源于稻瘟病菌的真菌致病性基因MoMon1及其用途的制作方法

专利名称：源于稻瘟病菌的真菌致病性基因MoMon1及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病理学和微生物基因工程领域，提供了一个来源于稻瘟病菌的、在营养生长、孢子产生、附着胞形成、自噬过程与致病性中起重要作用的新基因MoMonl的编码区的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列。
背景技术：
由稻痕病菌(Magnaporthe Oryzae)引起的稻痕病是世界性的一种水稻上的毁灭性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻产量损失在1(T30% 之间。我国几乎每年都有稻瘟病菌的流行爆发。最近的2005年，四川省和重庆市遭受到10年来最严重的稻瘟病，四川省共有20个市、127个县的230万亩稻田发生稻瘟病，重庆市共有100多万亩稻田发生稻瘟病菌；这次稻瘟病流行迅速、危害程度重、发病水稻品种多、对水稻产量影响严重。除了水稻外，稻痕病菌也能侵染其它50多种禾本科植物,也对小米(Eleusine coracana)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)等重要农作物造成严重的危害。稻痕病菌也是一种研究植物病原真菌一寄主植物相互作用的模式生物，具有许多病原真菌共有的植物致病侵染循环，包括孢子产生、萌发、附着胞形成、侵染栓形成、侵入菌丝生长等致病过程；许多发达国家正在进行研究其致病分子机制，期望通过此类研究设计出新型农药筛选的药靶，从而开发、设计新型抗真菌药物。稻瘟病菌的生活史包括有性阶段和无性阶段。有性阶段由2个不同交配型的菌株交配后产生子囊和子囊孢子。稻瘟病菌的交配型由交配基因MATl — I和MATl — 2控制。无性阶段为营养菌丝分化产生分生孢子梗和梨形分生孢子。在自然界，稻瘟病菌主要通过无性阶段完成生活史，而分生孢子是植物的主要侵入源。稻瘟病菌无性孢子落到水稻叶片表面后，侵染过程开始。当孢子与水相遇后，孢子顶端分隔内的粘胶释放出来，使孢子紧紧粘附在水稻叶片表面。水稻叶片表面具有一层蜡质角质膜，该膜具有很大的疏水性，而粘胶使孢子粘附在这一疏水的排斥性表面。粘附后2小时内，孢子萌发并产生芽管。芽管通常从孢子的一个顶端细胞伸出并生长。芽管顶端也分泌一种粘胶物质，使芽管紧紧粘附在植物叶片表面，防止被水滴冲走。4小时内，芽管生长停止，顶端钩状体形成并膨大形成附着胞。基质的硬度是芽管分化的一个重要因子，如稻瘟病菌孢子仅在硬的固体表面形成附着胞，而不能在液体表面或软基质表面形成附着胞。而基质疏水表面也通过类似于水稻叶片表面的蜡质的作用激发附着胞的形成。在孢子萌发后不久，产生芽管的细胞进行一次有丝分裂。一个细胞核留在孢子内，而另一个细胞核通过芽管移动，与孢子和芽管的细胞质内容物一起转移到形成中的附着胞。这些细胞质内容物包括储存在正在发育的附着胞中央大液泡的脂滴。然后，在附着胞和芽管之间形成隔膜。随着附着胞成熟，附着胞细胞壁出现黑色素沉积，最终形成黑色素层。黑色素层允许水分子自由通过，但溶解于水的物质不能自由通过，从而让附着胞建立并维持一个很大的细胞内膨压。附着胞的黑色素化过程完成后，附着胞产生一根狭小的菌丝一侵染栓。侵染栓对水稻叶片的穿透由于附着胞产生巨大的膨压而得以完成。膨压只要稍微降低就会阻止附着胞在人工表面或水稻叶片表面穿透。测量结果表明附着胞膨压达到8. OMpa，相当于40倍汽车轮胎的压力。附着胞黑色素层的作用在于限制了细胞壁的渗透性，有利于细胞内渗透物质的积累和膨压的产生。甘油是一种可溶性物质，产生的渗透势足以使附着胞产生巨大的膨压。在膨压产生过程中，甘油在细胞内累积浓度超过3M。侵入后，侵染栓分化成侵染菌丝，迅速在水稻叶片内生长并侵染其它细胞。侵入72小时后，病原菌生物量已经达到感染叶片的10%。5 7天后，分生孢子梗上分化出大量新的分生孢子，并从病斑释放出来。这些新形成的孢 子被潮湿的空气带到邻近的植物开始新的侵染过程。在冬天，稻瘟病菌以菌丝和分生孢子形式在稻草和稻谷上越冬，完成侵染循环。稻瘟病菌的致病过程是一个复杂的分子过程。目前已经克隆了许多与稻瘟病菌致病性相关的基因，如MPGl、CPKA、PMKl、MAGB、PLSl、SMOl、PDEl、MPSl、PTHlI、CBPl、ICLl、BUF1、ALB1、ACR1、RSY1、HEX1。其中多数与附着胞形成有关，如PMK1、MAGB、MAC1等；部分参与黑色素的形成和积累(ALB1、RSYl、BUFl等)以及甘油合成相关(ICLl等)；少数与稻瘟病菌的穿透相关(MPS1、PLS1、H)E1等)。稻瘟病菌芽管分泌的一种疏水蛋白，由MPGl基因编码，参与菌丝和水稻叶表的互作，为形成正常的附着胞所必须(Talbot，1999)。MAGB基因编码的异源三聚G蛋白的a亚单位和MACl编码的cAMP环化酶也是形成附着胞所必需的(Liuand Dean, 1997; Choi and Dean, 1997; Kulkarni and Dean, 2004)。