专利名称：一种组织工程化人牙根植入材料的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及口腔和生物医学领域，尤其涉及一种组织工程化人牙根植入材料的制备方法及其用途。
背景技术：
牙体组织分为牙冠部和牙根部。牙根部位于龈下，依靠于牙周组织的良好附着，将牙齿固定于牙槽窝内，行使咀嚼功能。临床牙根发育异常可引起牙根过短甚至无牙根，导致牙齿过早脱落，影响咀嚼功能、身体健康以及其后的修复治疗。常见的修复治疗存在着不同程度的缺点，如可摘义齿固位差，有异物感，影响发音及不利于口腔卫生的维护等。而固定义齿，虽然美观，又以磨除健康的临牙牙体组织为代价。近年来，随着种植技术的发展，一定程度上可以弥补传统修复方式的不足。虽然种植体能较大程度地恢复牙齿功能，无异物感，不需磨除牙体组织等优点，但是种植体与牙槽骨之间进行骨结合，没有任何牙周组织附着， 与正常的牙体组织结构仍存在一定差距，常易引发牙周组织疾病。生物性牙根再生的研究进展使牙根发育、牙根再生成为研究的热点。组织工程牙根是利用自体的种子细胞，复合可降解的生物材料和信号分子等来获得有功能的牙体组织。随着人类发展进化，第三磨牙又称智齿，常因生长空间不足或萌出不全，而被拔出。2006年Sonoyama W等成功分离出根尖牙乳头干细胞(SCAPs),其是ー种成体干细胞,从正在发育的第三磨牙根尖牙乳头分离得来。SCAPs在牙根诱导成形、牙髓/牙本质再生以及生物性牙根再生方面具有很大的临床应用前景。将SCAPs接种到预制有一定形状的磷酸三钙支架(TCP)材料上，并以复合有牙髓干细胞的胶原海绵将其包裹，整体移植到小型猪的下颌切牙拔牙窝内，3个月后CT检查结果表明移植物有矿化组织形成，之后将其与人造烤瓷冠镶嵌恢复牙齿结构，四周后可行使咀嚼功能。因此，SCAPs是ー种很好的牙组织工程种子细胞，可用于牙髓再生/牙本质再生、以及生物性牙根再生，具有良好的临床应用前景。本文中涉及部分材料用语及材料来源解释如下Blasticidin (灭痕素)；a-MEM(购自Gibco);入门载体p-ENTR (购自于invitrogen公司)；慢病毒表达质粒pLenti6. 3/v5-DEST (购自于 invitrogen 公司)；opti-medium (最佳培养基)；Lipofectamine (转染试剂)。
发明内容
本领域迫切需要开发安全性高，组织相容性好，且具有生物学功能的组织工程化人牙根，本发明的目的在于提供一种组织工程化牙根植入材料的制备方法其用途，该制备方法操作简便，制备出的牙根植入材料免疫反应小，并能够在人牙根制备中应用。为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案予以解决。技术方案一一种组织工程化人牙根植入材料的制备方法，包括如下步骤(I)人的根尖牙乳头干细胞的分离、培养及鉴定；
(2) NFIC慢病毒载体的构建；(3) NFIC慢病毒载体转染的根尖牙乳头干细胞的制备和过表达NFIC的细胞系的筛选，矿化诱导该细胞系；(4)将矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料共同孵育。本发明进一步优选技术方案在于，所述步骤(I)中人的根尖牙乳头干细胞的分离、培养及鉴定；其具体为首先，取新鲜拔除的人第三磨牙牙根，取其根尖牙乳头组织，采用胶原酶消化法原代培养，细胞培养液为含体积比为20%胎牛血清的a-MEM，培养根尖牙乳头细胞；然后，将培养出的根尖牙乳头细胞单克隆、筛选，扩大培养后获得根尖牙乳头干细胞；最后，将根尖牙乳头干细胞通过单克隆抗体STR0-1鉴定，流式细胞仪分析细胞表型。
