专利名称：禽传染性支气管炎病毒h120毒株的pcr检测引物及检测方法
技术领域：
本发明涉及禽类病毒检测技术领域，具体涉及禽传染性支气管炎病毒H120毒株的PCR检测弓I物及检测方法。
背景技术：
禽传染性支气管炎(IB)是由禽传染性支气管炎病毒 (IBV)引起的ー种急性、高度接触性传染病。在规模化饲养条件下，禽传染性支气管炎感染率很高，该病的死亡率为1(Γ30%，毎年造成的经济损失超过十亿元。Η120株是最早应用于预防IB的弱毒疫苗，也是目前应用最为广泛的IBV弱毒疫苗之一，基因分型属于IBV第V分支，其安全性好，毒カ稳定。由于生产中常用的禽传染性支气管炎疫苗一般为新支ニ联弱毒活苗，家禽体内在一段时间内都存在疫苗毒的活毒，因此临床上分离到的IBV有可能是疫苗毒，也有可能是野毒株。现阶段对于疫苗株和野生病毒株的区分方法是经过RT-PCR，扩增所得产物直接测序或者经过克隆之后测序，再经过序列分析才能得出结果，通常需要3 7天的时间，给IBV的快速检测带来不便。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供可以快速区分IBV 120株与其他野生株的RT-PCR引物。本发明的另ー目的是提供ー种IBV 120株的RT-PCR检测方法。本发明通过以下技术方案实现上述目的
禽传染性支气管炎病毒Η120毒株的RT-PCR检测引物，有两对，引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO: I 2和SEQ ID Ν0:3 4。这两对引物是根据IBV Η120毒株序列(Genbank :FJ888351)分别在SI基因和3’ -LTR基因设计的。一种禽传染性支气管炎病毒Η120毒株的RT-PCR检测方法，是以待检样品RNA为模板，用权利要求I所述的两对引物进行RT-PCR扩增，如果扩增产物片段分别为653bp和230bp，则待检样品中有禽传染性支气管炎病毒H120毒株。上述禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测方法中，PCR反应体系含有一步法 PCR 混合酶(PrimeScipt I Step Enzyme Mix)、缓冲液(2X1 Step Buffer)、SEQ IDNO: I 4所示引物、样品RNA和无RNA酶的水(RNase Free)。上述禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测方法中，RT-PCR的反应程序优选为
(1)逆转录50°C30min ；
(2)预变性92°C 4min ；
(3)变性94°C30sec ;退火55°C 30sec ;延伸72°C 45sec ;共进行 30 个循环；(4)延伸72°C IOrnin0 (min表示分钟，sec表示秒)。上述禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测方法，扩增的653bp目的片段为SI基因，核苷酸序列为SEQ ID NO: 5 ;230bp的目的片段为3’UTR基因，核苷酸序列为SEQ ID NO:6。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明的引物特异性高，且片段小，整个RT-PCR过程可以在疒2. 5小时内完成，不需要经过测序公司测序就能快速鉴定出IBV的H120疫苗毒株，为临床检测节省大量时间。
图I. RT-PCR检测野生毒株和疫苗株电泳结果，其中D为大华农新城疫、传染性支气管炎ニ联活疫苗(购自广东大华农动物保健品股份有限公司；生产批号201136) ；1 第五分支野毒；M DL2000 Marker。 图2. RT-PCR特异性验证电泳结果，其中1-4 :第一分支野毒；5_8 :第二分支野毒；
9-12 :第三分支野毒；13-16 :第四分支野毒；17-20 :第五分支野毒；M IOObp Marker ；D :大华农新支ニ联苗:哈兽研新支ニ联苗；N :阴性对照。
具体实施例方式实施例I
I试验材料
1.1主要试剂与仪器
AxyPrep 体液病毒 DNA/RNA 小量试剂盒(Cat No. AP-MN-BF-VNA-250), TaKaRaPrimeScript One step RT-PCR Kit Ver. 2 (TaKaRa Code:DRRO55A), Thermo 高速低温离心机，Thermo PCR 仪。I. 2 毒株
临床分离到的各分支IBV野毒株，大华农新城疫、传染性支气管炎ニ联活疫苗(H120株+Lasota株；购自广东大华农动物保健品股份有限公司；生产批号201136)，哈兽研大华农新城疫、传染性支气管炎ニ联活疫苗(商品名“新支匹克”;H120株+Lasota株；购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；生产批号110514)。I. 3引物设计