CPKA 基因编码的cAMP依赖性蛋白激酶A的催化亚单位PKA-c是附着胞穿透所必须的(Mitchell & Hamer,1995 ； Xu et al，1997)，而正在分化的芽管中的PKA活性对于形成正常的附着胞也非常关键(Adachi & Hamer 1998 )。同样,有丝分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinase, MAPK)基因PMKl是附着胞形成所需的(Xu & Hamer 1996)。黑色素合成系列基因也证明是附着胞穿透所不可缺少的(Chumley and Valent, 1990 ；Motoyama等，1998)。在各种突变子库中也发现了一些突变子缺失致病性，如编码一种与ATP运输体(ATP-binding cassette transporters )相关的蛋白的 ABCl 基因(Urban等，1999)、编石马P-型ATP酶的F1DEl基因(Balhadere等，1999，2001)和编码tetraspannin样蛋白的PLSl基因(Clergeot等，2001)。尽管如此，稻瘟病菌的分子致病机制还是不清楚。鉴定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是与侵入过程相关的基因，可以为设计、筛选抗真菌药物提供有用的靶标位点。目前已经在包括稻瘟病菌在内的一些真菌中证明了一些药物的靶点，如三环唑是一种很重要的稻瘟病菌杀菌剂，其作用是抑制黑色素的合成，靶点是稻瘟病菌的三羟萘还原酶；多肽杀菌剂sorphen A的作用靶点是青霉的脱甲基酶(CYP51)。因此，利用分子生物学技术鉴定、克隆新的在稻瘟病菌的致病过程中具有重要功能的致病性基因，可以为设计、筛选新的抗真菌药物提供有用的药物靶点。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的、对稻瘟病菌等真菌的菌丝生长、分生孢子产生和萌发、附着胞形成以及致病性有重要影响的基因MoMonl及该基因的用途。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种源于稻瘟病菌的真菌致病性基因MoMonl，该基因的核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQ ID NO 1所示。本发明同时提供了上述基因MoMonl编码的cDNA序列，该cDNA序列具有SEQ IDNO :2所示的核苷酸序列。
本发明同时提供了上述基因MoMonl编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。本发明还同时提供了上述基因MoMonl的用途基因MoMonl的表达作为用于设计和筛选抗真菌药物的靶标。本发明还同时提供了上述蛋白质的用途蛋白质的表达和修饰作为设计和筛选抗真菌药物的靶标。本发明通过同源序列比对，在稻瘟病菌中克隆了与液泡融合相关的基因MoMonl，并且对其进行了同源序列的比对和进化分析，结果说明MoMonl基因在真核生物中的保守性很高。本发明揭示了稻瘟病菌MoMonl基因可以互补酵母Monl基因缺失突变体，恢复突变体液泡的部分形态；说明了稻瘟病菌MoMonl基因在功能上与酵母Monl基因同源。
本发明通过构建MoMonl基因同源置换载体，利用农杆菌介导的转化将载体转入到野生型稻瘟病菌，得到了基因缺失突变体AMoMonl ;在基因缺失突变体AMoMonl中，重新引入MoMonl基因，突变体的表型恢复，并且进行了表达水平上的检测。本发明对稻瘟病菌MoMonl基因进行了细胞定位，该基因在稻瘟病菌分生孢子、附着胞和菌丝的细胞质中不均匀表达；在附着胞形成后荧光则主要定位在分生孢子的液泡上。本发明对细胞内运输途径进行观察，AMoMonl突变体细胞自噬途径受阻；液泡的形态改变；细胞内与液泡相关的物质运输途径受到影响；细胞壁的完整性被破坏。本发明分析了基因缺失突变体AMoMonl的基本表型，稻瘟病菌MoMonl基因缺失，气生菌丝变得非常稀疏；产孢能力显著下降，附着胞形成受阻；育性受到影响；对水稻和大麦的致病性丧失。本发明还提供了利用上述基因MoMonl的表达作为靶标，在设计和筛选抗真菌药物中的应用。本发明还提供了利用上述蛋白质的表达与修饰作为靶标，在设计和筛选抗真菌药物中的应用。本发明所称的抗真菌药物包括抗稻癒病菌(Maaiaporthe Oryzae )、玉米赤霉病菌(Gibberella zeae)、禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)、小麦颖枯病病菌(Phaeosphaeria nodorum)或玉米黑粉病菌(Ustilago maydis)的药物。本发明所涉及的基因因为同源重组造成的基因缺失突变导致稻瘟病菌菌丝稀疏、产孢量下降以及附着胞形成率下降，并且在感病水稻品种上的致病力缺失。因此，本发明最重要的用途是应用上述成果，设计和筛选能够破坏该基因的表达、剪切及其编码蛋白的表达的化合物，或设计和筛选能对该蛋白的氨基酸序列进行修饰的化合物，从而开发出新的抗真菌药物。此外，本发明的用途还包括利用该基因的DNA或cDNA序列作为探针在其它真菌中分离与该基因具有一定序列同源性的序列。


