专利名称：焦磷酸测序法检测k-ras基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测K-RAS基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
抗表皮生长因子受体的单克隆抗体(如西妥昔单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗等)可与表达于正常细胞和多种癌细胞表面的EGF受体特异性结合，并竞争性阻断EGF和其他配体，如a转化生长因子(TGF-a )的结合。分别是针对EGF受体的IgGl和IgG2单克隆抗 体，两者特异性结合后，通过对与EGF受体结合的酪氨酸激酶(TK)的抑制作用，阻断细胞内信号转导途径，从而抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞的凋亡，减少基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子的产生。吉非替尼是一种选择性表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂，该酶通常表达于上皮来源的实体瘤。对于EGFR酪氨酸激酶活性的抑制可妨碍肿瘤的生长，转移和血管生成，并增加肿瘤细胞的凋亡。K-ras基因定位于人类染色体12p，编码一种具有GTP酶活性的小G蛋白，是表皮生长因子受体(EGFR)功能信号的下游分子，在膜受体到腺苷环化酶信号传导中起重要作用。现有的研究显示，90%的K-ras基因突变位于2号外显子的第12和13密码子位点，其中第12位密码子(约82%)是结直肠癌中最常见的突变位点，这种K-ras基因催化活性区的突变，导致Ras蛋白不依赖EGFR/HER受体激活而持续活化。此时EGFR抑制剂或单克隆抗体虽然阻滞EGFR激活信号的下传，但是KRAS突变不依赖上游EGFR信号的持续激活，使得下游信号仍处于激活状态，肿瘤细胞表现对EGFR抑制剂或单克隆抗体的拮抗作用，即不敏感。根据上述遗传药理学的研究发现，美国食品及药品监督管理局(FDA)在2009年修改靶向药物的使用说明，其中明确阐述了抗表皮生长因子受体的单克隆抗体药效与K-RAS基因密切相关性，并要求使用该类药物前进行K-RAS基因突变检测以帮助医生判断适用人群。而我国食品及药品监督管理局(SFDA)也于同年召开靶向药物基因检测听证会，且于2010年发布的《结直肠癌诊疗规范》中明确指出K-ras基因检测的必要性。综上所述，对K-RAS基因第2号外显子第12号密码子以及13号密码子多态性进行分型检测可预测患者对抗表皮生长因子受体的单克隆抗体的反应性，为临床医生给结直肠癌制定药物治疗方案提供依据。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测K-RAS基因多态性的试剂盒将为抗表皮生长因子受体的单克隆抗体的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
K-RAS基因(SEQ ID NO. I)多态性是影响抗表皮生长因子受体的单克隆抗体能否使用的最主要因素。本发明提供一种临床检测使用抗表皮生长因子受体的单克隆抗体生物标志物的用药基因K-RAS多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测抗表皮生长因子受体的单克隆抗体个体化用药相关基因多态性。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为
所述焦磷酸测序法检测K-RAS基因多态性的试剂盒，包括如下引物
(1)扩增引物
K-RAS第2号外显子12号密码子、13号密码子上游引物5’ -TGA CTG AAT ATAAAC TTG TGG TAG TTG -3’ (SEQ ID NO. 2)；
K-RAS第2号外显子12号密码子、13号密码子下游引物5’ - TCG TCC ACA AAA TGA TTC TGA A -3’ (SEQ ID NO. 3)；
其中，下游引物的5’进行生物素标记；
(2)测序引物
K-RAS第2号外显子12号密码子、13号密码子测序引物5’ - CTT GTG GTA GTT GGAGCT -3’ (SEQ ID NO. 4)；
在实际应用中，可以对上述引物作适当改变，只要保证设计的引物与上述引物同源性达95%以上即可；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。所述应用上述试剂盒检测K-RAS基因多态性的方法，包括如下步骤
(1)DNA 提取；
(2)聚合酶链反应
配制 50 ill PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 5 u I, dNTP 3. 0 yl，上游引物 I yl，下游引物I U 1，rTaql yl，水37. 0 yl，模板2. 0 iU ;按照下面的循环参数设置扩增仪95
V5min预变性；然后依次在95°C 30S,50°C 30S,72°C 30S，进行40个循环；再在72°C保持7min,最终保持在4 V，得扩增产物；
(3)焦磷酸测序单链样本纯化；
(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明试剂盒对K-ras基因检测的第2号外显子12号密码子、13号密码子目标序列:野生型GG T GG CGT (SEQ ID NO. 5)和突变型NNNNCGT (SEQ ID NO. 6);扩增出的片段长为91bp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对抗表皮生长因子受体的单克隆抗体个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上抗表皮生长因子受体的单克隆抗体个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明K-RAS第2号外显子12号、13号密码子均为野生型焦磷酸测序结果；图2为本发明K-RAS第2号外显子12号密码子为突变型、13号密码子为野生型焦磷酸测序结果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :
K-RAS第2号外显子12号密码子、13号密码子上游引物5’ -TGA CTG AAT ATAAAC TTG TGG TAG TTG -3’ (SEQ ID NO. 2)；
K-RAS第2号外显子12号密码子、13号密码子下游引物5’ - TCG TCC ACA AAATGA TTC TGA A -3’ (SEQ ID NO. 3)；
其中，下游引物的5’进行生物素标记；
K-RAS第2号外显子12号密码子、13号密码子测序引物5’ - CTT GTG GTA GTT GGAGCT -3’ (SEQ ID NO. 4)；
I. DNA提取
I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下
(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V ; (2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；
I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6盖上Eppendorf管盖，室温孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室温离心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；
I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；
1.11移取30011]^ Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；
I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；
I.14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析
出；
I.15 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I.16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；
I.17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
I.18 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；
I. 20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；
I. 21目测沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；
1.24保存核酸标本至4°C冰箱；
2.聚合酶链反应
2.I在试剂准备区配制50 Ul PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
IOxPCRbiiffer5 鄭I
权利要求
1.一种焦磷酸测序法检测K-ras基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物 (1)扩增引物上游引物5’ - TGA CTG AAT ATA AAC TTG TGG TAG TTG -3’ ；下游引物5’ - TCG TCC ACA AAA TGA TTC TGA A-3，；其中，下游引物的5’进行生物素标记； (2)测序引物:5，-CTT GTG GTA GTT GGA GCT -3’。
2.一种应用权利要求I所述的试剂盒检测K-RAS基因多态性多态性的方法，包括如下步骤 (1)DNA 提取； (2)聚合酶链反应 配制 50 ill PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 5 u I, dNTP 3. 0 yl，上游引物 I yl，下游引物Iu 1，1^&(11111，水37111，模板2.0111 ;按照下面的循环参数设置扩增仪95 V5min预变性；然后依次在95°C 30S, 50°C 30S, 72°C 30S，进行40个循环；再在72°C保持7min,最终保持在4°C，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测抗表皮生长因子受体的单克隆抗体个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。具体是指K-ras基因第2号外显子第12号密码子以及13号密码子多态性。试剂盒包含如SEQIDNO.3—4所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量对K-ras基因突变进行检测，从而达到对抗表皮生长因子受体的单克隆抗体(如西妥昔单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗等)用药实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102796815SQ201210230460
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