专利名称：一种针对hNINL基因RNA干扰的重组慢病毒载体及其制备的制作方法
技术领域：
本发明属分子生物学，生物医药及基因工程技术领域，主要涉及针对hNINL(humanNinein-1 ike)基因的RNA干扰重组慢病毒载体(LV-sh_hNINL)及其制备。
背景技术：
肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致克隆性异常增生和凋亡不足而形成的局部肿块。在体内外致瘤因素作用下，细胞的基因发生突变，导致正常细胞转变为肿瘤细胞，形态、功能和代谢发横异常，因而获得了新的生物学特征。从细胞水平上看，癌的发生是极偶然的事件。从遗传上看，癌都是由一个细胞发展而来，由一个失去了增殖控制的细胞发展而来。人体有百万兆的细胞，每天都有几十亿个细胞进行分裂，理论上几乎任何一个细胞都有可能由基因突变而癌变，但实际上，肿瘤发生是一个渐进式的过程，涉及多级反应和突变的积累。在此过程中，癌变的细胞系越来越不受体内调节机制的控制，并逐渐向正常组织侵染。在细胞发生恶性转变之后，癌细胞继续积累突变，赋予突变细胞新的特性，使癌细胞更具危险性。BRCAl基因编码一个分子量为220kD的大蛋白，该蛋白有多个功能区，可与许多重要蛋白结合，如癌基因蛋白(c_Myc，E2F)，抑癌基因蛋白(p53，Rb，BRCA2，ATM)，DNA修复相关蛋白，细胞周期调节蛋白以及转录调节因子等。BRCAl不仅能抑制细胞生长，还参与细胞周期调控，基因转录调节，DNA损伤修复以及凋亡等多种重要细胞活动，在维持基因组稳定性中起重要作用Bacp/Nlp (BRCA1 associated centrosome protein/Ninein-1 ike protein)蛋白由Ninein-Iike (NINL)基因编码，是一个与BRCAl存在共定位的新蛋白，并且同y-tubulin共定位于中心体。研究显示，Bacp/Nlp蛋白在体内外实验中均能募集Y-TuRC(tubulinring complex)成分Y-Tublin及hGCP4,提示该蛋白可能作为一个候选的GTBp ( Y-Tublincomplex binding protein)成员。同时，Bacp/Nlp促进微管晶核形成,其在有丝分裂期从中心体解离对于纺锤体的形成是必须的，说明该蛋白在染色体的正常分离以及胞质分裂中起着重要作用。与正常组织相比，人类乳腺癌、肺癌等肿瘤组织中广泛存在Bacp/Nlp蛋白的过表达现象，当Bacp/Nlp蛋白的表达被siRNA抑制后，细胞可以出现多个中心体的现象，而且胞质分裂受到抑制不能完成，导致细胞含有多个细胞核；而用Bacp/Nlp高表达的NIH3T3细胞在裸鼠进行注射后，可以导致裸鼠成瘤。这些发现提示，Bacp/Nlp蛋白可能在肿瘤发生、发展过程中发挥着重要的作用。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA (大约21 23bp)，即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase, RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。 shRNA(short hairpin RNA)即短发夹RNA包含两个短反向重复序列,其中一个与目的基因互补，中间loop序列分隔组成发夹结构。在体内shRNA被加工成siRNA有效降解目的基因抑制其表达。但是要将该技术应用于临床治疗，需要解决RNA干扰片段表达持续及表达效率等重要问题。目前基因治疗中目的基因的转移工具多采用病毒载体，其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为常用。由于逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，容纳外源基因的DNA片段长度不超过8kb ;腺病毒载体感染细胞时，病毒DNA游离在细胞核内，并不整合到染色体上，在体内不能实现稳定的长期表达，且反复应用容易引起免疫反应。以人类免疫缺陷病毒-I (HIV-I)来源的慢病毒载体越来越受到人们的重视。研究发现慢病毒载体最大的特点是可以感染非分裂期细胞，人们已成功地应用慢病毒载体感染了神经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞、视网膜色素上皮细胞、气道上皮细胞等。