下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图I :不同真核生物Monl氨基酸序列比对。利用ClustalW软件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)进行了序列比对。不同真核生物Monl基因在GenBank里的登陆号稻瘟病菌(M. oryzae) (JN845639)，酿酒酵母(S. cerevisiae) (CAA96832. I)，鹅掌柄抱壳(Podospora anserine) (XP_001908681. I),油菜莖基溃瘍病菌(Leptosphaeriamaculans) (CBX983O3. I),黑抱块菌(Tubermelanosporum) (XP_002839031. I),构巢曲霉(Aspergillus nidulans) (XP_659697. I)，小麦壳针抱(Mycosphaerella graminicola)(EGP83322. I)和产黄青霉(Penicillium chrysogenum) (XP_002557860. I)。* 代表比对相同的氨基酸；一代表间隔。图2: Monl基因在不同真核生物中的进化发育。真核生物中Monl同源基因在 GenBank 里的登陆号M. oryzae (MoMonl), S. cerevisiae (CAA96832. I),N.crassa (XP_959164. 2), M. musculus (NP_766603. I), H. sapiens (NP_115731. 2),D. melanogaster (NP_608868.I), Gibberella zeae (XP_387259.I), Trichodermareesei (EGR50254. I), Neurospora tetrasperma (EG052340. I), Fusarium oxysporum(EGU75269.I), Aspergillus clavatus (XP_001272699.I), Phaeosphaeria nodorum(XP_001802326. I), Chaetomiumglobosum (XP_001220171. I). MEGA4. O 软件 NJ 法(Neighbor-joining),以1000次自展值(bootstrap)重复来评价进化树分支可信度。图3 pMD18-MoMonl 载体经 EcoRI 和 XbaI 酶切结果。 图4: PCR验证转化了稻瘟病菌MoMonl基因的酵母突变体(6、12、19分别代表YM-6、YM-12、YM-19 ；m :阳性对照；空阴性对照)。图5 :酵母液泡形态观察A:酵母野生型菌株(WT);B: MoMonl基因互补酵母(S.cerevisiae) Amonl 突变体；C:酵母(S. cerevisiae) Amonl 突变体。图6 :基因置换载体1300-MoMonl的构建策略。图7 MoMonl基因的目标置换。图8 :部分稻瘟病菌转化子PCR检测结果。图9 Southern杂交验证MoMonl的敲除。图10 =TMHMM模型预测蛋白跨膜区。红色表示跨膜区，蓝色表示细胞膜内侧，粉红色表示细胞外膜侧。图11 : pGFP-MoMonl载体构建示意图。图12 : MoMonl基因在细胞中的定位。GFP-MoMonl融合蛋白在菌丝、分生孢子和附着胞中的表达。标尺= 0.5 u mo图13 :菌株在CM培养基上的生长特性。图14 : AMoMonl突变体的产孢量。图15 :Guyll、AMoMonl和Com-12分别与2539的交配(交界处箭头所指黑色斑
点为子囊壳)。图16 分生孢子的诱导萌发(A :附着胞，C :分生孢子)标尺=10. 0 Um0图17 :细胞自噬过程被阻断a :液体CM培养基中正常生长的菌丝；b =MM-N饥饿诱导后的菌丝。箭头位置为自噬泡。图18 :基因MoMonl缺失影响了液泡的生长发育(标尺=5. 0 ii m)。图19 :菌株对Monensin敏感性测定。图20 : A MoMonl 突变体对药剂敏感性增强。a: Congo Red (200 mg/ml); b: SDS(0.01%); c: caffeine (2 mM)。图21 :离体大麦叶片上的致病性测试。
