专利名称：牦牛源性纤维成分荧光定量pcr定性检测方法
技术领域：
本发明属于生物工程的技术领域，具体的说，是牦牛源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法。
背景技术：
牦牛是一种能在高原高寒的恶劣环境下生存的哺乳动物，也是牛科动物唯一有纺织利用价值的成员。牦牛分为野牦牛和家牦牛，野牦牛又叫野牛，学名Bosmutus (Poephagrt mutrs),英文名wild yak,藏名音译亚归。牦牛生长在海拔3000米 5000米的高寒地区，能耐零下30°C 40°C的严寒，牦牛厚厚长长的毛层下聚集着细密的绒毛，这些绒毛为牦牛在高寒的天气状况下生存提供了可能。全世界现有牦牛1400多万头，大都分布在中国青藏高原及其周围海拔3000m以上的高寒地区。我国是世界上牦牛数目最多的国家，约占全世界总数的90%。牦牛绒与紫山羊绒在外表形态上很相似，如图I所示，图I为显微镜下的紫山羊绒(左)和牦牛绒(右)的照片。两者都在显微镜下均存在色素团，给鉴别工作带来了困难。由于本身带有色素，紫山羊和牦牛绒通常会被制成深色的织物，这就进一步给检测鉴别工作增加了难度。一些不法分子利用这一相似性，将牦牛绒充作紫山羊绒坑害给消费者，从中牟利。我国现行的标准GB/T 16988-1997《特种动物纤维与绵羊毛混合物含量的测定》对牦牛绒的描述牦牛绒纤维鳞片张角较小，鳞片密度为100-130个/_，毛色为黑色、棕褐色。而在一般的光学显微镜下，鳞片并不是很清晰，检测起来费时费力。电镜法成本高，且制样比较烦索。
发明内容
本发明是一种基于DNA检测技术的牦牛绒纤维的定性鉴别方法，克服了现有光学显微镜检下鳞片不清晰、费时费力缺点和；以及克服了电镜检成本高，且制样繁琐的不足。本发明的目的在于，提供一种牦牛源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法。本发明的另一目的在于，提供一种牦牛源性纤维成分的检测试剂盒，以及试剂盒的用途。本发明的再一目的在于，提供一种牦牛源性纤维成分荧光定量PCR的引物和探针。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现作为本发明的第一方面，一种牦牛源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法，包括以下步骤步骤一、以牦牛绒的DNA为模板，进行PCR扩增；步骤二、检测扩增产物的荧光信号；其特征在于，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增牦牛源性纤维成分特异性引物对和牦牛源性纤维成分特异性探针。其中，所述扩增牦牛源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示。其中，所述牦牛源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述方法还包括步骤在聚合酶链式反应过程中或之后，检测牦牛源性纤维成分特异性探针发出的荧光信号。其中，所述PCR扩增的条件如下反应体系ABITaqman u niversal PCR master 1111叉(2\)1(^1,0嫩模板44 1,弓|物 O. 6 μ 1，探针 2. 5 μ 1，CldH2O 4. 9 μ I ；反应条件95°C,5min;95°C，15s，60°C，45s，40 个循环。引物的浓度为O. 3 μ M，探针的浓度为O. 25 μ M0作为本发明的第二方面，一种牦牛源性纤维成分的检测试剂盒，含有以下试剂(a)扩增牦牛源性纤维成分特异性引物对；(b)牦牛源性纤维成分特异性探针。进一步，所述试剂盒还包括(C)标准参照物。其中，所述标准参照物是牦牛源性纤维成分DNA，或含有牦牛源性纤维成分扩增目的片段的质粒DNA，或牦牛绒。其中，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。其中，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述牦牛源性纤维成分特异性探针发出的荧光信号。作为本发明的第三方面，一种牦牛源性纤维成分的检测试剂盒的应用，用于检测在纺织品中是否存在牦牛源性纤维成分。作为本发明的第四方面，一种如权利要求I所述的牦牛源性纤维成分荧光定量PCR的特异性引物和特异性探针，其特征在于所述特异性引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示；所述特异性探针的序列如SEQ ID NO 3所示。作为本发明的第五方面，一种牦牛源性纤维成分荧光定量PCR的特异性引物和特异性探针的用途，所述特异性引物和特异性探针用于制备检测纺织品中是否存在牦牛源性纤维成分的试剂盒。本发明的有益效果I、可简便、快速的检测和鉴定纺织品中是否存在牦牛源性纤维成分。2、本发明基于牦牛线粒体12SrRNA基因的序列，设计特异性引物和特异性探针的特异性好。3、检测方法灵敏度佳，可检测到配比为1% (Wt)的牦牛绒。
