专利名称：棉大卷叶螟吐丝基因片段及其克隆方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及棉大卷叶螟丝素轻链蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列，并涉及该基因的用途。
背景技术：
棉大卷叶螟(Sylepta derogata Fabricius)是一种分布极广且寄主广泛的多食性害虫。属鳞翅目螟蛾科，曾是棉田中重要的食叶性害虫，大发生时，卷食棉叶，影响棉花的结铃和最终产量。由于有机磷杀虫剂的大量使用，该虫的为害渐轻。但近些年随着转基因棉花的大面积种植，化学杀虫剂用量的大幅度下降等原因，棉大卷叶螟在一些棉田的种群数量呈现上升趋势，为害日渐严重，甚至造成整株叶片卷曲或被食光，棉株仅留下枝、茎，严重影响棉花的现蕾开花及最后的产量，成为近几年我国长江中下游棉区棉花上较为重要的食叶性害虫。
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棉大卷叶螟在5月上、中旬平均气温达20°C时开始化蛹羽化。一、二代主要在木槿、苘麻等植物上繁殖为害，第三代开始迁移到棉田。8月中旬至9月下旬是棉大卷叶螟为害棉田的盛期，也是棉花受害最严重的时期。棉大卷叶螟具有很强的繁殖能力，每头雌蛾平均产卵180 260粒，最高达400粒，卵大多数散产于棉叶背面，以叶脉边缘分布较多。幼虫多在下午及夜间孵化，幼虫历期约为25天，初孵幼虫喜欢群集在叶片背面取食叶肉，留下表皮；进入2、3龄以后开始分散吐丝，将棉叶卷成喇叭状，并躲藏于卷叶内取食。大发生时，一张棉叶可被卷成2 3个喇叭筒，一般一个卷筒内仅有I头幼虫，且喜转移危害。在食源充足时棉大卷叶螟幼虫常不食光被卷的叶片即转移，食源匮乏或虫量较大时整株叶片被卷曲，大发生时叶片可被全部食光。由于棉大卷叶螟有吐丝卷叶为害的特性，普通农药对棉大卷叶螟的防治效果不甚理想，使得棉大卷叶螟的为害逐年加重。因此，能克隆到与卷叶螟吐丝相关的基因序列，对棉大卷叶螟的防治有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于阐明了昆虫丝腺泌丝因子的一种基因序列、氨基酸序列。本发明根据以往报道的外米缀蛾和大蜡螟轻链基因序列，设计引物，采用同源基因克隆策略和PCR技术，扩增中间片段，再根据测序结果，设计3’和5’引物，使用RACE法，分别扩增出3’和5’区段，测定序列后拼接成完整的基因序列，再使用ORF Finder分析得到棉大卷叶螟丝素蛋白基因轻链基因部分的开放阅读框。本发明所述的棉大卷叶螟丝素轻链基因序列如SEQ ID NO. I所示；该基因cDNA全长1087bp，自46bp至849bp区段为其开放阅读框，编码267个氨基酸(SEQ ID NO. 2)，5，非编码区长45个碱基，3’非编码区长238个氨基酸，有多聚核苷酸尾巴。由上述基因码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的棉大卷叶螟丝腺中的轻链基因序列,可在减轻棉大卷叶螟的吐丝卷叶危害中得到应用。所述的棉大卷叶螟丝腺中的轻链基因序列，可在靶标作物中导入该基因，作为转
基因素材。所述的棉大卷叶螟丝腺中的轻链基因序列，可作为其它众多农林吐丝害虫目的基因的参考。
图I是中间产物PCR检测结果；图2是中间片段胶回收结果；图3是菌液PCR检测结果； 图4是3 ’ RacePCR检测结果；图5是3’ Race胶回收结果；图6是3 ’ Race菌液PCR检测结果；图7是5 ’ RacePCR检测结果；图8是5’ Race胶回收结果；图9是5 ’ Race菌液PCR检测结果；图10是RT-PCR扩增结果；图11是酶切后结果的检测；图12 是 CTE927-1 表达 SDS-PAGE 图像；图13 是 CTE927-1SDS-PAGE 图像；图14 是 CTE927-1 转膜后 SDS-PAGE 图；图15 是 CTE927-1PVDF 膜图像。图I — 9中M为DL2000DNA分子量标准。
