专利名称：一种花生基因组dna的提取方法
技术领域：
本发明涉及基因组DNA的提取方法，具体涉及一种花生基因组DNA的提取方法。
背景技术：
花生又名落花生，属一年生草本植物，其含油量高，被人们誉为“植物肉”。除供食用外，还可用于印染、造纸工业等，是我国重要的油料和经济作物。我国的花生种植面积和生产总量均居世界前列在国际上具有很强的竞争力。但是，我国目前花生的种质资源相对有限，一些抗病抗逆的种质资源相对缺乏，尤其是抗黄曲霉品种。常规的杂交育种、诱变育种都很难有目的性地进行花生遗传基因改良。而转基因育种可以任意选择生产上的当家品种进行外源基因的导入，达到目的性状基因的转移和种质改良的目的。现有花生转基因育种的常用方法有农杆菌介导法和基因枪法。无论采用何种方法，提取组织培养的外植体的基因组DNA、对转化体进行分子鉴定从而筛选转化体都是必经的途径。由于花生体内含有的次生代谢物质较多，所以花生基因组的提取相对较难。目前广泛应用的技术方案有CTAB、酚类法大量提取，这些方法均存在以下缺陷1、对操作人员身体有害；2、需要较多的样品，步骤繁琐、耗时，对植株也有影响。植物基因组DNA的提取和鉴定是进行植物生物技术试验所必需的试验内容，高质量的植物基因组DNA对于后续试验非常有利。发明一种快速提取花生基因组DNA的方法，减小DNA提取实验过程中对实验人员身体的伤害，有利于开展花生的生物技术试验。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种快速提取花生基因组DNA的方法，其提取周期短、成本低、步骤简单且对实验人员无伤害。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种花生基因组DNA的提取方法，其包括以下步骤
1)将花生叶片磨成粉末；
2)加入溶液A和终浓度为lmg/ml的RNA酶，充分混匀后静置；
3)加入KAc充分混匀后进行第一次离心分离；
4)取步骤3)得到的上清液加入异丙醇，充分混均，此时出现絮状的核酸，进行第二次离心分离或者挑取出絮状物质，然后用体积浓度为75%的乙醇漂洗絮状物质，漂洗后干燥，再用无菌的ddH20溶解干燥所得的沉淀物；
上述步骤中所述溶液A是由IM Tris-HCUO. 5M EDTA、5M NaCl、质量浓度为20%的SDS、H2O按体积比为I :1 1 :1 :6混匀，再按混合溶液体积的2%加入β-巯基乙醇，最后加入终浓度为40-50mg/l的RNA酶制成的。优选地，为了瞬间冻结样品，抑制样品中的一些酶如DNA酶，RNA酶，多酚氧化酶等活性，步骤I)花生叶片是用液氮研磨成粉末的。优选地，步骤2)中每克花生叶片粉末加入的溶液A的体积为1-2. 5ml，更优选地，每克花生叶片粉末加入的溶液A的体积为I. 5-2 ml。优选地，步骤2)中常温静置5-10分钟。优选地，为了使核蛋白复合体中的蛋白质充分变性，将DNA与蛋白质、多酚、多糖等物质分离，步骤3)中KAc先经过预冷处理，预冷至4°C后再加入，低温更有效地抑制内源DNA酶的活性，保护DNA的完整性。 优选地，步骤3)中加入的KAc的浓度为5M，其加入量为溶液A的体积的1/3。优选地，步骤4)中异丙醇的加入量与上清液的体积相等。优选地，为了充分地分离上清液与残渣，第一、二次离心分离的转速为8000-15000rpm,时间为 8-15 分钟。更优选地，第一、二次离心分离的转速为10000-12000rpm，时间为10分钟。优选地，步骤4)无菌的ddH20的用量为O. 05_2ml。与现有技术相比，本发明的有益效果是
1、本方法需要的试剂品种少且较便宜，对试验人员身体无伤害；
2、本方法步骤少、流程简单，方便快捷可操作性强，提取花生基因组DNA的整个流程仅需要25-45分钟，能适用于大量待检测花生基因组DNA提取；