图22 :在水稻叶片上的致病性测试(喷雾接种)。I =Guyll ；2 : AMoMonl突变体；3 Com-12 ；4 :0. 2% :明胶作对照。图23 :在水稻根部的致病性测试(菌块接种)。I : AMoMonl突变体；2 =Guyll ；3 :未接菌对照;4:Com-12。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。实施例I :MoMonl基因的分离和克隆从 http://www. yeastgenome. org/ 网站搜索获得 Saccharomyces cerevisiaeMonl/YGL124C基因的蛋白序列，在稻瘟病菌基因组数据库中http://Ww.broadinstitute. org/annotation/genome/magnaporthe_grisea/MultiHome. html 通过blastP进行同源序列搜索，获得一个预测蛋白MGG_05755. 6，命名为MoMonl。为了研究MoMonl基因的功能,从稻痕病菌野生型菌株Guyl I (Magnaporthe oryzae Guy-11)的基因组中，利用引物McDNApl和McDNAp2克隆了 MoMonl基因全序列，并且连接到pUCm_T载体上，进行了测序；同时，在野生型菌株Guyll的孢子萌发2h的cDNA文库中克隆了该基因的编码序列，I 893bp，并且连接到pUCm-T载体上，进行了测序分析。DNA序列见SEQ ID NO 1(即，序列表的N01)，CDNA序列见SEQ ID NO 2 (即，序列表的N02)。预测稻瘟病菌MoMonl基因编码一个液泡融合相关蛋白，编码631个氨基酸(SEQID NO :3中表示终止子的“星号”被省略)(即，序列表的N03)，约158kDa。在有关蛋白结构的报道中，将Monl基因分类到SAND家族，虽然在这个家族已知的结构域中没有发现典型的相似性。SAND 家族在植物(Arabidopsis thaliana)、果妮(Drosophila melanogaster)、线虫(Caenorhabditis elegans)和酵母(S. cerevisiae)等多种生物中都有存在,是一个功能和进化上都非常保守的蛋白。MoMonl具有保守的结构域，在与液泡相关的融合过程中发挥重要的作用。利用ClustalW对稻瘟病菌MoMonl与其它真核生物进行同源序列的比对(http://www. ebi. ac. uk/clustalw/),比对结果再经过GENED0C软件进行适当调整获得最佳匹配。结果表明，MoMonl 与曲霉(Aspergillus oryzae，XP_001819506. 2)有 91% 的相似性;与赤霉(Gibberella zeae, XP_387259. I)有 96% 的相似性，里氏木霉(Trichodermareesei, EGR50254. I) 93%的相似性。稻瘟病菌MoMonl与其它真核生物同源序列比对的部分结果见图I。用MEGA4.0软件NJ法(Neighbor-joining)构建的进化树见图2。实施例2 =MoMonl同源性分析为了证明稻瘟病菌与酵母的Monl功能的相似性，利用引物YES-M-Pl和YES-M-P2克隆了稻瘟病菌MoMonl的编码区，含有起始密码子ATG但不含终止密码子TAA，引物酶切位点 EcoRI 和 XbaI。弓丨物YES-M-PI 的序列为CGGAATTCATGGCTCAAGAAGACCAT，引物YES-M-P2 的序列为GCTCTAGATTAAAATACACCGCCACC。PCR 体系为(50 U I):梭板DNA约IOOng
Taq polymerase5U
IOxbuffer (+MgCl2)5pJ
dNTP (25mmoI/L, each)0.4^1
SO^mol/L upper primer0,5jxl
50^imol/L lower primer0.5卩I
dd 11 .■；()至50plPCR扩增程序为 I. 94°C预变 5 分钟2. 94°C 30 秒3. 52 °C 30 秒4. 720C (I 分钟 /lkb) 2 分钟2-4. 35 个循环5. 72 0C 10 分钟6. 40C 保温。PCR产物连接到pMD18-T载体上，得到载体pMD18_MoMonl ;利用EcoRI和XbaI酶切载体pMD18-MoMonl，回收MoMonl的编码区片段，约2kb ;选择经过EcoRI和XbaI酶切验证正确的克隆(图3，即表现为pMD18-MoMonl经双酶切后有目的带2kb出现和约3kb大小的PMD18-T载体)；回收MoMonl的编码区片段连接到pYES2载体(含有GALl强启动子，诱导基因的表达)相应的EcoRI/Xbal位点，得到载体pYES- MoMonl。应用醋酸锂/PEG酵母小量转化的方法转化酵母Monl基因缺失突变体AMonl (根据实施例3制备而得)，转化得到的转化子用尿嘧啶缺乏选择培养基(SC-U)筛选。挑取能够在SC-U选择培养基上生长的单菌落，继续在SC-U的液体培养基上筛选，30° C，200 rpm/min振荡培养过夜。然后将菌液各取10 ill移至新的YH)液体培养基中再次培养。30° C，200rpm/min振荡培养过夜后，提取酵母质粒。以质粒DNA为模板,用Monl_yzpl和Monl_yzp2引物对筛选菌株进行PCR验证，取pYES2空载体质粒作阴性对照，pYES-MoMonI质粒作阳性对照(图4)，对PCR有条带的菌株进行单菌落分离。引物Monl_yzpl 的序列为GGAGATCAACCGCAAGAGCCGCG引物Monl_yzp2 的序列为GCAGTGTCAGGGTGGAAAGAATCPCR体系为等同于实施例2 ；PCR扩增程序为I. 94°C预变 5 分钟2. 940C 30 秒3. 55 0C 30 秒4. 720C (I 分钟 /lkb) 50 秒2-4. 25 个循环5. 72 0C 10 分钟