此外，慢病毒载体容纳外源性目的基因的片段大，可以在体内较长期的表达，免疫反应小，安全性较好。本发明选用第三代复制缺陷型慢病毒载体是自杀性(self-inactivating, SIN)病毒，在体内可以较长期的表达且安全性高，能很好的解决RNA干扰技术基因治疗的靶向性、安全性、整合效率等问题。因此慢病毒载体介导的RNA干扰效应在靶细胞内长期存在，可为更好发挥干扰作用创造条件。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种针对hNINL基因RNA干扰的重组慢病毒载体，该载体是自身失活的第三代慢病毒载体SIN，其特征在于，所述的载体SIN含有pGCSIL-GFP/U6-Sh hNINL重组载体，所述的pGCSIL-GFP/U6-Sh hNINL重组载体是在pGCSIL-GFP载体的多克隆位点中连接了双链DNA片段；所述的双链DNA片段的序列为以下序列中的一种(其中S代表正义链，AS代表反义链)(l)hNINL-homo-284 hNINL-homo-284-S 5’ -GATCCTGTGGCTGTGTTGTCTTCATTCAAGAGATGAAGACAACACAGCCACATTTTTTG-3’hNINL-homo-284-AS
5 ’ -AATTCAAAAAATGTGGCTGTGTTGTCTTCATCTCTTGAATGAAGACAACACAGCCACAG-3’(2) hNINL-homo-810 hNINL-homo-8IO-S 5， -GATCCGATCAAGACGGAGACGGCATTCAAGAGATGCCGTCTCCGTCTTGATCTTTTTTG-3，hNINL-homo-8IO-AS 5， -AATTCAAAAAAGATCAAGACGGAGACGGCATCTCTTGAATGCCGTCTCCGTCTTGATCG-3，(3)hNINL-homo-3283 hNINL-homo-3283-S 5， -GATCCGGGCTCTGGAGAAACATGTTTCAAGAGAACATGTTTCTCCAGAGCCCTTTTTTG-3，hNINL-homo-3283-AS 5，-AATTCAAAAAAGGGCTCTGGAGAAACATGTTCTCTTGAAACATGTTTCTCCAGAGCCCG-3，本发明的另一个目的是提供所述的针对hNINL基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，根据hNINL mRNA序列，设计合成了双链DNA片段，所述的双链DNA片段为以下序列中的一种(l)hNINL-homo-284 hNINL-homo-284-S 5，-GATCCTGTGGCTGTGTTGTCTTCATTCAAGAGATGAAGACAACACAGCCACATTTTTTG-3，hNINL-homo-284-AS 5， -AATTCAAAAAATGTGGCTGTGTTGTCTTCATCTCTTGAATGAAGACAACACAGCCACAG-3，(2)hNINL-homo-810 hNINL-homo-8IO-S 5， -GATCCGATCAAGACGGAGACGGCATTCAAGAGATGCCGTCTCCGTCTTGATCTTTTTTG-3，hNINL-homo-8IO-AS 5，-AATTCAAAAAAGATCAAGACGGAGACGGCATCTCTTGAATGCCGTCTCCGTCTTGATCG-3，(3)hNINL-homo-3283 hNINL-homo-3283-S
5，-GATCCGGGCTCTGGAGAAACATGTTTCAAGAGAACATGTTTCTCCAGAGCCCTTTTTTG-3，hNINL-homo-3283-AS 5， -AATTCAAAAAAGGGCTCTGGAGAAACATGTTCTCTTGAAACATGTTTCTCCAGAGCCCG-3，然后将所述的DNA片段连接到pGCSIL-GFP载体的多克隆位点中构建成 pGCSIL-GFP/U6-Sh hNINL 重组载体；再将 pGCSIL_GFP/U6_Sh hNINL 重组载体、pHelperl. O、pHelper 2. 0三种载体共转染293T细胞培养，获得所述的重组慢病毒载体。作为优选，在所述的双链DNA片段末端引入BamH I和EcoR I酶切位点。作为优选，用BamH I和EcoRI酶将pGCSIL-GFP载体酶切，回收大片段后将其与所述双链DNA片段连接后转化感受态菌，挑取重组阳性克隆。