专利名称：小麦叶片发育基因TaWRKY76及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及叶片发育基因——WRKY转录因子TaffRKY76及其应用。
背景技术：
叶型是一个与作物产量紧密相关的重要性状。叶片的三维结构可以影响光合作用的光吸收，碳固定和气体交换。适当卷曲的叶片是超级稻的一个重要特征。适当的叶片卷曲提高了光合作用效率，增强了干物质积累，增加产量，减少太阳光对叶片的伤害，降低干旱条件下的呼吸作用。因此揭示控制叶片卷曲的机制对作物育种和耐逆性具有重要的意义。叶片卷曲受激素和非激素等多个因素的调控，已有的研究表明生长素甲酯转移酶AtIAMTl与叶片卷曲密切相关，但是AtIAMTl的调控机制还不清楚。WRKY基因家族是植物特有的基因家族，在抗病虫害方面发挥重要作用，但是WRKY基因在叶片发育中的作用还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种叶片发育基因——小麦WRKY类蛋白基因TaWRKY76及其应用。本发明所述叶片发育基因——小麦WRKY类蛋白基因TaWRKY76，其特征在于:所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。本发明所述基因TaWRKY76在培育叶片卷曲植物中的应用。其中，所述植物优选是水稻、豆类、薯类、青稞、小麦或拟南芥。实验证实，将本发明从小麦中分离得到的WRKY基因——小麦TaWRKY76导入植物细胞，植物就可以获得叶片卷曲的表型。例如:将小麦TaWRKY76转化到拟南芥中以控制拟南芥叶片表型，使拟南芥叶片卷曲，以期提高光合作用。任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用于本发明，本发明优选的载体是PSTART。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaffRKY76的植物表达载体进行加工，如可以加入选择标记(⑶S等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。本发明的有益效果是:利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦WRKY类基因TaWRKY76，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的叶片呈现适当卷曲的表型，为提高光合作用提供了有利条件。预示本发明所述的基因可广泛用于培育高产农作物品种。
图1:TaWRKY76基因全长cDNA 序列的扩增结果，其中a:为 λ DNA/(EcoR I +Hind III) Marker 不意b:在小麦品种山融3号中获得的长度为1068bp的TaWRKY76cDNA全长。图2:TaffRKY76在小麦叶片中特异性表达。图3:TaffRKY76定位于细胞核，其中A:TaffRKY76在拟南芥原生质体中的亚细胞定位；B:TaffRKY76在洋葱表皮中的亚细胞定位。图4:TaffRKY76基因的转录激活活性分析，其中A:在SD-Trp单缺培养基上生长，B:在SD-Trp-His-Ade培养基上不能生长。图5:TaffRKY76连接到pSTART过表达载体，转化拟南芥，拟南芥叶片呈现上卷的表型A:TaffRKY76转基因拟南芥叶片表型；B:TaffRKY76转基因拟南芥TaWRKY76表达量分析。图6:TaffRKY76在拟南芥中过表达，使拟南芥叶片下表面的海绵组织比野生型叶片排列更紧密A:对照拟 南芥叶片横切面；B:TaffRKY76转基因拟南芥叶片横切面；C:对照拟南芥叶片横切面局部放大图；D:TaffRKY76转基因拟南芥叶片横切面局部放大图；图1:TaffRKY76转基因拟南芥相关marker基因定量PCR分析
具体实施例方式实施例1: TaWRKY76基因的克隆1.1小麦培养:将山融3号和济南177小麦种子发芽，用Hoagland培养液，21°C，长日照(光照16h/黑暗8h)，培养至2叶I心期，提取RNA ；1.2 总 RNA 的提取:试剂及器皿:RNAiso(TaKaRa)> 氯仿(Chloroform)、异丙醇(Isopropylalcohol)、无水乙醇(Ethanol)、DEPC水，所有塑料耗材均经DEPC水处理24h后，123°C,40min高压湿热灭菌，然后放在烘箱65度烘干(大约2天)，玻璃器皿及金属用具经180°C高温处理6h。I)取材:叶片0.05g，根(取材前用吸水纸吸干净)0.07g放进2ml塑料离心管中，加入钢柱一个，液氮速冻，振荡器振荡研磨；2)加入1.5ml Trizol提取液,迅速颠倒混勻，室温放置5min,然后12000rpm,4°C离心IOmin (离心机用70%乙醇擦拭，4° C预冷)；3)取上清约1.5ml与另一个2.0ml离心管中，加入300 氯仿(上清液的1/5)，颠倒混勻，室温静置5min,然后12000rpm, 4°C离心15min ；4)取上清500 U I与新的1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇(500 U I)，颠倒混勻，室温放置 5 IOmin, 12000rpm, 4°C离心 IOmin ；5)弃上清留白色沉淀，加入用DEPC水配制的70%乙醇Iml洗剂，12000rpm，4°C离心5min,重复一次；6)去上清，用200 Ul移液枪将乙醇吸干净(不能碰到白色沉淀)，超净台中敞盖约 IOmin ；7)加入适量DEPC处理过的超纯水溶解(一般30 50 μ IDEPC水即可);8)用RNase自由的DNaseI处理后(方法见下面)，测定0D26(1、OD280, OD230值，确定RNA浓度和纯度；9)取I μ gRNA EB胶电泳检测RNA是否完好；10)用RNA直接作模板扩增小麦actin基因，检测DNA是否去处干净。1.3消化RNA中基因组DNA1)选用TaKaRa的DNaseI (RNase Free),在0.5ml离心管中配制下列反应体系，100 μ 1 体系:
权利要求
1.一种小麦叶片发育基因TaWRKY76，其特征在于:所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID N0.1 所示。
2.权利要求1所述基因TaWRKY76在培育叶片卷曲植物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于:所述植物是水稻、小麦、薯类、青稞、豆类或拟南芥 。
全文摘要
本发明公开了一种小麦叶片发育基因TaWRKY76，其中所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了所述基因TaWRKY76在培育叶片卷曲植物中的应用。实验证实，将本发明所述小麦TaWRKY76导入植物细胞，植物即可获得叶片卷曲的表型，为提高光合作用提供了有利条件，预示本发明的基因可广泛用于培育高产农作物品种。
文档编号C12N15/84GK103173465SQ20131009788
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月25日 优先权日2013年3月25日
发明者夏光敏, 秦桢 申请人:山东大学