6. 4°C 保温。随机挑取有条带的酵母突变体菌株YM-6、YM-12和YM-19，在液体YPD培养基上过夜培养后，在显微镜下观察酵母液泡的形态。观察发现，在酵母Monl基因缺失突变体AMonl中，存在大量小而呈碎片状的液泡；而野生型菌株(WT)中则只有一个典型的曲线圆滑且大的液泡。同样，转化了稻瘟病菌MoMonl基因的酵母菌株YM-6、YM-12和M-19中也含有典型的曲线圆滑的大液泡，虽然也有部分细胞中含有多个小液泡，但是小液泡的外形非常规整，未呈破碎状(图5)。可见，稻瘟病菌MoMonl基因可以互补酵母Monl基因缺失突变体，使其恢复部分细胞生长过程，至少是与液泡有关的部分途径或者液泡的生长发育得到恢复。由此可以推断，稻瘟病菌MoMonl基因与酵母Monl基因在结构和功能上是同源的。实施例3 =MoMonl基因缺失突变体和互补突变体的获得3. I MoMonl基因敲除载体的构建 利用引物Monl-uppl和Monl_upp2,以野生型Guyll基因组为模板,扩增I. 02 kb含有Xhol/Sall位点的MoMonl基因上游片段，连接到pbs_HPHl载体的Xhol/Sall位点，得到载体 pBS-MoMonlup ;同样的利用引物 Monl-lowpl 和 Monl_lowp2 获得 I. 0 kb Pstl/Xbal下游片段，连接到pBS-MoMonlup的Pstl/Xbal位点，得到载体pBS_MoMonl。最后用XhoI和XbaI双酶切，将MoMonlup-HPH-Monllow大片段从pBS上切下来，并连接到1300X的XhoI/XbaI酶切位点，最终得到置换载体1300-MoMonl。具体构建方法见图6。3.2 AMoMonl突变体的获得包含MoMonl基因上游序列-潮霉素抗性基因_下游片段的1300-MoMonl载体转化到农杆菌中后，通过ATMT方法利用农杆菌转化稻瘟病菌野生型菌株Guyll。在基因置换过程中，大部分外源DNA插入到稻瘟病菌的基因组中，由于两端同源序列的存在，部分会发生同源置换，同源置换的过程见图7。试验中总共得到56个转化子，提取所得转化子的基因组DNA，利用Monl_yzpl和Monl_yzp2引物进行PCR验证，其中部分转化子PCR产物电泳没有497bp的目的条带(图8)，初步断定这些没有目的条带的转化子为基因置换突变体(这部分被潮霉素抗性基因替换)。选取其中三个突变体monl-12、monl-35和monl-49大量提取基因组DNA,进行Southern杂交验证。用ApaI对monl-12、monl-35和monl-49的基因组进行酶切，野生型Guyll为对照，引物Monl-Iowpl和Monl_lowp2的PCR扩增产物，
I.Okb的片段，合成杂交探针。杂交结果显示，野生型Guyll菌株在3. 87kb处有杂交信号，而monl-12、monl-35和monl-49在7. 5kb处有杂交信号并且是单拷贝，该杂交结果证实了monl-12、monl_35和monl-49为MoMonl基因缺失突变体(图9)。选取monl-35进行单抱分离并保存进行后续试验。3.3互补载体的构建为了验证突变体的表型是因为基因MoMonl的缺失引起的，构建了互补载体P1300SUR-M0N1。利用引物P-M-Lpl和P_M_Lp2扩增了含有I. 5 kb的上游序列和0. 98 kb下游序列的全长MoMonl基因，克隆到pUCm-T载体。用EcoRI和XbaI双酶切后，回收4. 38kb的MoMonl基因片段，连接到pCAMBIA1300X-SUR载体的EcoRI/Xbal位点上，获得互补载体pl300SUR-M0Nl。选择标记基因SUR扩增自pCB1532载体并且连接到pCAMBIA1300X的EcoRV/EcoRI位点，构成pCAMBIA1300X-SUR。将pl300SUR_M0Nl载体转化到农杆菌中后，通过ATMT方法利用农杆菌转化稻瘟病菌突变体A MoMonl。
由于MoMonl缺失突变体和野生型的差异非常大，互补后，缺失突变体的表型得到恢复。结合PCR验证和氯嘧磺隆抗性筛选(在DCM培养基上MoMonl缺失突变体和野生型菌株对100 u g/mL浓度的氯嘧磺隆敏感不能生长，而互补菌株因为含有氯嘧磺隆抗性而正常生长)可以推断，AMoMonl表型的变化是由MoMonl基因的缺失引起的。选取互补菌株Com-12进行后续试验。3. 4 RT-PCR 和 QP CR为了确定突变体在表达水平上缺失基因MoMonl，进行了实时荧光定量PCR(QPCR)0分别提取野生型Guyll，突变体AMoMonl和互补型Com-12菌株的总RNA，利用引物MqRTpl和MqRTp2进行RT-PCR，以微管蛋白(P -tubulin)为内参进行QPCR。循环条件是50° C，2 分钟；95° C，30 秒；循环 95° C，5 秒；58° C，31 秒，40 个循环，60° C 读取荧光；融解曲线从72° C到60° C 0.5° C递减，每个温度都读取荧光。