根据IBV H120毒株序列(Genbank FJ888351)分别在SI基因和3，-LTR基因各设计一对引物其中S1+S2为第一对引物，扩增部分SI基因，目的条带预期大小为653bp ；S3+S4为第二对引物，扩增部分3’-UTR基因目的条带预期大小为230bp。只有同时扩增出两条目的产物时，才可判定为H120毒株。引物序列丨扩增片段"""目的条带
序号大小
51TGGTGGTCGTGTTGTTAATG (SEQID NO:I)SI 基因 653bp
52TCTGGACACCACTAGGATTTG (SEQ IDH0:2)
53TTTCCAACTTAACATCATGGAC (SEQ ID N0:3)3:UTR.基因 230bp
54CTTCCTTGATTCTTATTGATACTCTA (SEQ ID N0:4)2试验方法
2.I RNA模板制备
使用AxyPr印体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(Cat No. AP-MN-BF-VNA-250)提取模板RNA，-70°C保存。2.2 PCR 反应
反应体系使用 TaKaRa PrimeScript One step RT-PCR Kit Ver. 2 (TaKaRaCode:DRR055A) PCR试剂盒，反应体系为50 μ L体系，具体如下
序号I组分I体积
1PrimeSciptIStepEnzymeMix2 μ L
22 XIStepBuffer25 μ L
3Sl(IOuM)^luL
4S2(10uM):1μ
5S3(10u Μ)^luL
6S4(10uM):1μ
7模板 RNA: Γ3 μ L (约 500ng)
8RNaseFree补足到 50 μ L
反应条件逆转录50°C 30min ;预变性92°C 4min ;扩增30个循环(包括变形94°C30sec ;退火55°C 30sec ;延伸72°C 45sec);最后延伸72°C IOmin0PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。3实验结果
经琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR反应获得的目的条带符合预期大小(图1)，大华农新支ニ联苗可以扩增出653bp和230bp两条带，而临床上分离到的第五分支野毒只出现230bp条带。图2显示RT-PCR特异性验证結果，显示只有大华农新支ニ联苗和哈兽研新支ニ联苗的扩增产物有两条条带，特异性高。
权利要求
1.禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测引物，其特征在于两对引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO: I 2和SEQ ID N0:3 4。
2.一种禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测方法，其特征在于以待检样品RNA为模板，用权利要求I所述的两对引物进行RT-PCR扩增，如果同时扩增出653bp和.230bp两个长度的目的片段，则说明待检样品中有禽传染性支气管炎病毒H120毒株。
3.根据权利要求2所述禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测方法，其特征在于PCR反应体系含有ー步法PCR混合酶、缓冲液、SEQ ID NO: Γ4所示引物、样品RNA和无RNA酶的水。
4.根据权利要求2所述禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测方法，其特征在于RT-PCR的反应程序为 (1)逆转录50°C30min ； (2)预变性92°C 4min ； (3)变性94°C30sec ;退火55°C 30sec ;延伸72°C 45sec ;共进行 30 个循环； (4)延伸72°CIOmin0
5.根据权利要求2所述禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测方法，其特征在于扩增的653bp目的片段为SI基因，核苷酸序列为SEQ ID NO: 5 ;230bp的目的片段为.3，UTR基因，核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
全文摘要
本发明公开了禽传染性支气管炎病毒H120毒株的PCR检测引物及检测方法，属于禽类病毒检测技术领域。本发明的检测引物为两对，核苷酸序列分别为SEQIDNO:1~2和SEQIDNO:3~4。使用该两对引物，用待检样品的RNA为模板进行RT-PCR扩增，如果同时扩增出653bp和230bp两条目的产物，即可判定待检样品中含有IBVH120毒株。本发明的引物特异性高，且片段小，整个RT-PCR过程可以在2~2.5小时内完成，不需要经过测序公司测序就能快速鉴定出IBV的H120疫苗毒株，为临床检测节省大量时间。
文档编号C12N15/11GK102719567SQ20121023131
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者王峰 申请人:广东温氏食品集团有限公司