该载体转染细胞后能特异性降低hNINL基因的表达，从而可能应用于基因治疗或基因功能研究。本发明提供的LV-sh-hNINL最重要特征在于提供靶向性hNINL基因抑制效应，并用重组慢病毒载体作为载体，使得干扰效果得到持续性作用。整个制备过程全部使用质粒，避免传统方法腺病毒污染。本发明通过筛选最有效hNINL干扰序列，合成其双链DNA，连接到慢病毒骨架质粒载体中，与辅助质粒共转染工具细胞293T细胞，制备出hNINL干扰重组慢病毒载体LV-sh-hNINL。本发明的有益之处是I、本发明采用的pGCSIL-GFP载体含有U6启动子，能够在宿主细胞中持续表达有干扰作用的小RNA。同时该质粒能表达由CMV启动子驱动的荧光蛋白GFP，方便病毒包装时转染效率，以及感染宿主细胞的感染效率的检测。pHelper I. 0质粒中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2. 0质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSVg基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白。将以上三种载体共转入293T细胞能高效组装自身失活的 第三代慢病毒载体(SIN)，增加了两个安全特性其一构建了自身失活(SIN)的慢病毒载体，即删除了 U3区的3’LTR，使载体失去HIV-I增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA。第二个特点是去除了 tat基因代之以异源启动子序列，这样原始的HIV基因，组中的9个基因在构建的HIV慢病毒载体中只保留了 3个(gag、pol和rev)。因此第三代HIV慢病毒载体系统更加安全。2、本发明针对hNINL靶基因设计出四个干扰序列，通过重组的慢病毒干扰载体系统构建包装获得LV-sh-hNINL，通过检测靶细胞中hNINL基因mRNA表达水平，筛选出最有效干扰片段，不仅克服非病毒载体的低转染效率，也避免了重组腺病毒产生的免疫原性，表达时间较短等缺点，能整合到宿主的基因组中并稳定表达，不会导致插入失活，使得干扰作用更加持续，具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小等优点，为有关hNINL基因的进一步研究奠定良好实验基础，并能广泛用于体内基因治疗及基因功能研究。
图I为慢病毒骨架质粒pGCSIL-GFP载体结构示意图。图2为LV-sh-hNINL病毒感染MCF-7细胞72h后对hNINL基因表达干扰效果图片。阴性对照组，加阴性对照病毒感染的细胞组样品；hNINL-homo-284组，加hNINL-homo-284病毒感染的细胞组样品；hNINL-homo-810组,加hNINL-homo-810病毒感染的细胞组样品；hNINL-homo-1983 组,加 hNINL-homo-1983 病毒感染的细胞组样品；hNINL-homo-3283 组，加 hNINL-homo-3283 病毒感染的细胞组样品。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例I :针对基因hNINL的慢病毒载体构建I、寡核苷酸的设计及合成利用Invitrogen公司的在线RNAi系列设计软件BLOCK-iTRNAiDesigner,设计针对hNINL基因mRNA序列(NM_025176. 4)的4个干扰靶序列(参见下表)，并合成相应的双链DNA (上海生工生物工程技术服务有限公司)。LV3-shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号。正义链模板的5’端添加了 GATCC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了 AATTC，与EcoRI酶切后形成的粘端互补。
序列代码~ 序列名称靶序列
N351hNINL-homo-284TGTGGCTGTGTTGTCTTCATT
N352hNINL-homo-810 GATCAAGACGGAGACGGCATT
N353hNINL-homo-1983GAGACCAAGGTAAATTACTTT
