有的很多方法都需要对适配体进行荧光基团(猝灭基团)标记，或使用修饰的碱基，这些操作不但昂贵而且费时，增加了检测的成本。而且，在适配体上标记不同的荧光基团或猝灭基团可能会影响靶标与适配体的结合。为摒弃标记型适配体法的诸多缺点，研究无标记荧光法显得尤为重要。最近报道了许多利用共轭聚合物(Ho，
H.A. ；Leclerc, M.，J. Am. Chem. Soc. 2004，126，1384-1387 ;Lee，J. ;Kim，H. J. ;Kim，J.，J. Am. Chem.Soc. 2008，130，5010-5011.)、DNA 结构选择性荧光染料(Li，T. ；Wang E. K.；Dong, S. J.，Anal. Chem. 2010，82，7576-7580 ；Huang, C. ；Chang, H.，Chem. Commun. 2008，1461-1463.)来度量靶标介导的适配体构象变化的无标记荧光法。这些方法一般都操作简单、灵敏度高、选择性好。应用阳离子共轭聚合物的荧光原理是聚合物包裹折叠的适配体，从而引起聚合物的构象变化。也就是说聚合物的构象变化高度依赖适配体的折叠结构。因此，基于聚合物的方法不能很好的应用于无靶标存在时也会局部形成二级结构的适配体(如可卡因适配体)。Cekan报道EPR和荧光数据都表明在可卡因结合之前可卡因的适配体已经形成了两个螺旋结构，所以不充分的构象变化不适合应用共轭聚合物。(Cekan，P.；Jonsson, E. 0. ；Sigurdsson, S. T. , Nucleic Acids Res. 2009, 37, 3990-3995.)四聚体选择性荧光染料不适用于适配体与靶标结合时形成非四聚体结构的情况。另外，共轭聚合物或结构选择性荧光染料都不是商业产品，使用时必须合成，上述缺点都限制了这些方法的应用。因此，急需一种通用的、无标记的、不需合成过程、并且对结构开关型适配体的结构及与靶标结合后的结构没有严格限制的方法来检测非核酸类靶标。核酸酶是能够在核酸的末端或中间部分特异性切割核苷酸之间的磷酸二酯键的酶。例如flap nuclease、缺口核酸酶、SI核酸酶、核酸外切酶III、核酸外切酶I等，这些酶广泛的应用于高灵敏、高选择性检测DNA靶标的生物技术中。最近，核酸酶在生物传感器的应用领域已经扩展到利用结构开关型适配体检测非核酸靶标中。其中，核酸外切酶I已经被用来检测蛋白质，如王小丽等报道了一种结合PCR扩增技术，利用当有凝血酶靶标存在时适配体会形成四聚体结构从而抵制核酸外切酶I的降解的高灵敏凝血酶检测法。(Wang，X. L ;Li，F. ;Su，Y. H. ;Sun，X. ;Li，X. B. ;Schluesener，H. J. ;Tang，F. ;Xu，S. Q.，Anal.Chem. 2004, 76, 5605-5610.)然而该方法只适用于能形成四聚体的结构开关型适配体。
发明内容
本发明针对现有技术中的问题，基于核酸外切酶I的特异的结构选择性，提供一种具有普适性(可以用于小分子、蛋白质、无机离子)的基于结构开关型适配体构象变化并利用核酸外切酶I的荧光检测方法。我们证明了抵制核酸外切酶I降解的性质不仅存在于四聚体结构和发卡结构而且适用于其它结构。我们的方法中应用的荧光染料为SYBRGold，是一种非常常见的商业核酸染料。核酸外切酶I是一种最便宜的结构选择性核酸酶。这种通用的方法有很多优于现有技术的优点原料方便易得、低成本、高选择性、并且有潜力应用在高通量多通道的检测中。
本发明的目的在于结合结构开关型适配体能与靶标特异性识别并且结构发生变化这一特征及无标记荧光法的优点，提供一种通用的基于适配体的无标记荧光检测方法，以实现对靶标的低成本、高灵敏、准确、快速的检测。其特征在于结构开关型适配体可以与包括离子(比如K+)，小分子(比如可卡因)和蛋白质(比如凝血酶)等各种类型的靶标结合，并折叠为二级结构，这种二级结构比未折叠的适配体更难被核酸酶(比如Exo I)降解。核酸酶酶解反应之后加入核酸染料SYBR Gold对剩余适配体进行染色并检测荧光信号。待测样品中含靶标的浓度越高，则折叠为二级结构的适配体的量越多，越多的适配体不被核酸酶降解，荧光强度也就越高，这样就可以实现对靶标的荧光定量检测。