数据分析利用Mastercycler ep realplex软件。结果的计算按照(Livak et al. , 2001)的方法,野生型Guyll中，基因MoMonl的表达量约是突变体AMoMonl中表达量的I. 2 X IO3倍，互补型Com-12约是突变体AMoMonl中表达量的I. 8X IO3倍，相对表达量都很高。由此可以得出，基因缺失突变体A MoMonI没有MoMonI基因的表达，说明A MoMonI中的MoMonI基因被替换。而Com-12恢复了 MoMonl基因的表达。实施例4 =MoMonl基因的细胞内定位4. I MoMonl蛋白的结构预测Monl是一个液泡融合相关蛋白，我们推测该蛋白可能结合在液泡膜上发挥作用，因此使用 TMHMM 模型(http://genome, cbs. dtu. dk/services/TMHMM/)预测了 MoMonl 的跨膜区。结果显示该蛋白没有明显的跨膜区域(图10)，表明MoMonl与液泡膜的结合可能是一种瞬时行为，或者MoMonl是一种辅助因子，调控其他蛋白与液泡膜的结合。4. 2通用载体pl300RPGFP的构建首先以稻瘟病菌野生型菌株Guyll的基因组为模板扩增RP27启动子(ribosomalprotein 27 promoter),酶切位点为Smal/Ncol ;然后将RP27片段插入到pEGFP载体的Smal/Ncol酶切位点处，构建形成pRP_EGFP载体；以pRP-EGFP载体为模板扩增出含有RP27的EGFP基因；然后将该片段与T载体连接克隆后酶切插入到pBlueSCript_SK (+)载体的EcoRI/PstI位点，形成pBS-RPGFP载体。以pBARKSl质粒为模板扩增选择标记基因Bar。随后将Bar克隆酶切后连接到pBS-RPGFP载体的Clal/EcoRV位点。最后将同时含有Bar基因、EGFP基因以及RP27启动子的大片段用XhoI/SacI双酶切，连接到pCAMBIA1300载体的XhoI/SacI位点，最终构成pl300RPGFP荧光表达通用载体。4. 3 GFP-MoMonl融合载体的构建为了研究MoMonl基因在稻瘟病菌中的空间表达情况，构建了载体pGFP- MoMonl。首先构建了在MoMonl基因自身启动子的作用下的GFP融合载体，但是转化后得到的突变体荧光表达非常弱，因此改用稻瘟病菌本身一个强启动子RP27重新构建荧光载体。利用引物McDNApl和McDNAp3扩增含有终止密码子(TAA)的MoMonl基因编码序列并连接到P1300RPGFP的相应SpeI酶切位点，挑取经过酶切验证以及连接方向验证正确的载体，最终得到载体PGFP-MoMonl (示意图见图11)。载体pGFP-MoMonl直接利用ATMT方法转化稻瘟病菌MoMonl基因的缺失突变体AMoMonl。经过PCR、QPCR以及草胺磷抗性(200 y g/ml)的筛选得到MoMonl的荧光表达突变体RP-MGFP。绿色荧光蛋白GFP基因与MoMonl基因在RP27启动子的作用下融合表达。4.4荧光观察CM液体培养基上培养突变体RP-MGFP，挑取分生孢子和菌丝，在共聚焦荧光显微镜Leica TCS SP5下观察，可以看到荧光在分生孢子、菌丝的细胞质和液泡上均有表达。在分生孢子萌发16个小时后，荧光依然是不均匀分布。将分生孢子的悬浮液(IO5个/ml)滴到塑料盖玻片的表面上，用无菌水代替液体CM培养基诱导附着胞形成，观察荧光表达情况，结果诱导6小时后荧光信号主要集中在分生孢子和附着胞的液泡上(图12)。表明MoMonl蛋白可能通过结合在液泡上参与稻瘟病菌附着胞的 形成过程。实施例5 :突变体表型分析5. I突变体菌落形态在CM培养基上，AMoMonl菌落的气生菌丝非常稀疏，中央菌丝尤其贫乏，只有在菌落的边缘才可以看到明显的气生菌丝；而野生型Guyll和互补型Com-12的气生菌丝浓密，菌落呈灰褐色(图13)。MoMonl基因的缺失影响了稻瘟病菌的菌落形态。5.2突变体AMoMonl气生菌丝产孢量明显下降将菌株接种在CM培养基上，16小时光照，26° C生长7天后，无菌水将菌落表面菌丝洗掉，然后在超净工作台上，经无菌风吹干后继续培养3天。然后打孔，统计分生孢子产量。野生型Guyll的孢子产量为4. 22±0. 87X 105个/ml，互补型Com-12的孢子产量为3. 8±0. 33X IO5个/ml，而基因缺失突变体AMoMonl的孢子产量仅为0. 2±0. 45X 105个/ml，约为野生型Guyll的1/45 ;互补型的孢子产量恢复，与野生型相近(图14)。突变体AMoMonl的产孢量虽然下降，但是分生孢子的形态没有改变，与Guyll和Com_12没有明显的差别。因此，基因MoMonl缺失，严重影响稻瘟病菌的产孢能力。5.3突变体育性降低将突变体AMoMonl与2539 (MATl-I)菌株进行交配试验，首先在16小时光照，26° C培养三天，然后20° C恒温持续光照培养4周。野生型Guyll和互补型Com-12与2539的交界处分别形成大量子囊壳，而在AMoMonl与2539的交界处则不能形成子囊壳(图15)。