专利名称：焦磷酸测序法检测他莫昔芬个体化用药基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测他莫昔芬个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
他莫西芬是一种非固醇类抗雌激素药物，目前广泛用于雌激素受体阳性的乳腺癌患者的预防和治疗。在体内他莫西芬的代谢有多种药物代谢酶参与，大约10%他莫西芬由CYP2D6代谢成活性代谢产物4-羟基-N-去甲基他莫西芬(endoxifen)。在中国人群中，CYP2D6最常见的功能减弱等位基因突变型为CYP2D6*10(约占53% )。在一项200名乳腺癌患者接受TAM作为辅剂的疗法中，CYP2D6慢代谢者无瘤生存率较低，这与活性代谢产物 endoxifen生成减慢从而导致疗效的下降相一致。在另一项293名接受治疗的乳腺癌患者中，携带CYP2D6*10等位基因的T/T型患者与C/Τ型或C/C型患者相比，血中4-羟-他莫西芬(另一活性代谢产物)较低，且临床结果较差。接受他莫昔芬治疗的乳腺癌患者的CYP2D6基因型与血液中活性代谢产物的浓度密切相关，并因此显著影响患者的复发率和生存期。因此美国FDA已于2006年建议患者在接受他莫昔芬治疗前首先对CYP2D6的基因型进行检测。他莫昔芬经CYP2D6代谢为活性代谢产物4_0H_他莫昔芬后结合雌激素受体的能力大大增强，该4-0H-代谢产物由SULT1A1硫酸盐化作用代谢失活，因此SULT1A1基因多态性或者活性对于他莫昔芬的疗效具有重要影响。His213(SULTlAl*2)造成酶活性降低2倍且蛋白稳定性降低，造成4-0H-代谢产物难以代谢为活性硫酸盐-他莫昔芬，据推测该次级代谢产物的药理活性更高。因此，如果该产物不能形成，化疗效果及存活率将大大降低。综上所述，CYP2D6*10(rsl065852)和SULT1A1*2 (rs9282861)基因多态性是影响他莫昔芬需求剂量差异性的主要因素，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CYP2D6*10和SULT1A1*2基因多态性的试剂盒将为他莫昔芬的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
CYP2D6*10(rsl065852)和 SULT1A1*2 (rs9282861)基因多态性是影响他莫昔芬剂量个体差异的最主要因素。本发明提供一种检测影响临床他莫昔芬个体化用药治疗的用药基因CYP2D6(SEQ ID NO. I)和SULT1A1(SEQ ID NO. 2)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测他莫昔芬个体化用药相关基因SNP。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为一种焦磷酸测序法检测他莫昔芬个体化用药基因多态性的试剂盒，包括如下引物(I)扩增引物CYP2D6*10(rsl065852)上游引物5' -GTA GTG AGG CAG GTA TGGG-3' (SEQ IDNO. 3)；SULTlAl*2(rs9282861)上游引物5' -GGA GAT TCA AAA GAT CCTGGA-3' (SEQIDN0. 4)；CYP2D6*10(rsl065852)下游引物5 ' -CAG GAC CTC CTC CCT CAC CTGGTC-3' (SEQ IDN0. 5)；SULTlAl*2(rs9282861)下游引物5' -TTC ATC TCC TTG AAC GAC G-3/ (SEQIDNO. 6)；其中，下游引物的5'进行生物素标记；(2)测序引物CYP2D6*10(rsl065852)测序引物5' -GCA GGG GGC CTG GTG-3' (SEQIDN0. 7)；SULTlAl*2(rs9282861)测序引物5 ' -TGG AGT TTG TGG GGC-3 ' (SEQ IDNO. 8)；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用权利要求I所述的试剂盒检测他莫昔芬用药基因多态性的方法，包括如下步骤(I) DNA 提取；(2)聚合酶链反应配制50 μ IPCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 10. O μ I, dNTP 3·0μ1，上游引物Ι.Ομ 1，下游引物Ι.Ομ l，rTaql.0y 1，水30. Ομ 1，模板4. Ομ I ;按照下面的循环参数设置扩增仪95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30S,52°C 30S,72°C 30S，进行38个循环；再在72°C保持5min，最终保持在4°C，得扩增产物；(3)焦磷酸测序单链样本纯化；(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明的试剂盒对CYP2D6*10(rsl065852)目标序列和 SULT1A1*2 (rs9282861)目标序列进行分析和检测；其中，CYP2D6*10 (rsl065852)目标序列包括野生型GGTAGCG(SEQ ID NO. 9)和突变型 AGTAGCG(SEQ ID NO. 10)，扩增出的片段长度为 212bp ;SULT1A1*2 (rs9282861)目标序列包括野生型 GCTCCCTG(SEQ ID NO. 11)和突变型ACTCCCTG (SEQ ID NO. 12)，扩增出的片段长为 93bp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对他莫昔芬个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上他莫昔芬个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明CYP2D6*10GG焦磷酸测序结果；