图I :显微镜下的紫山羊绒(左)和牦牛绒(右)。图2 :反应体系优化结果。
图3 :牦牛引物探针序列与山羊序列的blast结果。图4 :牦牛引物探针序列与绵羊序列的blast结果。图5 :牦牛成分的实时荧光PCR结果。图6 :10倍梯度稀释后的检测情况。图7 :10倍梯度稀释的线性关系。图8 :不同配比的牦牛绒检测情况。图9 :疑似含有牦牛绒的山羊绒样品。图10 :样品A的检测结果。 图11 :样品B的检测结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件或厂商提供的条件进行。以下实施例中所涉及的“％”，除特别说明外，均为重量百分比。实施例II、牦牛成分实时荧光PCR扩增的引物和探针设计比较山羊、绵羊、牦牛线粒体12SrRNA基因的序列，选取合适的序列进行引物设计。牦牛源性纤维成分特异性引物扩增产物大小为65bp。特异性引物和探针的序列如下YakF :5’ -AAGCATCTACACCCCAGTGAGAAT-3’ (SEQ ID NO 1)YakR :5’ -GCTTGATGCCAGCTCCTCTT-3’ (SEQ ID NO 2)Pyak :FAM-CCCTCTAGGTTGTTAAAAT-MGB(SEQ ID NO 3)同时设计了牦牛、山羊、绵羊共有的通用引物，通用引物扩增产物大小为88bp，通用引物和探针的序列如下GsyF :5，-GGGTTTACGACCTCGATGTTG-3，(SEQ ID NO 4)GsyR :5，-ACGTAGGACTTTAATCGTTGAACAAA-3’ (SEQ ID NO 5)Pgsy FAM-ACCGCTATCAAAGGTT-MGB (SEQ ID NO :6)其中，FAM表示荧光报告基团，MGB表示淬灭基团。本发明采用荧光探针法，其检测原理是利用荧光标记特异性探针来识别模板。与现有技术中SYBR染料法相比，本发明荧光标记特异性探针的特异性更强。2、牦牛成分的反应体系的优化取牦牛绒5mg使用Progema毛发抽提试剂盒抽提DNA，50 μ I洗脱液洗脱DNA，取4μ I样品检测。反应体系除ABI Taqman universal PCR master mix (2X) 10 μ I,DNA 模板 4 μ I以外，其他成分如表I所示。引物的浓度为O. 3 μ Μ，探针的浓度为O. 25 μ M0
反应的条件为95°C，5min;95°C，15s，60°C，45s，40 个循环。表I、优化反应体系中其他成分的用量
体系引物探针ddH20
~ 04 θΓθ~
~204 2δΓθ~ 306 &Λ~
~0 6 25Λ~
506 2 54 9~优化结果如图2所示。综合考虑荧光信号强度，Ct值等因素，选体系5为扩增牦牛成分的实时突光PCR反应体系，即反应体系5 (成分用量ABITaqman universal PCR mastermix (2 X) 10 μ 1，DNA 模板 4 μ 1，引物 O. 6 μ 1，探针 2. 5μ I, ddH20 4· 9 μ I)。3、牦牛成分实时荧光PCR扩增的引物和探针特异性比对与验证3. I、牦牛成分实时荧光PCR扩增的引物和探针特异性比对牦牛的线粒体12SrRNA与山羊的相似性为89%，与绵羊的相似性为87%。引物和探针与相应位置的比对情况如图3和图4 :牦牛引物探针序列与山羊序列的blast结果，见图3。牦牛引物探针序列与绵羊序列的blast结果，见图4。3. 2、牦牛成分实时荧光PCR扩增的引物和探针特异性实验验证分别取牦牛绒、山羊绒、绵山毛5mg,用progema毛发抽提试剂盒抽提DNA,70y I洗脱液洗脱DNA。引物的浓度为10 μ M，探针的浓度为2 μ M。分别以ddH20，牦牛绒、山羊绒、绵山毛DNA为模板进行实行荧光PCR扩增。退火温度为60°C 45s。反应体系如下，参见表2 表2、牦牛引物探针特异性验证实验反应体系
总量
心Mix 引物探针 DNA ddH20
Total(pl)
1__20__\0__06__2 4(yak) 3.4
220__\0__06__2 4(goat) 3.4
320__\_0__06__2 4(sheep) 3.4
4I 20 I 10 I 0.6 I 2 4(ddH20) 3.4牦牛成分的实时荧光PCR结果，见图5。4、灵敏度检测