说明，MoMonl基因的缺失，影响了稻瘟病菌的育性。5.4突变体附着胞的形成受阻分别将Guyll、AMoMonl和Com_12的分生孢子悬浮液(IO4个/ml)，每滴20W滴在塑料盖玻片表面，诱导孢子萌发和附着胞形成。结果发现，突变体的分生孢子和野生型一样在2小时内都可以萌发形成芽管。但是诱导培养24小时后，AMoMonl的分生孢子仍然延续菌丝生长而不能形成附着胞；野生型Guyll和互补型Com-12均在诱导24小时后有90%以上的分生孢子萌发形成附着胞(图16)。说明，MoMonl基因的缺失，没有影响分生孢子的初始萌发，但是却完全阻断了附着胞的形成。实施例6 :突变体细胞内物质运转途径6.1突变体AMoMonl的细胞自噬过程中断利用透射电镜观察稻瘟病菌中细胞自噬过程的发生。在液体CM培养基中，26° C，150rpm，振荡培养48小时的稻瘟病菌菌丝，用无菌水彻底洗去培养基，接种到含有2mmol/L PMSF的氮缺乏培养基(MM-N)中，继续培养4小时。然后，用无菌水将菌丝洗干净，戊二醛固定过夜，处理样品，包埋，切片，电镜观察。从图17的b可以看到，在野生型Guyll和互补型Com-12的大液泡中均有自噬泡出现；而AMoMonl突变体中没有自噬泡的积累。因此，MoMonl基因缺失，稻瘟病菌细胞自噬过程被阻断。6. 2突变体中大量小液泡堆积在上文透射电镜观察细胞自噬过程的试验中，直接诱导培养后挑取菌丝在普通电子显微镜下观察。在野生型Guyll的菌丝中，有典型的大液泡，并且液泡中存在大量肉眼可见的迅速移动的自噬体；而突变体AMoMonl的菌丝中则存在大量小而呈破碎状的小液泡，同时在小液泡中没有观察到肉眼可见的游动颗粒(图18)。互补型Com-12则恢复了细胞自噬过程，菌丝形态和野生型没有明显差别。在上文观察细胞自噬过程的试验中也发现了突变体AMoMonl中大量小液泡的堆积，说明，MoMonl的缺失不仅阻断了稻瘟病菌的细胞自噬过程，还影响了液泡的生长发育。6. 3突变体细胞内蛋白运转受阻 Monensin是一种Na+/H+离子载体，它可以抑制细胞内的蛋白运转，常被用作蛋白转运抑制剂。酵母中许多与液泡的合成或功能有关的突变体都对Monensin敏感(MarieGustavsson, 2008),同时Monl基因最早也是在对Monensin的抗性筛选中发现的(Mur6n etal. , 2001)。因此，我们在稻瘟病菌中AMoMonl突变体对Monensin的敏感性也做了检测。菌株在CM平板上活化生长7天后，菌块打孔接种到含有5 ug/ml Monensin的CM平板上，26° C培养7天后观察拍照。结果发现，同等条件下，虽然野生型Guyll和互补型Com-12的菌落生长也受到一定程度的抑制，但是菌落还可以缓慢生长扩展，而AMoMonl突变体的生长几乎完全被抑制(图19)。说明MoMonl基因的敲除，影响了稻瘟病菌中蛋白的运转。6.4 AMoMonl突变体细胞壁完整性被破坏对一些细胞壁干扰药剂的敏感性测定方法同上。结果发现，与野生型Guyll和互补型 Com-12 相比，在分别含有 Congo red (200 ug/ml), SDS (0. 01%)和 caffeine (2 mM)的CM平板上时，AMoMonl的生长更加缓慢，尤其是在Congo red和SDS的情况下(图20)受到的抑制更明显。表明，MoMonl基因的敲除影响了稻瘟病菌中细胞壁的完整性。实施例7 A MoMonl突变体致病性丧失7. I离体大麦叶片接种在实验室条件下，菌株在CM平板上生长7天后，打孔。将菌块接种在育苗8天的大麦离体叶片上，未接菌的叶片作对照。保湿4天后观察发病情况。结果显示，Guyll和Com-12接种的叶片上产生黄褐的病斑(图21);而AMoMonl没有可见病斑产生。7. 2水稻喷雾接种分别用Guyl I、A MoMonl和Com_12的孢子悬浮液(I X 105/ml，含0. 25%明胶)对三叶一心的水稻进行喷雾接种，每钵30株苗用孢子液10ml，22° C黑暗保湿48小时，随后转移到培养室中26° C、12小时光照培养。水稻接种7d后观察记录发病情况。试验重复3次。结果显示，Guyll和Com-12在水稻叶片上可见典型的稻瘟病病斑，病斑边缘黄褐色、中央灰色。而AMoMonl在水稻上没有产生肉眼可见的病斑(图22)。7. 3根部侵染在CM平板上生长7天的菌株，打孔，接种在催芽的水稻苗上。22° C，16小时光照培养两周后，洗掉根部的蛭石，拍照观察致病情况。结果显示，野生型Guyll和互补型Com-12都可以在水稻根部产生典型的褐色病斑，而AMoMonl突变体则没有形成可见的病斑(图23)。实施例8 :利用MONl蛋白的表达或修饰作为靶标，筛选抗真菌的药物把受MoMonl基因调控的下游基因的启动子与荧光蛋白GFP构建成融合蛋白载体，通过实施例3的方法转入到稻瘟病菌中，然后把在下游基因的启动子调控下的GFP表达的稻瘟病菌转化子菌株在液体完全培养基中大量培养，收集菌丝后分成若干小份，每一份中加入待筛选的化合物或候选药物继续在完全培养基培养数小时至数天，取菌丝在荧光显微镜下观察菌丝的GFP的绿色荧光表达情况。