具体实施例方式实施例一l、Total RNA 的提取RNA的提取使用的是Promega公司的SV Total RNA Isolation System试剂盒,具体方法如下I)在一个无菌小离心管中加入ImL的RNA Lysis Buffer (加BME)。2)取越冬老熟棉大卷叶螟幼虫，放入装有液氮的研钵中，用研棒迅速研磨，研磨成白色粉末，等液氮挥发完后，立即把粉末转移到装有300 ii L的RNA Lysis Buffer的离心管中，颠倒几次，彻底混匀。3)向 300 ii L 裂解物中加入 350 y L 的 RNA Dilution Buffer (蓝色)，颠倒 3 — 4次混合。70°C，金属浴2. 5分钟。4) 12000rpm 离心 10 分钟。5)准备一个新的免RNA酶的离心管，用移液枪将离心好的澄清裂解液移到新的离心管中，避免吸到沉淀。6)向澄清裂解液中加入200 u L 95%乙醇，用移液枪吸放3_4次以混合。将此混合液转移到离心柱装配体中。12000rpm离心I分钟。7)从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中液体，将离心管柱装回收集管。加A 600 Ii L RNA Wash Solution于离心柱装配体，12000rpm离心I分钟。8)在无菌离心管中按顺序混合 40 U L Yellow Core Buffer, 5 U L0. 09M MnCl2,5 U LDNase I，像前次一样清空收集管，然后再装配体中加入50 y L配好的孵育液。9)于 20_25°C孵育 15 分钟。然后，向离心柱中加入 200ii L DNase Stop Solution,12000rpm离心I分钟。10)加入 600 u L RNA Wash Solution, 12000rpm 离心 I 分钟。11)清空收集管，向离心柱内加入250 ii L RNA Wash Solution于离心柱装配体.12000rpm离心2分钟。12)为每一个样品从袋中取出一个I. 5mL带盖洗脱管，从离心柱上扭掉盖子，放入I. 5mL带盖洗脱管中，向膜上加入50 ii L无核酸酶水。12000rpm离心I分钟。13)将离心柱转移到新的I. 5mL带盖洗脱管，向膜上加上50 y L无核酸酶水再洗一次。12000rpm离心I分钟。14)用分光光度计检测并进行电泳检测合格后，提取的Total RNA样品在_70°C低
温保存。2、RNA的反转录RNA 的反转录使用的是 TaKaRa 公司的 PrimeScript II 1st StrandcDNASynthesis Kit试剂盒,具体方法如下
I)在Microtube中配制下列混合液
Oligo tlT Primer C50|iM) I ^iLdNTP Mixture (I OmM each) ITotal RNA2
RNase free dH206 pL2) 65°C保温5min后置于冰上急冷(此处理可使模板RNA变性，提高反转录效率)3)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液
Jl述变性、退火后反应液IOnL
5 X PrimeScript Buffer4 pL
RNase Inhibitor (40U/J1L)O.SuL
PrimeScript II RTase (200U/|iL) IpL RNase Free dH204.5 pL4)缓慢混匀5)按下列条件进行反转录反应42 0C 60min70 °C 15min
6)取出所得的cDNA样品，冰上迅速冷却，_20°C保存，以备使用。3、引物的设计利用BLAST分析NCBI上已经登录的外米缀蛾(Corcyra cephalonica)和大腊螟(Galleria mellonella)轻链基因的保守区域，设计简并引物，Fib_L_Fl:5’ -AATGCTGCCCTTCGTTTT-3’(SEQIDN0. 6)，Fib-L-Rl: 5，-CACCWACGTTGTTACTGCG-3’ (SEQ ID NO. 7)用于扩增轻链的核心区域。4、基因中间片段的扩增基因中间片段扩增的反应体系为25y L :
cDNA (山笫.—JJ/所得)2,0|iL
IOpM I:游*jI物 Fib-L-Fl1.25|iL
IOpM I、'游丨物 Fib-L-Rl1,2.%L