N354hNINL-homo-3283GGGCTCTGGAGAAACATGTTT各自的双链DNA合成片段信息如下(I) hNINL-homo-284 hNINL-homo-284-S 5， -GATCCTGTGGCTGTGTTGTCTTCATTCAAGAGATGAAGACAACACAGCCACATTTTTTG-3，hNINL-homo-284-AS 5， -AATTCAAAAAATGTGGCTGTGTTGTCTTCATCTCTTGAATGAAGACAACACAGCCACAG-3，(2)hNINL-homo-810 hNINL-homo-810-S 5，-GATCCGATCAAGACGGAGACGGCATTCAAGAGATGCCGTCTCCGTCTTGATCTTTTTTG-3，hNINL-homo-8IO-AS 5，-AATTCAAAAAAGATCAAGACGGAGACGGCATCTCTTGAATGCCGTCTCCGTCTTGATCG-3’(3)hNINL-homo-1983 hNINL-homo-1983-S 5，-GATCCGAGACCAAGGTAAATTACTTTCAAGAGAAGTAATTTACCTTGGTCTCTTTTTTG-3’hNINL-homo-1983-AS 5， -AATTCAAAAAAGAGACCAAGGTAAATTACTTCTCTTGAAAGTAATTTACCTTGGTCTCG-3’(4)hNINL-homo-3283 hNINL-homo-3283-S 5，-GATCCGGGCTCTGGAGAAACATGTTTCAAGAGAACATGTTTCTCCAGAGCCCTTTTTTG-3，hNINL-homo-3283-AS 5， -AATTCAAAAAAGGGCTCTGGAGAAACATGTTCTCTTGAAACATGTTTCTCCAGAGCCCG-3，具有上述序列的shDNA在体内经转录后可分别产生以下转录子(I) hNINL-homo-284 转录子TGTGGCTGTGTTGTCTTCATTCAAGAGATGAAGACAACACAGCCACATT(2) hNINL-homo-810 转录子GATCAAGACGGAGACGGCATTCAAGAGATGCCGTCTCCGTCTTGATCTT(3) hNINL-homo-1983 转录子GAGACCAAGGTAAATTACTTTCAAGAGAAGTAATTTACCTTGGTCTCTT(4) hNINL-homo-3283 转录子
GGGCTCTGGAGAAACATGTTTCAAGAGAACATGTTTCTCCAGAGCCCTT上述转录子经自身配对形成具有loop结构的双链RNA，经特异性识别双链RNA的酶Dieer，以ATP依赖的方式逐步切割为21 23nt的小分子干扰RNA片段(smallinterfering RNAs, si RNA)。在效应阶段，SiRNA双链与核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。RISC 以 ATP 依赖性方式激活,RISC 中 siRNA 变性，双链解开，卸下正义链，反义链仍结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标RNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶mRNA切断，从而达到阻断基因表达的效果。2、LV3_shDNA 模板的退火将合成的双链DNA片段分别用TE (pH8. 0)溶解，浓度为100uM。取相应的正义链和反义链寡聚物溶液，按照如下配比配置退火反应体系。
权利要求
1.一种针对hNINL基因RNA干扰的重组慢病毒载体，该载体是自身失活的第三代慢病毒载体SIN，其特征在于，所述的载体SIN含有pGCSIL-GFP/U6-Sh hNINL重组载体，所述的pGCSIL-GFP/U6-Sh hNINL重组载体是在pGCSIL_GFP载体的多克隆位点中连接了双链DNA片段；所述的双链DNA片段的序列为以下序列中的一种(1)hNINL-homo-284hNINL-homo-284-S 5，-GATCCTGTGGCTGTGTTGTCTTCATTCAAGAGATGAAGACAACACAGCCACATTTTTTG-3，hNINL-homo-284-AS 5，-AATTCAAAAAATGTGGCTGTGTTGTCTTCATCTCTTGAATGAAGACAACACAGCCACAG-3，(2)hNINL-homo-810hNINL-homo-810-S 