本发明进一步优选技术方案在于，所述步骤(2)中过NFIC慢病毒载体的构建，其具体为首先，克隆人的NFIC全长序列，连接入入门载体p-ENTR，构建p-ENTR-NFIC，测序鉴定；然后，将p-ENTR-NFIC与慢病毒表达质粒pLenti6. 3/v5-DEST重组反应，构建真核表达载体 pLenti6. 3/v5_NFIC,测序鉴定。本发明进ー步优选技术方案在干，所述步骤(3)中NFIC慢病毒载体转染的根尖牙乳头干细胞的制备和过表达NFIC的细胞系的筛选，矿化诱导该细胞系，具体为用真核表达载体pLenti6. 3/v5_NFIC转染根尖牙乳头干细胞,用抗生素Blasticidin以4ug/ml的浓度筛选一周，以获得稳定转染NFIC的根尖牙乳头干细胞系，将其密度调整至I XlO6MA矿化诱导液中培养I周，所述矿化诱导液为含有体积比为10%胎牛血清和浓度比50mg/L维生素C的a -MEM培养液。本发明进一步优选技术方案在于，所述步骤(4)中将矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料共同孵育，具体为对矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系，用无菌刀片沿培养皿边缘将其整张膜片掀起，离心后，倒上清，加入a -MEM浸润，吹打后，与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料37°C共孵育2h，离心。本发明进一步优选技术方案在于，还包含模拟植入载体的制备，所述模拟植入载体的制备指取新鲜拔出人的第三磨牙，在无菌条件下取牙根部，制备成6-7mm长的片段，将牙根管扩大至1-2. 5mm直径，将制备的组织工程化人牙根植入材料置入牙根片断。技术方案ニ上述方法制备的组织工程化人牙根植入材料在人牙根制备中的用途。技术方案三人的NFIC全长序列在促进根尖牙乳头干细胞矿化中的用途。本发明在体外培养自体细胞和牙本质片段，通过过表达转录因子NFIC，然后复合支架材料，构建组织工程化牙根植入材料，组织工程化牙根植入材料能较大程度地恢复牙齿功能，无异物感，不需磨除牙体组织。本发明的组织工程化牙根植入材料制备中采用的转录因子NFIC，其过表达NFIC能促进SCAPs体外矿化能力的显著提高，取得了意料不到的技术效果，其结果明显优于现有的促进SCAPs体外矿化能力的各种手段。另外过表达NFIC促进SCAPs体外成牙分化的能力非常強，明显优于一般的技术手段。
图I为本发明中过表达NFIC的SCAPs细胞与对照组体外茜素红染色的结果显示图。图2为本发明中过表达NFIC的SCAPs细胞与对照组体外茜素红染色定量结果的显示图，其中，纵坐标表示吸光度(0D)560值，横坐标表示測量时间分别为4天、7天、14天、21天。图3为本发明中过表达NFIC的SCAPs细胞与对照组蛋白印迹DSPP (牙本质涎磷蛋白)抗体显示图；结果说明过表达NFIC能促进SCAPs体外成牙分化的能力非常強。
图4为过表达NFIC的SCAP细胞与对照组体外碱性磷酸酶的检测结果图，其中，纵坐标表示吸光度(0D)520值，横坐标表示測量时间分别为4天、7天、10天、14天；结果说明过表达NFIC+矿化组碱性磷酸酶的表达量明显高于对照组。图5为本发明过表达NFIC的SCAP细胞与对照组体外茜素红染色显微镜(放大倍数40倍)下观察的照片图，其中，图5A和图5B为茜素红染色4天后显微镜下观察結果，图5A为对照加矿化组，图5B为过表达NFIC加矿化组；图5C和图为茜素红染色21天后显微镜下观察結果，图5C为对照加矿化组，图为过表达NFIC+矿化组；结果显示图5B和图显示的矿化能力明显高于图5A和图5C显示的矿化能力。
