专利名称：焦磷酸测序法检测cyp19a1基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测CYP19A1基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
芳香化酶(Aromatase Enzyme)属于细胞色素P450酶超家族成员，编码基因为CYP19AI，定位于15q211。为醛固酮、皮质醇、雄激素生物合成不同阶段所必须的酶。CYP19AI可催化睾酮、雄烯二酮向雌酮、雌二醇转化，在雌激素生物合成中起最终的限速催化作用，因而又称雌激素合成酶。芳香化酶抑制剂(Aromatase inhibitors,AIs)通过抑制芳香化酶,使雌激素水平下降，从而消除雌激素对肿瘤生长的刺激作用。绝经后妇女的雌激素主要来源于雄激素前体物质在外周组织的芳香化，故该类药物主要用于自然绝经或人工绝经后的乳腺癌患者。由于其选择性较高，不影响糖皮质激素、盐皮质激素和甲状腺功能，大剂量使用对肾上腺皮质类固醇类物质分泌无抑制作用。按照作用机制的不同，AIs分为两类留体类及非甾体类。留体类AIs包括第一代的睾内酯、第二代的福美坦和第三代的依西美坦。非留体类AIs包括第一代的氨鲁米特、第二代的法屈唑和第三代的阿那曲唑、来曲唑。依西美坦是留体类AIs，具有雄激素结构，与CYP19A1的底物雄烯二酮竞争，不可逆结合于CYP19A1催化中心，导致酶活性丧失。阿那曲唑和来曲唑属于非留体类AIs，与CYP19A1中的亚铁血红素可逆性结合，对酶的抑制程度可达99%以上。临床研究已证实CYP19A1的基因多态性对芳香化酶抑制剂在乳腺癌的治疗效果有着很大的影响作用。在接受来曲唑治疗的绝经后激素受体阳性转移性乳腺癌患者，携带CYP19A1基因rs4646(G > T)突变患者的的疾病进展时间(TTP)比正常者明显延长(17. 2月6. 4 月，P = O. 02)。因此，CYP19A13’ 端非翻译区(3，-UTR) SNP 突变(rs4646G > T)是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂治疗疗效的有效预测指标。综上所述，CYP19A1基因多态性可作为芳香化酶抑制剂疗效预测的有效指标，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CYP219A1基因多态性的试剂盒将为芳香化酶抑制的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测CYP19A1基因(SEQ ID NO. I)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测芳香化酶抑制个体化用药相关基因SNP。 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为
一种焦磷酸测序发检测CYP19A1基因多态性的试剂盒，包括如下引物(I)扩增引物上游引物5'-TCAAACTCTTGGCCTCTGCTTT-3' (SEQ ID NO. 2)；下游引物5'-TGGCCCATGGCATTTTATAGG-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，下游引物的5'进行生物素标记；(2)测序引物5' -CCAAGCTAGGTGCTATT-3' (SEQ ID NO. 4)；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测CYP19A1基因多态性的方法，包括如下步骤
(I) DNA 提取；(2)聚合酶链反应配制50 μ I PCR扩增体系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP 2. 0μ I,CYP19A1-上游引物 O. 5 μ 1，CYP19A1 下游引物 O. 5 μ 1，rTaqO. 5 μ I,水 39. 5 μ I,模板2μ I ;按照下面的循环参数设置扩增仪95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30S,53°C 30S，72°C 30S，进行36个循环；再在72°C保持5min，最终保持在4°C，得扩增产物；(3)焦磷酸测序单链样本纯化；(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明的试剂盒对CYP19Alrs4646(G > T)目标序列，该目标序列包括野生型CCCTGGAAGG (SEQ ID NO. 5)和突变型 CGCTGGAAGG(SEQ ID NO. 6);扩增出的片段长为 127bp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对CYP19A1基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上芳香化酶抑制剂个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明CYP19Alrs4646(GG)焦磷酸测序结果；图2为本发明CYP19Alrs4646 (GT)焦磷酸测序结果；图3为本发明CYP19Alrs4646 (TT)焦磷酸测序结果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :CYP19Al-pyroF(上游引物)5' -TCAAACTCTTGGCCTCTGCTTT-3' (SEQ ID NO. 2)；CYP19Al-pyroR(下游引物)5' -TGGCCCATGGCATTTTATAGG-3' (SEQID NO. 3)；测序引物5'-CCAAGCTAGGTGCTATT-3' (SEQ ID NO. 4)；I. DNA 提取11实验前试剂材料准备与检查工作如下(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V ；(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；
I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；I. 6 盖上 Eppendorf 管盖，室温孵育 IOmin ；I. 713, OOOrpm 室温离心 20 秒；I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；I. 1513, OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；I. 1813, OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；I. 20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；I. 21 目测沉淀大小，加入 50 IOOul DNA Rehydration Solution 至沉淀；I. 22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；I. 24保存核酸标本至4°C冰箱；2.聚合酶链反应2. I在试剂准备区配制50 μ I PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
~IOXPCR buffer~5. Ομ I
dNTP2. Ομ I
权利要求
1.一种焦磷酸测序发检测CYP19A1基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物 (1)扩增引物 上游引物5' -TCAAACTCTTGGCCTCTGCTTT-3'； 下游引物5' -TGGCCCATGGCATTTTATAGG-3'； 其中，下游引物的5'进行生物素标记； (2)测序引物5'-CCAAGCTAGGTGCTATT-3'。
2.一种应用权利要求I所述的试剂盒检测CYP19A1基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)DNA提取； (2)聚合酶链反应 配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP 2. O μ 1，CYP19A1-上游引物O. 5 μ 1，CYP19A1下游引物O. 5 μ 1，rTaqO. 5 μ 1，水39. 5 μ 1，模板2 μ I ;循环程序为95°C5min 预变性；依次在 95°C 30S，53°C 30S，72°C 30S，进行 36 个循环；72°C 保持 5min，最终保持在4°C，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测CYP19A1基因多态性试剂盒及方法。所述试剂盒CYP19A1基因多态性进行检查，具体的是指rs4646(G＞T)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.2-4引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量CYP19A1基因多态性的检测，从而达到对其底物芳香化酶抑制实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102643904SQ201210094339
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