图2为本发明CYP2D6*10GA焦磷酸测序结果；图3为本发明CYP2D6*10AA焦磷酸测序结果；图4为本发明SULT1A1*2GG焦磷酸测序结果。
具体实施方式
下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :CYP2D6*10(rsl065852)上游引物5' -GTA GTG AGG CAG GTA TGG G-3' (SEQ IDNO. 3)；SULTlAl*2(rs9282861)上游引物5' -GGA GAT TCA AAA GAT CCTGGA-3' (SEQIDN0. 4)；CYP2D6*10(rsl065852)下游引物5 ' -CAG GAC CTC CTC CCT CACCTGGTC-3' (SEQ IDN0. 5)；SULTlAl*2(rs9282861)下游引物5' -TTC ATC TCC TTG AAC GAC G-3/ (SEQ IDNO. 6)；CYP2D6*10(rsl065852)测序引物5' -GCA GGG GGC CTG GTG-3' (SEQIDNO. 7)；SULTlAl*2(rs9282861)测序引物5 ' -TGG AGT TTG TGG GGC-3 ' (SEQIDNO. 8)；I. DNA 提取I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V ；(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一'丨生标识做好标记；I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；I. 6 盖上 Eppendorf 管盖，室温孵育 IOmin ；1.713，OOOrpm 室温离心 20 秒；I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；I. 15 13，OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；I. 17移取300uL 75 %乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；I. 18 13，OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；I. 20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；I. 21 目测沉淀大小，加入 50 IOOul DNA Rehydration Solution 至沉淀；I. 22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；I. 24保存核酸标本至4°C冰箱；2.聚合酶链反应2. I在试剂准备区配制50 μ I PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
权利要求
1.一种焦磷酸测序法检测他莫昔芬个体化用药基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物 (1)扩增引物 上游引物5/ -GTA GTG AGG CAG GTA TGG G-3'；5' -GGA GAT TCA AAA GAT CCT GGA-3'； 下游引物5' -CAG GAC CTC CTC CCT CAC CTG GTC-3'；5' -TTC ATC TCC TTGAAC GAC G-3/ ； 其中，下游引物的5'进行生物素标记； (2)测序引物5'-GCA GGG GGC CTG GTG-3'；5' -TGG AGT TTG TGG GGC-3'。
2.一种应用权利要求I所述的试剂盒检测他莫昔芬个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤 (1)DNA提取； (2)聚合酶链反应 配制 50μ IPCR 扩增体系，包含10XPCR buffrlO. Ομ I, dNTP 3·0μ1，上游引物I. O μ 1，下游引物 I. Ομ I, rTaqL Ομ 1，水 30. O μ 1，模板 4. O μ I ;循环程序为95°C 5min预变性；依次在95°C 30S,52°C 30S,72°C 30S，进行38个循环；72°C保持5min，最终保持在4°C，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测他莫昔芬个体化用药基因多态性试剂盒及方法。具体是指CYP2D6*10(rs1065852)和(SULT1A1*2)(rs9282861)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.3-8所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量CYP2D6*10(rs1065852)和SULT1A1*2(rs9282861)的检测，从而达到对他莫昔芬用药实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102643905SQ20121009442
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