具体实施例方式下面对本发明的实施例进行说明，实施例不构成对本发明的限制。本发明制备组织工程化人牙根植入材料，包括如下步骤(I)人的根尖牙乳头干细胞的分离、培养及鉴定，其具体为首先，取新鲜拔除的人第三磨牙牙根，取其根尖牙乳头组织，采用胶原酶消化法原代培养，细胞培养液为含体积比为20%胎牛血清的a -MEM，培养根尖牙乳头细胞；然后，将培养出的根尖牙乳头细胞单克隆、筛选，扩大培养后获得根尖牙乳头干细胞；最后，将根尖牙乳头干细胞通过单克隆抗体STR0-1鉴定，流式细胞仪分析细胞表型。上述步骤的具体实验例为取新鲜拔出的第三磨牙，放入无菌磷酸盐缓冲液PBS中，冰上运输保存，在拔出后I小时内将离体牙放在无菌培养皿中，用含抗生素的无菌的磷酸盐缓冲液PBS反复冲洗以去除污物,所述抗生素为100U/ml青霉素和100iig/ml链霉素；用无菌手术刀切除根尖牙乳头，在无菌PBS中剪碎，吸入至离心管中，1000转离心5min，反复离心3次，加入I型胶原酶，其体积为牙乳头体积的20-30倍，37°C恒温箱中放置50分钟，每隔15分钟取出吹打一次，使其组织尽可能分散；50分钟后取出，离心，倒上清，加入含体积比5%血清的培养液洗掉组织上的I型胶原酶，吹打，离心，倒上清，加入含体积比20%胎牛血清的a-MEM，过细胞筛，制备单细胞悬液，接种培养；取对数生长期的第一代细胞接种于96孔培养板中，调整细胞密度至10 15个/孔，添加内含体积比15%胎牛血清的a -MEM培养基至IOOiU/孔；培养12h后标记培养板中含单个细胞的孔，并补含体积比20%胎牛血清的a -MEM至200 U I/孔进行培养，待克隆长至孔底面积80%后，取多个克隆培养的根尖牙乳头干细胞混合，胰酶消化，扩大培养。细胞鉴定标准贴壁根尖牙乳头干细胞伸展后呈成纤维样细胞，体积较小，胞体丰满，胞核位于中央，形态均一；细胞免疫组化结果显示抗STR0-1阳性；抗波形丝蛋白染色阳性；角蛋白染色阴性。(2) NFIC慢病毒载体的构建，其具体为首先，克隆人的NFIC全长序列，连接入入门载体P-ENTR，构建p-ENTR-NFIC，测序鉴定；然后，将p-ENTR-NFIC与慢病毒表达质粒pLenti6. 3/v5_DEST重组反应,构建真核表达载体pLenti6. 3/v5_NFIC,测序鉴定。上述步骤的具体实验例为首先，克隆人的NFIC基因的时候，在GenBank中检索人NFI-C mRNA (NM_205843. I)的全长序列，以软件分析设计ー对引物(上游序列5’_ccggatccgccaccatgtattcgtccccgctctgcc-3 ；卜游序ダ丨」:5J -ccgaattcctatcccagataccaggacggtc-3’)，以人牙髓组织DNA为模板扩增目的片段，连接入购自于invitrogen公司的入门载体P-ENTR,构建p-ENTR-NFIC，测序鉴定；然后，将p-ENTR-NFIC与购自于invitrogen公司的慢病毒表达质粒pLenti6. 3/v5-DEST重组反应，构建真核表达载体pLenti6. 3/v5-NFIC,测序鉴定。(3) NFIC慢病毒载体转染的根尖牙乳头干细胞的制备和过表达NFIC的细胞系的筛选，矿化诱导该细胞系，具体为用真核表达载体pLenti6. 3/V5-NFIC转染根尖牙乳头干 细胞，用抗生素Blasticidin以4ug/ml的浓度筛选一周，以获得稳定转染NFIC的根尖牙乳头干细胞系，将其密度调整至IX 106/ml，在矿化诱导液中培养I周，所述矿化诱导液为含有体积比为10%胎牛血清和浓度比50mg/L维生素C的a -MEM培养液。上述步骤的具体实验例为转染前一天，以2X 105/ml的密度接种人胚肾293T细胞于60mm培养皿中，其培养液为含体积比10%胎牛血清的a-MEM培养液，不含抗生素；次日，用 500ul 的 opti-medium 稀释 20ul 的转染试剂 Lipof ectamine2000,另取 500ul 的opti-medium稀释4ug构建的慢病毒载体pLenti6. 