专利名称：人游离dna完整性的检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种人游离DNA完整性的检测方法。
背景技术：
游离DNA是ー种无细胞状态的胞外DNA，可存在于血液、脑脊液、胸腹水等体液中。正常人体内游离DNA主要由细胞凋亡后释放入循环系统，通过此途径释放的游离DNA由于经过程序化酶切后，大部分DNA片段大小都在185-200bp之间。与之相反，通过细胞坏死、裂解和主动释放等途径外排出的DNA片段，大小在200-400bp之间。寻求快速、准确的人游离DNA完整性检测方法是现阶段亟待解决的问题
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确、方便的人游离DNA完整性的检测方法。本发明的技术解决方案是ー种人游离DNA完整性的检测方法，其特征是包括下列步骤(I)引物设计用引物设计软件针对人类ALU序列分别设计长、短片段的引物，引物序列为
引物名称上游引物ド游引物
_7]5'-CCT GAG GTC AGG AGT TCG 5'-CCC GAG TAG CTG GGA TTA CA
M L-I 15bp
AG-3’-3,
ALlJ-247bp 5,-GTG GCT CAC GCC TGT AAT C S1-CAG GCT GGA GTG CAG TGG -3'
_3,其中ALU-115bp对应的扩增产物为短片段产物，大小为115bp ；ALU-247bp对应的扩增产物为长片段产物，大小为247bp ；(2)提取人游离DNA;(3)采用步骤(I)设计的两对引物对步骤(2)提取的样本分别进行实时荧光PCR检测。步骤(2)具体方法为取人血清样本200 ii I，采用试剂盒提取游离DNA。步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为20 ii 1，包括SYBR'V’ PremixEx TaqTM (2X ) IOu I, ROX Reference Dye II (50X ) 0. 4 ii 1，步骤(I) 10 ii M 上游引物0. 4iil，步骤(I) 101^下游引物0.4111，0嫩模板2.0111，灭菌双蒸水6.8111。步骤(3)中，实时荧光PCR检测的反应程序为95°C预变性30sec，95°C变性5sec，60で退火31 sec，72で延伸32sec，循环40次。本发明针对人类ALU重复序列设计特异性长、短片段引物，建立人类ALU重复序列的长、短片段的实时荧光定量PCR检测方法，可以快速、准确检测人游离DNA完整性。
下面结合附图和实施例对本发明作进ー步说明。图I是本发明的引物ALU-115bp和ALU-247bp在人ALU基因上的位置示意图。图2是待测样本DNA的ALU-247bp实时荧光PCR扩增曲线。图3是待测样本DNA的ALU_247bp实时荧光PCR溶解曲线。
图4是基因组DNA标准品倍比稀释获得的标准曲线。
具体实施例方式
权利要求
1.ー种人游离DNA完整性的检测方法，其特征是包括下列步骤 (1)引物设计 用引物设计软件针对人类ALU序列分别设计长、短片段的引物，引物序列为
2.根据权利要求I所述的人游离DNA完整性的检测方法，其特征是步骤(2)具体方法为取人血清样本200 u I，采用试剂盒提取游离DNA。
3.根据权利要求I或2所述的人游离DNA完整性的检测方法，其特征是步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为20 iil，包括S YBRwPremix Ex TaqTM (2X)10u I,ROX Reference Dye II (50 X )0. 4 y 1，步骤(I) 10 y M 上游引物 0. 4 y 1，步骤(I) 10 y M 下游引物0. 4 ill，DNA模板2. 0 ill，灭菌双蒸水6. 8 ill。
4.根据权利要求3所述的人游离DNA完整性的检测方法，其特征是步骤(3)中，实时荧光PCR检测的反应程序为95°C预变性30sec，95°C变性5sec，60°C退火31sec，72°C延伸32sec，循环40次。
全文摘要
本发明公开了一种人游离DNA完整性的检测方法，包括引物设计、提取人游离DNA、采用引物对提取的样本进行实时荧光PCR检测。本发明针对人类ALU重复序列设计特异性长、短片段引物，建立人类ALU重复序列的长、短片段的实时荧光定量PCR检测方法，可以快速、准确检测人游离DNA完整性。
文档编号C12Q1/68GK102732631SQ201210230830
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者吕成林, 吴信华, 戚菁, 施炜, 施维, 景蓉蓉, 朱慧, 王志伟, 申娴娟, 陆玉华, 陈建, 鞠少卿 申请人:南通大学附属医院