如果MoMonl蛋白被候选药物抑制而失去活性，则失去对下游基因的启动子表达的调控能力，GFP蛋白不表达从而菌丝失去绿色荧光，说明该侯选药物具有抑制MoMonl蛋白的作用。获得的具有抑制MoMonl蛋白功能的候选药物再 利用实施例4的方法，在接种的孢子液中加入侯选药物，测定野生型稻瘟病菌在这种侯选药物存在的条件下对水稻的致病性有没有减弱，进一步确定化合物的抗真菌效果。当测定结果为野生型稻瘟病菌株对水稻的致病性减弱时，说明候选药物具有明显的抗真菌效果，可以作为抗真菌药物的来源；当测定结果为野生型稻瘟病菌株对水稻的致病性没有变化或增强时，说明侯选药物没有抗真菌效果，不能用作抗真菌药物。备注说明首先以pRP-EGFP载体为模板扩增出EGFP基因；然后将该片段与T载体连接克隆后酶切插入到pBluesCript_SK(+)载体，形成pBS_GFP载体。以pBARKSl质粒为模板扩增选择标记基因Bar。随后将Bar克隆酶切后连接到pBS_GFP载体，形成pBS_GFP_Bar。以稻瘟病菌野生型菌株Guyll的基因组为模板扩增受MoMonl基因调控的下游基因的启动子，然后将该启动子克隆酶切连接到pBS-GFP-Bar。最后将同时含有Bar基因、EGFP基因以及启动子的大片段酶切后连接到PCAMBIA1300载体，最终构成“融合蛋白载体”。最后将“融合蛋白载体”根据实施例3的方法转化野生型菌株GuylI，通过草胺磷抗性筛选得到“在下游基因的启动子调控下的GFP表达的稻瘟病菌转化子菌株”。实施例9 :利用MoMonl的表达作为靶标，筛选抗真菌的药物。把稻痕病菌在液体完全培养基中大量培养，收集菌丝后分成若干小份，每一份中加入待筛选的化合物或候选药物继续在液体完全培养基培养数小时，提取菌丝的RNA，采用实时定量PCR的方法检测MoMonl的表达状况。如果MoMonl的表达被候选药物抑制，则菌丝细胞内没有MoMonl的转录本或减少。获得的化合物再利用实施例4的方法，测定野生型稻瘟病菌在这种化合物存在的条件下对水稻的致病性有没有减弱，进一步确定化合物的抗真囷效果。实施例10 :利用MoMonl的启动子作为靶标，筛选抗真菌的药物。把MoMonl的启动子与荧光蛋白GFP构建成融合蛋白载体，或把MoMonl的启动子与荧光蛋白GFP以及MoMonl蛋白一起构建成融合蛋白载体，通过实施例3的方法转入到稻瘟病菌中，然后把在MoMonl的启动子调控下的GFP表达的稻瘟病菌转化子菌株在液体完全培养基中大量培养，收集菌丝后分成若干小份，每一份中加入待筛选的化合物或候选药物继续在完全培养基培养数小时至数天，取菌丝在荧光显微镜下观察菌丝的GFP的绿色荧光表达情况。如果MoMonl的启动子的被化合物抑制而失去活性，则GFP蛋白不表达从而菌丝失去绿色荧光。获得的化合物再利用实施例4的方法，测定野生型稻瘟病菌在这种化合物存在的条件下对水稻的致病性有没有减弱，进一步确定化合物的抗真菌效果。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可 以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种源于稻瘟病菌的真菌致病性基因MoMonl，其特征是该基因的核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQ ID NO 1所示。
2.如权利要求I所述的基因MoMonl编码的cDNA序列，其特征是所述的cDNA具有SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
3.如权利要求I所述的基因MoMonl编码的蛋白质，其特征是所述的蛋白质为SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列。
4.如权利要求I所述的基因MoMonl的用途，其特征是基因MoMonl的表达作为用于设计和筛选抗真菌药物的靶标。
5.如权利要求3所述的蛋白质的用途，其特征是所述蛋白质的表达和修饰作为设计和筛选抗真菌药物的靶标。
全文摘要
本发明公开了一种源于稻瘟病菌的真菌致病性基因MoMon1，该基因的核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQ ID NO1所示。本发明还同时公开了上述基因MoMon1编码的cDNA序列，其具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了上述基因MoMon1编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了上述基因MoMon1的用途基因MoMon1的表达作为用于设计和筛选抗真菌药物的靶标。本发明还同时公开了上述蛋白质的用途蛋白质的表达和修饰作为设计和筛选抗真菌药物的靶标。
文档编号C12N15/31GK102776209SQ20121023190
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年6月20日
发明者冯晓晓, 刘小红, 卢建平, 曾晓清, 林福呈, 高惠敏 申请人:浙江大学