3/v5_NFIC、3ug包装质粒PAX、Iug包膜质粒PMD，室温静置5分钟；将两者混合，室温静置20分钟后，加入4ml含有人胚肾293T细胞的a -MEM培养液；48小时后，收集人胚肾293T细胞上清，0. 45um滤膜过滤，分装后保存在病毒管中，-80摄氏度长期保存备用；将收集的人胚肾293T细胞上清与正常培养液(含体积比10%胎牛血清的a -MEM培养液，含抗生素)，以1:1的比例感染生长状态良好的根尖牙乳头干细胞，48小时后换正常培养液；次日，用抗生素Blasticidin以4ug/ml的浓度筛选一周，以获得稳定转染NFIC的根尖牙乳头干细胞系，将其密度调整至IX 106/ml，在矿化诱导液中培养I周，所述矿化诱导液是指含有体积比为10%胎牛血清和浓度比50mg/L维生素C的a-MEM培养液。(4)将矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料共同孵育，具体为对矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系，用无菌刀片沿培养皿边缘将其整张膜片掀起，离心后，倒上清，加入a -MEM浸润，吹打后，与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料37°C共孵育2h，离心。依照背景技术中Sonoyama W5等人的技术方案,设计移植实验。首先,模拟植入载体的制备，所述模拟植入载体的制备指取新鲜拔出人的第三磨牙，在无菌条件下取牙根部，制备成6-7mm长的片段，将牙根管扩大至1_2. 5mm直径，将制备的组织工程化人牙根植入材料置入牙根片断。然后，取4-8月大的小型猪，以6mg/ml的氯胺酮和0. 6mg/ml赛拉嗪麻酔后，拔除小型猪的切牙，取上述含过表达NFIC根尖牙乳头干细胞与支架材料复合物的牙根片段，植入牙槽窝内，缝线缝合。对照组用正常SCAPs复合支架材料的牙根片段。3月后取标本，4%多聚甲醛固定，梯度脱水，石蜡包埋，切片，行HE染色。观察骨组织形成情況。
结果显示过表达NFIC促进SCAPs体外成牙分化的能力非常強，明显优于一般的技术手段；即本发明的饿组织工程化人牙根植入材料体外成牙分化的能力显著优于正常SCAPs复合支架材料。此外，结合图I-图5，我们发现，图I和图2说明了通过过表达转录因子NFIC，根尖牙乳头干细胞(SCAPs)体外茜素红染色明显强于对照组，定量分析结果显示与对照组染色有差异，表明过表达NFIC能促进根尖牙乳头干细胞体外矿化的能力非常强，取得了意料不到的技术效果，结果明显优于以往的促进SCAPs体外矿化能力的各种手段。图3中蛋白印迹结果显示，通过过表达转录因子NFIC的SC APs与对照组相比，高表达成牙本质细胞特异性蛋白DSPP，说明过表达NFIC能促进SCAPs体外成牙分化的能力非常強，明显优于一般的技术手段。图4结果说明，过表达NFIC+矿化组碱性磷酸酶的表达量明显高于对照组。图5结果显示，图5B和图显示的矿化能力明显高于图5A和图5C显示的矿化能力。以上结果证明，人的NFIC全长序列在促进根尖牙乳头干细胞矿化中作用显著。。以上描述和显示了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。
权利要求
1.一种组织工程化人牙根植入材料的制备方法，包括如下步骤 (1)人的根尖牙乳头干细胞的分离、培养及鉴定； (2)NFIC慢病毒载体的构建； (3)NFIC慢病毒载体转染的根尖牙乳头干细胞的制备和过表达NFIC的细胞系的筛选，矿化诱导该细胞系； (4)将矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料共同孵育。