3、本方法能适用于微量和大量的花生基因组DNA提取，可满足不同的实验要求。
图I是用NanoDrop-1000超微量核酸蛋白测定仪检测微量花生基因组DNA的结果 图2是用NanoDrop-1000超微量核酸蛋白测定仪检测大量花生基因组DNA的结果图；图3是对花生基因组DNA进行酶切的电泳图，图中I为BamH I酶切的结果，2为EcoR I酶切的结果，3为Hind III酶切的结果，4为Kpn I酶切的结果，5为Pst I酶切的结果，6为花生基因组DNA ；
图4为PCR电泳检验结果，其中1-3为转基因植株bar基因的检测，+为阳性对照，M为DL2000 DNA marker0
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例子对本发明一种花生基因组DNA的提取方法作进一步详细说明。实施例I
一种花生基因组DNA的提取方法，其包括以下步骤
I)将花生叶片置于离心管或研钵中，加入液氮，磨成粉末；2)取步骤I)得到的粉末O.3-0. 5g，加入O. 75ml溶液A和10mg/ml的RNA酶4ul，使得终浓度为lmg/ml，充分混均后在常温下静置5-10分钟；
3)取体积O.25ml的KAc,先预冷至4°C后再加入，充分混均后进行离心分离，转速为8000-15000rpm,时间为 8-15 分；
4)取步骤3)得到的上清液加入等体积量的异丙醇，充分混均，此时出现絮状的核酸，再进行离心分离，转速为8000-15000rpm，时间为8_15分，然后用体积浓度为75%的乙醇漂洗离心分离得到的絮状物质，漂洗后干燥，再用O. 05-2 ml无菌的ddH20溶解干燥所得的沉淀物，得到DNA提取液。上述步骤中所述溶液A是IM Tris-HCl,0. 5M EDTA, 5M NaCl，质量浓度为20%的SDS，H2O按体积比为I :1 :1 :1 :6混均，再按混合溶液体积的2%加入β -巯基乙醇，最后加入终浓度为40-50mg/l的RNA酶制成的。实施例2
一种花生基因组DNA的提取方法，其包括以下步骤
1)将花生叶片置于离心管或研钵中，加入液氮，磨成粉末；
2)取步骤I)得到的粉末5-7g，加入9ml溶液A和10mg/ml的RNA酶45ul，充分混均后在常温下静置5-10分钟；
3)取体积3ml的KAc,先预冷至4°C后再加入，充分混均后进行离心分离，转速为8000-15000rpm,时间为 8-15 分；
4)取步骤3)得到的上清液加入等体积量的异丙醇，充分混均，此时出现絮状的核酸，挑取出絮状物质，用体积浓度为75%的乙醇漂洗絮状物质，漂洗后干燥，再用O. 05-2ml无菌的ddH20溶解干燥所得的沉淀物，得到DNA提取液。上述步骤中所述溶液A是IM Tris-HCl,0. 5M EDTA, 5M NaCl，质量浓度为20%的SDS，H2O按体积比为I :1 :1 :1 :6混均，再按混合溶液体积的2%加入β -巯基乙醇，最后加入终浓度为40-50mg/l的RNA酶制成的。实施例3
用NanoDrop-1000超微量核酸蛋白测定仪检测实施例I制得的花生基因DNA的质量，结果如图I所示。由图I可知，D260/D280的值均在I. 8-2. O之间，且测得的浓度在600ng/ul以上，说明此方法提取花生基因组DNA是可行的。实施例4
用NanoDrop-1000超微量核酸蛋白测定仪检测实施例2制得的花生基因DNA的质量，结果如图2所示。由图2可知，D260/D280的值均在I. 8-2. O之间，且测得的浓度在600ng/ul以上，说明此方法提取花生基因组DNA是可行的。实施例5对提取的花生基因DNA进行酶切电泳检测