本发明基于结构开关型适配体的高灵敏无标记荧光法研究，其特征在于I、本发明中高灵敏荧光检测K+包括如下步骤(I)K+与适配体(探针I)在结合缓冲液中结合，介导适配体折叠为二级结构-四聚体结构将含有K+适配体的溶液(浓度为101^)901加热5111111并缓慢降至室温。取101^上述溶液与969 u L含不同浓度K+的结合缓冲液(50mM Tris-HCl, 2mM MgCl2, pH8. 3)在离心管中混合均匀。并置于室温12h以保证K+与适配体完全结合。(2)核酸外切酶选择性降解未折叠的适配体向上述样品中加入5U的Exo I混合均匀，并置于37V反应40min，之后于80°C加热15min使酶切反应停止。(3定量未降解的适配体酶切反应后的产物中加入20 ii LlOX SYBR Gold溶液，混合均匀，染色20min后，用Shanghai Hitachi公司的原子荧光光度计F-4500扫描并分析结果。2、本发明中高灵敏荧光检测凝血酶的步骤同K+的检测步骤，除所用探针为凝血酶的适配体(探针2)、所用的结合缓冲液为100mM Tris,140mM NaCl,20mM MgCl2, 20mM KC1、使用的Exo I为2. 5U。3、本发明中高灵敏荧光检测可卡因的步骤同上述K+的检测步骤，除所用探针为可卡因的适配体(探针4)、所用的结合缓冲液为25mM Tris-HCl,0. 15M NaCl,2mM MgCl20本发明基于结构开关型适配体的高灵敏无标记荧光法，具有如下的技术效果I、本发明对靶标的检测不需要对核酸探针进行标记或化学修饰，成本低，使用的试剂都很便宜易得，适合实际应用检测。
2、本方法对适配体的二级结构没有特定的要求，是一种通用型的方法，可以用于阳离子(比如K+)、蛋白质(比如凝血酶)和小分子(比如可卡因)的检测。3、本发明可以应用到真实样品的测试中，例如能够很好的检测人体尿液、血清中的K+含量；将可卡因掺杂到面粉、白砂糖、小苏打中后依然可以检出可卡因，并且检测含量不受掺杂物的影响；血清中凝血酶的检测。4、本发明对靶标的检测专一性高，能很好的抵抗类似物和干扰物的干扰。5、本发明对靶标进行检测的灵敏度很高，例如检测K+的检出限为20 U M，优于同等无标记荧光法的检出限。
图I为高灵敏无标记荧光法检测靶标的原理图。结构开关型适配体可以与包括离 子(比如K+)，小分子(比如可卡因)和蛋白质(比如凝血酶)等各种类型的靶标结合，并折叠为二级结构，这种二级结构比未折叠的适配体更难被核酸酶(比如Exo I)降解。核酸酶酶解反应之后加入核酸染料SYBR Gold对剩余适配体进行染色并检测荧光信号。待测样品中含靶标的浓度越高，则折叠为二级结构的适配体的量越多，越多的适配体不被核酸酶降解，荧光强度也就越高，这样就可以实现对靶标的荧光定量检测。图2 (A)-图2 (B)示出一个高灵敏无标记荧光法的实施例对K+的高灵敏检测。图2(A)为本发明一个实施例中基于高灵敏无标记荧光法检测K+的标准曲线及在ImM Na+或IOmM Na+的干扰下的标准曲线。图2 (A)中选择的K+浓度为20 y M、40 y M、60 y M、100 y M、500iiM、750iiM、lmM、5mM、10mM、25mM。F和F°分别代表样品的荧光强度和空白样品的荧光强度。图2(B)中实线为在ImM Na+的干扰下的标准曲线，虚线为在IOmM Na+的干扰下的标准曲线。用于检测的K+的浓度为25iiM、50iiM、100iiM、lmM、和10mM。图3(A)和图3(B)为本发明一个实施例中基于高灵敏无标记荧光法检测K+和其他干扰离子的荧光光谱图及柱状图。所用K+、Na+、NH4+、Li+、Mg2+、Ca2+的浓度均为ImM。图4(A)-图4 (B)示出一个高灵敏无标记突光法的实施例对凝血酶的高灵敏检测。图5 (A)-图5 (B)示出一个高灵敏无标记突光法的实施例对可卡因的高灵敏检测。图6示出血清样品中凝血酶的检测。
具体实施例方式图I为高灵敏无标记荧光法检测靶标的原理图。如图I (A)所示，结构开关型适配体可以与包括离子(比如K+)，小分子(比如可卡因)和蛋白质(比如凝血酶)等各种类型的靶标结合，并折叠为二级结构，这种二级结构比未折叠的适配体更难被核酸酶(比如ExoI)降解。核酸酶酶解反应之后加入核酸染料SYBR Gold对剩余适配体进行染色并检测荧光信号。待测样品中含靶标的浓度越高，则折叠为二级结构的适配体的量越多，越多的适配体不被核酸酶降解，荧光强度也就越高，这样就可以实现对靶标的荧光定量检测。如图I(B)所示，K+、可卡因和凝血酶能够与它们的适配体形成特定的二级结构。表I为本发明中使用的核酸探针序列的表。表I.本发明中用到的探针