2.根据权利要求I所述的组织工程化人牙根植入材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中人的根尖牙乳头干细胞的分离、培养及鉴定；其具体为首先，取新鲜拔除的人第三磨牙牙根，取其根尖牙乳头组织，采用胶原酶消化法原代培养，细胞培养液为含体积比为20%胎牛血清的a -MEM,培养根尖牙乳头细胞；然后，将培养出的根尖牙乳头细胞单克隆、筛选，扩大培养后获得根尖牙乳头干细胞；最后，将根尖牙乳头干细胞通过单克隆抗体STRO-I鉴定，流式细胞仪分析细胞表型。
3.根据权利要求I所述的组织工程化人牙根植入材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中过NFIC慢病毒载体的构建，其具体为首先，克隆人的NFIC全长序列，连接入A门载体p-ENTR，构建p-ENTR-NFIC，测序鉴定；然后，将p_ENTR_NFIC与慢病毒表达质粒pLenti6. 3/v5_DEST重组反应,构建真核表达载体pLenti6. 3/v5_NFIC,测序鉴定。
4.根据权利要求I所述的组织工程化人牙根植入材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中NFIC慢病毒载体转染的根尖牙乳头干细胞的制备和过表达NFIC的细胞系的筛选，矿化诱导该细胞系，具体为用真核表达载体pLenti6. 3/V5-NFIC转染根尖牙乳头干细胞，用抗生素Blasticidin以4ug/ml的浓度筛选一周，以获得稳定转染NFIC的根尖牙乳头干细胞系，将其密度调整至IX 106/ml，在矿化诱导液中培养I周，所述矿化诱导液为含有体积比为10%胎牛血清和浓度比50mg/L维生素C的a -MEM培养液。
5.根据权利要求I所述的组织工程化人牙根植入材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中将矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料共同孵育，具体为对矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系，用无菌刀片沿培养皿边缘将其整张膜片掀起，离心后，倒上清，加入a -MEM浸润，吹打后，与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料37°C共孵育2h，离心。
6.根据权利要求I所述的组织工程化人牙根植入材料的制备方法，其特征在于，所述组织工程化人牙根植入材料在人牙根制备中的用途。
7.人的NFIC全长序列在促进根尖牙乳头干细胞矿化中的用途。
全文摘要
本发明涉及口腔和生物医学领域，尤其涉及一种组织工程化人牙根植入材料的制备方法及其用途。该组织工程化人牙根植入材料的制备方法，包括如下步骤一种组织工程化人牙根植入材料的制备方法，包括如下步骤(1)人的根尖牙乳头干细胞的分离、培养及鉴定；(2)NFIC慢病毒载体的构建；(3)NFIC慢病毒载体转染的根尖牙乳头干细胞的制备和过表达NFIC的细胞系的筛选，矿化诱导该细胞系；(4)将矿化诱导后的过表达NFIC的细胞系与羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料共同孵育。该制备方法操作简便，制备出的牙根植入材料免疫反应小，并能够在人牙根制备中应用。
文档编号C12N15/86GK102755667SQ20121023080
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者付蕾, 何文喜, 余擎, 吕海鹏, 屈铁军, 张婧, 张菁, 朱庆林, 王志华, 罗志荣 申请人:中国人民解放军第四军医大学