用优化好的反应体系进行灵敏度的测定。将抽提所得的DNA 10倍梯度稀释，可以检测到IO4倍稀释的牦牛DNA。同时将易混淆，显微镜法难分辨的牦牛绒和紫山羊绒以不同的配比混合，其中牦牛绒的含量(重量百分比)分别为100%、10%、1%，实验证明该方法可以检测到配比为1%的牦牛绒。结果如图6-图8，图6为10倍梯度稀释后的检测情况，图7为10倍梯度稀释的线性关系，图8为不同配比的牦牛绒检测情况。图7表明，在重量百分比水平上，Ct值与模板拷贝数之间的线性关系良好，可检测牦牛源性纤维成分DNA浓度。5、实物的检测有两块疑似含有牦牛绒的山羊绒样品中。A样品为深灰浅灰两层毛呢料，客户报验为100%羊绒制品。经显微镜法检测，A样含羊绒86. 8 %，牦牛绒9.0%，羊毛4. 2 %。B样品含羊绒78. 1%，牦牛绒19. 1%，羊毛2.8%。样品表观见下图9。
各取A样、B样一小块，剪碎混匀，精确称量5mg使用Progema试剂盒抽提DNA。每个样品两个平行样。因样品颜色较深，多次洗脱DNA。取4μ I样品检测，同时作Gsy检测，作为阳性对照。如图10和表3所示，A样的Yak的检测值分别为25. 55，24. 97，相应量的DNA的Gsy 检测为 22. 65 和 22. 11。如图11和表4所示，黑色样B的检测值均偏大。黑色样B可能受染料的影响。可以肯定的是样品A含有牦牛绒，推测样品B也含有牦牛绒。表3、样品A的检测结果
权利要求
1.一种牦牛源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法，包括以下步骤 步骤一、以牦牛绒的DNA为模板，进行PCR扩增； 步骤二、检测扩增产物的荧光信号； 其特征在于，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增牦牛源性纤维成分特异性引物对和牦牛源性纤维成分特异性探针。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述扩增牦牛源性纤维成分特异性引物对的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述牦牛源性纤维成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件如下反应体系ABI Taqman universal PCR master mix (2X) 10 u I, DNA 模板 4 u I,引物.0. 6u 1，探针 2. 5u I, ddH20 4. 9 u I ； 反应条件95°C,5min ；95°C, 15s,60°C,45s,40 个循环。
5.—种牦牛源性纤维成分的检测试剂盒,含有以下试剂 (a)扩增牦牛源性纤维成分特异性引物对； (b)牦牛源性纤维成分特异性探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括 (C)标准参照物。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物对的序列如SEQID NO:I 和 SEQ ID NO 2 所示。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO 3所示。
9.如权利要求5 8中任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，用于检测在纺织品中是否存在牦牛源性纤维成分。
10.一种如权利要求I所述的牦牛源性纤维成分荧光定量PCR的特异性引物和特异性探针，其特征在于， 所述特异性引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示； 所述特异性探针的序列如SEQ ID NO 3所示。
全文摘要
本发明公开了一种牦牛源性纤维成分荧光定量PCR定性检测方法，包括步骤一、以牦牛绒的DNA为模板，进行PCR扩增；步骤二、检测扩增产物的荧光信号；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增牦牛源性纤维成分特异性引物对和牦牛源性纤维成分特异性探针。本发明的方法可简便、快速的检测和鉴定纺织品中是否存在牦牛源性纤维成分，设计的特异性引物和特异性探针的特异性好，灵敏度佳，可检测到配比为1％(wt)的牦牛绒。
文档编号C12Q1/68GK102634581SQ201210096730
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者叶江, 吴海珍, 唐敏峰, 张小明, 杨娟, 王卫华, 董正廉, 费静 申请人:上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心, 华东理工大学