如图3所示，直接应用实施例2所提取基因组DNA进行不同酶切，经电泳检测可见，均用2ul的基因组DNA进行6小时的酶切，由图3中的2孔和3孔可见酶切效果良好，说明所提取的花生基因组DNA在未经纯化处理的条件下，对基因组DNA质量要求较高的酶切无影响。实施例6 PCR检测
直接应用实施例I所提取的基因组DNA进行PCR扩增，结果如图4所示，经电泳检测，效果相当好，扩增条带清晰，说明所提取的花生基因组DNA在未经纯化处理的条件下，可直接用于常规的生物技术操作。上述实施例仅为本发明的优选实施案例不能以此来限定本发明的保护范围，本领域的技术人员在发明的基础上所做的任何非实质性的变换及替换均属于本发明所要求保护的范围。权利要求
1.一种花生基因组DNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤 1)将花生叶片磨成粉末； 2)加入溶液A和终浓度为lmg/ml的RNA酶，充分混匀后静置； 3)加入KAc充分混匀后进行第一次离心分离； 4)取步骤3)得到的上清液加入异丙醇，充分混均，此时出现絮状的核酸，进行第二次离心分离或者挑取出絮状物质，然后用体积浓度为75%的乙醇漂洗絮状物质，漂洗后干燥，再用无菌的ddH20溶解干燥所得的沉淀物； 上述步骤中所述溶液A是由IM Tris-HCUO. 5M EDTA、5M NaCl、质量浓度为20%的SDS、H2O按体积比为I :1 1 :1 :6混匀，再按混合溶液体积的2%加入β-巯基乙醇，最后加入终浓度为40-50mg/l的RNA酶制成的。
2.如权利要求I所述的花生基因组DNA的提取方法，其特征在于步骤I)花生叶片是用液氮研磨成粉末的。
3.如权利要求I所述的花生基因组DNA的提取方法，其特征在于步骤2)中每克花生叶片粉末加入的溶液A的体积为1-2. 5ml。
4.如权利要求I所述的花生基因组DNA的提取方法，其特征在于步骤2)中常温静置5-10分钟。
5.如权利要求I所述的花生基因组DNA的提取方法，其特征在于步骤3)中KAc先经过预冷处理，预冷至4°C后再加入。
6.如权利要求I所述的花生基因组DNA的提取方法，其特征在于步骤3)中加入的KAc的浓度为5M，其加入量为溶液A的体积的1/3。
7.如权利要求I所述的花生基因组DNA的提取方法，其特征在于步骤4)中异丙醇的加入量与上清液的体积相等。
8.如权利要求I所述的花生基因组DNA的提取方法，其特征在于第一、二次离心分离的转速为8000-15000rpm，时间为8-15分钟。
9.如权利要求8所述的花生基因组DNA的提取方法，其特征在于第一、二次离心分离的转速为10000-12000rpm，时间为10分钟。
10.如权利要求I所述的花生基因组DNA的提取方法，其特征在于步骤4)无菌的ddH20 的用量为 O. 05-2ml。
全文摘要
本发明涉及一种花生基因组DNA的提取方法，其包括以下步骤1)花生叶片磨成粉末；2)加入溶液A和终浓度为1mg/ml的RNA酶；3)加入KAc后进行离心分离；4)取步骤3)得到的上清液加入异丙醇，进行离心分离或者挑取出絮状物质，用体积浓度为75%的乙醇漂洗絮状物质，干燥，再用无菌ddH2O溶解干燥所得的沉淀物；上述步骤中所述溶液A是由1MTris-HCl、0.5MEDTA、5MNaCl、质量浓度为20%的SDS、H2O按体积比为11116混匀，再按混合溶液体积的2%加入β-巯基乙醇、终浓度为40-50mg/l的RNA酶制成的。本发明的方法安全、快捷、高效，可满足不同的实验要求。
文档编号C12N15/10GK102732508SQ20121023262
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者刘海燕, 李洪杰, 梁炫强, 洪彦彬, 温世杰 申请人:山东圣丰种业科技有限公司, 广东省农业科学院作物研究所