2.5mM dNTP2 pL
IOxPCR Buffer Mg2' plus4.5pL
Taq 酶0.2pL
ddHiO13.8|iL将反应液混匀，放入PCR仪进行扩增，扩增参数为94°C预变性5min ;94°C变性30sec，根据引物确定各组引物的退火温度，退火30sec，72°C延伸2min，设定30个循环；最后72°C延伸IOmin0PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图I所示。5、胶回收切出的目的DNA片段放入I. 5mL的Microtube中，加入600 ii L的DR- I Buffer(Img凝胶视为I y L)，65°C加热使胶块完全融化，再加入DR- I Buffer量的1/2体积量的DR- II Buffer,均匀混合，离心，最后洗脱DNA，回收产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。。6、体外连接和转化在Microtube中配制下列混合液回收产物 4. 5 ii L连接载体pMD18-T0. 5u LSolution I5 U L混合液用枪头打匀后置于4°C冰箱中，反应4h后进行转化，转化产物均匀打在培养基平板上，37 °C培养箱过夜培养。7、菌落筛选和测序挑取单克隆，在LB液体培养基中过夜培养后，经菌液PCR检测后含有特异目的基因的阳性克隆菌液，结果如图3所示，样品送检测。8、序列分析利用DNAMAN和Primer5. 0对测序所得的中间片段序列进行分析，得到中间片段的序列 SEQ IDN0. 3 为
9、RACE法获取基因的3’和5’末端9. 13’和5’端引物的设计3’端上游特异性引物直接使用中间片段的前引物Fib-L-Fl 5’ -AATGCTGCCCTTCGTTTT-3’ (SEQ ID NO. 6)，5’端则重新设计了两条下游特异性引物，夕卜侧特异性引物 Fib-R-O :5’-GGCGACTTGAGCGATGAGG-3’ (SEQ ID NO. 8)，内侧特异性引物 Fib-R-I:5’ -TGGTCACCTCCATCTACGG-3’ (SEQ ID NO. 9)。9. 2RACE 法获取 3’ 端3’端的获得是通过TAKARA的3’ -Fu LI RACE Core Set Ver. 2. 0试剂盒所获得的，具体方法如下I)以第I步所得的棉大卷叶螟Total RNA为模板，使用3’RACE Adaptor引物(含有由TaKaRa独特设计的dT区域及Adaptor Primer部分)进行反转录反应,合成1st StrandcDNA。反应体系
权利要求
1.棉大卷叶螟丝素轻链基因，其特征在于，它的序列如SEQID NO. I所示。
2.一种棉大卷叶螟丝素蛋白，其特征在于它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.权利要求I所述的棉大卷叶螟丝素轻链基因在调控棉大卷叶螟的吐丝卷叶危害中的应用。
4.权利要求I所述的棉大卷叶螟丝素轻链基因在制备转基因作物中的应用。
5.权利要求I所述的棉大卷叶螟丝素轻链基因在克隆其它农林吐丝昆虫同源基因中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种调控鳞翅目昆虫——棉大卷叶螟(Syleptaderogata)的吐丝基因片段序列及用途。根据已报道的外米缀蛾(Corcyracephalonica)和大蜡螟(Galleriamellonella)丝素轻链基因序列，设计引物，通过RACE法，扩增出目的基因片段。该基因片段cDNA全长1087bp，自46bp至849bp区段为其开放阅读框，编码267个氨基酸。5’非编码区长45个碱基，3’非编码区长238个碱基。该基因片段对棉大卷叶螟的吐丝有重大影响，它的成功克隆及基因序列的测定为今后进一步研究与控制卷叶螟的吐丝卷叶为害奠定了重要基础。
文档编号C12N15/12GK102719442SQ20121023178
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者周勇, 杨益众, 梁国华, 王中阳, 苏宏华, 陈小军, 陈春霞 申请人:扬州大学