权利要求
1.一种无标记荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤:A、提供一种结构开关型适配体探针，该结构开关型适配体与待测样品中的靶标结合，并折叠为比未折叠的适配体更难被核酸酶降解的二级结构、对待测样品进行核酸酶酶解反应；C、在待测样品中加入核酸染料对未折叠适配体进行染色并检测荧光信号。
2.根据权利要求I所述的无标记荧光检测方法，其特征在于，步骤A还包括如下步骤D :所述结构开关型适配体与靶标在结合缓冲液中结合，介导适配体折叠为二级结构一四聚体结构。
3.根据权利要求I所述的无标记荧光检测方法，其特征在于，步骤B还包括如下步骤E :使用核酸外切酶选择性降解未折叠的适配体。
4.根据权利要求I所述的无标记荧光检测方法，其特征在于，步骤C还包括如下步骤F :定量未降解的适配体。
5.根据权利要求I至4中任一权利要求所述的无标记荧光检测方法，其特征在于，所述靶标为离子、小分子或蛋白质。
6.根据权利要求I至4中任一权利要求所述的无标记荧光检测方法，其特征在于，所述核酸酶为Exo I。
7.根据权利要求I至4中任一权利要求所述的无标记荧光检测方法，其特征在于，所述核酸染料为SYBR Gold。
8.根据权利要求5所述的无标记荧光检测方法，其特征在于，所述离子为K+，所述小分子为可卡因，所述蛋白质为凝血酶。
9.根据权利要求8所述的无标记荧光检测方法，其特征在于，在步骤D中，将浓度为IOuM的含有靶标和适配体的溶液在90°C加热5min并缓慢降至室温，取10 y L上述溶液与969 u L含不同浓度靶标的结合缓冲液在离心管中混合均匀，并置于室温12h以保证靶标与适配体完全结合；在步骤E中，向上述待测样品中加入5U的Exo I混合均匀，并置于37°C反应40min，之后于80°C加热15min使酶切反应停止；在步骤F中，在上述酶切反应后的产物中加入20 ii LlOx SYBR Gold溶液，混合均匀，染色20min后，用原子荧光光度计扫描并分析结果。
10.根据权利要求9所述的无标记荧光检测方法，其特征在于，所述结合缓冲液为50mM Tris-HCl,2mM MgCl2, pH8. 3 ；IOOmM Tris ；140mM NaCl ；20mM MgCl2 ；20mM KCl ；25mMTris-HCl ；0. 15M NaCl ;或2mM MgCl2 ;所使用的Exo I为5U或2. 5U，所使用的适配体为探针，所述探针为K+的适配体或可卡因的适配体或凝血酶的适配体；所述K+的适配体的序列(5，---3，)为 TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA，所述可卡因的适配体的序列(5’ 3’ )为GGGAGTCAAGAACAAAGTTCTTCAATGAAGTGTGGGACGACA9 所述凝血酶的适配体的序列(5’ 一3’ )为AGTCCGTGGTAGGGGCAGGTTGGGGTGACTo
全文摘要
本发明涉及一种对离子、蛋白质和小分子的进行无标记荧光检测的方法。本方法利用了在靶标存在时，靶标能与适配体结合，使适配体折叠成二级结构，而这些二级结构都比未折叠的适配体更难被核酸酶降解。酶切反应后剩余的适配体的量与靶标的浓度成正比。剩余适配体的量可通过核酸染料SYBR Gold来定量，这种荧光染料只染核酸链，对酶切反应后的产物没有染色效果。利用荧光光度计扫描样品，并对荧光强度进行分析，通过荧光信号的变化，实现对靶标的检测。样品中靶标的浓度越高，荧光信号越强。该方法可用于多种靶标的检测，如K+、凝血酶、可卡因等，并且可用于高通量和多通道的检测中，可实现对靶标的低成本、高灵敏、准确、快速的检测。
文档编号C12Q1/68GK102676656SQ20121009389
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者娄新徽, 邹如杏, 郑冬梅 申请人:首都师范大学