5，-GATCCGATCAAGACGGAGACGGCATTCAAGAGATGCCGTCTCCGTCTTGATCTTTTTTG-3，hNINL-homo-8IO-AS 5，-AATTCAAAAAAGATCAAGACGGAGACGGCATCTCTTGAATGCCGTCTCCGTCTTGATCG-3，(3)hNINL-homo-3283hNINL-homo-3283-S 5，-GATCCGGGCTCTGGAGAAACATGTTTCAAGAGAACATGTTTCTCCAGAGCCCTTTTTTG-3，hNINL-homo-3283-AS 5，-AATTCAAAAAAGGGCTCTGGAGAAACATGTTCTCTTGAAACATGTTTCTCCAGAGCCCG-3，。
2.权利要求I所述的针对hNINL基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，根据hNINL mRNA序列，设计合成了双链DNA片段，所述的双链DNA片段为以下序列中的一种 、 (1)hNINL-homo-284hNINL-homo-284-S 、5，-GATCCTGTGGCTGTGTTGTCTTCATTCAAGAGATGAAGACAACACAGCCACATTTTTTG-3，hNINL-homo-284-AS 、5，-AATTCAAAAAATGTGGCTGTGTTGTCTTCATCTCTTGAATGAAGACAACACAGCCACAG-3，(2)hNINL-homo-810hNINL-homo-8IO-S 、5，-GATCCGATCAAGACGGAGACGGCATTCAAGAGATGCCGTCTCCGTCTTGATCTTTTTTG-3，hNINL-homo-8IO-AS 、 5，-AATTCAAAAAAGATCAAGACGGAGACGGCATCTCTTGAATGCCGTCTCCGTCTTGATCG-3，(3)hNINL-homo-3283hNINL-homo-3283-S 、 5，-GATCCGGGCTCTGGAGAAACATGTTTCAAGAGAACATGTTTCTCCAGAGCCCTTTTTTG-3，hNINL-homo-3283-AS 、 5，-AATTCAAAAAAGGGCTCTGGAGAAACATGTTCTCTTGAAACATGTTTCTCCAGAGCCCG-3， 然后将所述的DNA片段连接到pGCSIL-GFP载体的多克隆位点中构建成pGCSIL_GFP/U6-Sh hNINL 重组载体；再将 pGCSIL_GFP/U6_Sh hNINL 重组载体、pHelperl. O、pHelper2.O三种载体共转染293T细胞培养，获得所述的重组慢病毒载体。
3.根据权利要求2所述的针对hNINL基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，在所述的双链DNA片段末端引入BamH I和EcoR I酶切位点。
4.根据权利要求2所述的针对hNINL基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，用BamHI和EcoRI酶将pGCSIL-GFP载体酶切，回收大片段后将其与所述双链DNA片段连接后转化感受态菌，挑取重组阳性克隆。
全文摘要
本发明涉及一种针对hNINL基因RNA干扰的重组慢病毒载体及其制备。实验构建了针对hNINL基因的ShRNA的慢病毒载体，将合成的针对ShRNA的DNA片段通过慢病毒载体介导，还与pHelper 1.0、pHelper2.0两种载体共转染293T细胞培养，获得重组慢病毒载体后，转染目的细胞，实现针对hNINL基因的RNA干扰。采用的自身失活的第三代慢病毒载体(SIN)，具有安全可靠、可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小等优点，是一种理想载体。本发明的慢病毒载体，对人乳腺癌细胞MCF-7干扰效果达60-85％，因此本发明重组慢病毒载体为有关hNINL基因的进一步研究奠定良好实验基础，并能广泛用于体内基因治疗及基因功能研究。
文档编号C12N15/113GK102643859SQ20121009352
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者殷浩金 申请人:常熟市常福有机复合肥有限公司