专利名称：新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其制备和应用，具体涉及应用基因工程技术制备的一种新型结核分枝杆菌特异性的多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352及其制备方法，属于结核病医学免疫学检测技术领域。
背景技术：
在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一，1985年以来艾滋病的流行、结核感染的移民和部分人群生活贫困等原因使美国等欧美发达国家结核病发病率呈回 升趋势，尤其是结核菌耐药问题、与人免疫缺陷病毒(HIV)合并感染使结核病治疗更是雪上加霜。目前全世界有结核病人约2000万，每年新增结核病人800 1000万，每年死亡人数约200万。中国的结核病疫情相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查初步结果表明，15岁及以上人群肺结核的患病率为459/10万，其中传染性肺结核患病率为66/10万。结核病死亡在传染病中居第一位。结核病也是AIDS感染者死亡的主要原因，根据1996年WHO统计每3个死亡的AIDS患者中就有一例死于合并结核，45-85%HIV死亡者是由于结核病诊断延误所致。早期诊断、发现病人、选择敏感的抗结核药物进行有效治疗是控制结核病的关键。虽然结核病细菌学检查是目前发现传染源的主要途径和手段，是结核病诊断的“金标准”，但临床标本涂片、镜检的灵敏度低，需IO4 — IO5个菌/ml痰才能检出，阳性率只有20-30% ；传统的分枝杆菌培养阳性率低(只有30%左右)，需4-8周时间。显然目前临床上常规应用的诊断方法不能满足结核病早期诊断、鉴别诊断的需要。因此，结核病的快速诊断、鉴别诊断是目前亟待解决的重要课题之一。尤其是菌阴肺结核、肺外结核和儿童结核的诊断十分困难，而免疫学检查标本来源方便、简便、快速、灵敏、特异，成为结核病重要的辅助检查手段。结核病患者大都处于免疫紊乱状态，机体未能诱导有效的免疫应答而导致发病。在疾病的早、中期，机体的免疫功能亢进，Thl型免疫应答逐渐减弱，Th2型免疫应答增强，使Thl型免疫向Th2型免疫转移，表现为Thl型细胞因子和血清抗体逐渐增高，皮肤变态反应增强。而在疾病的中后期，细胞免疫功能低下，机体产生各种抗病因子的功能下降，体液免疫功能增强，结核病病情恶化，表现为血清抗体增高。因此，抗结核抗体检测成为临床上应用较广泛的一种简便、快速、价廉的结核病辅助诊断手段，尤其是对于那些诊断困难的菌阴肺结核、儿童结核病或肺外结核病具有实用价值。但目前尚不完全清楚结核分枝杆菌哪些抗原主要引起细胞免疫反应，而哪些抗原主要引起体液免疫反应；结核潜伏感染者、结核病患者对结核菌的不同抗原是如何反应的。目前已发现不同结核病患者对不同结核分枝杆菌抗原产生不同水平的抗体，而同一个患者在疾病的不同阶段对不同抗原的免疫反应也不同，使得每一位患者血清识别抗原的种类、数目和水平都有很大的差异，抗原识别的个体差异是人类结核病体液免疫的主要特性。此外，其他细菌感染也可能产生假阳性反应，导致目前商业化的结核抗体检测试剂盒存在灵敏度和特异性不高的问题，目前任何一种单一的抗原进行结核病血清学诊断时的灵敏度均未超过70%，尚无确切的抗原或成套的抗原可被所有的或大多数的患者所识别。抗原的筛选、评价对抗结核抗体的检测至关重要，筛选灵敏度高、特异性强、具有互补性的抗原构建融合蛋白，不仅可提高检测的灵敏度和特异性，还可降低成本，从而弥补目前诊断方法的不足。
发明内容
本发明的目的是克服已有技术的不足，提供一种新型结核分枝杆菌特异性多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352及其制备方法，作为结核病抗体检测抗原，可提高结核抗体检测的灵敏度和特异性，应用于结核病的快速诊断。一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白，其由Rv0057和Rvl352两种蛋白抗原的关键 表位依次连接构成，称为Rv0057-Rvl352 ;Rv0057蛋白抗原表位的核苷酸序列(DNA序列)如序列表中序列I所示；Rvl352蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示。所述的Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。Rv0577抗原是一种功能未知的醛酮变位酶，仅在结核分枝杆菌复合群中分泌表达，而环境中的分枝杆菌不存在。该蛋白可在结核病患者的肺部表达，存在于多数活动性结核患者的痰液中，并可刺激机体产生体液免疫反应，是已知的可与结核患者血清反应的抗原之一 ORv0057抗原是结核分枝杆菌一个功能未知的蛋白，而Rvl352抗原是结核分枝杆菌复合群保守的一个外膜蛋白，与Rvl351在一个操纵子。它们均可刺激T细胞反应产生IFN-Y，虽然目前国内外尚未见该蛋白在结核病血清学诊断方面的研究报道，但本发明人发现这两种抗原的融合蛋白具有很好的抗原性，可与血清中抗结核抗体反应，具有较高的灵敏度和特异性(分别为66. 7%和91. 8%)。将上述RV0057和Rvl352两种结核分枝杆菌蛋白关键的抗原表位依次连接，并删除无抗原表位区域，从而提高结核抗体检测的灵敏度和特异性，实现结核病患者的早期发现。本发明提出的结核分枝杆菌特异性多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352，是选择结核分枝杆菌两种蛋白Rv0057和Rvl352关键的抗原表位，并将其依次连接，通过基因工程技术将其克隆、表达、纯化。本发明提出上述融合蛋白Rv0057-Rvl352的制备(构建)方法，包括如下步骤(I)两个蛋白抗原表位融合的设计分析结核分枝杆菌Rv0057、Rvl352的基因序列和蛋白质结构，确定两个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序；依次将Rv0057和Rvl352蛋白抗原表位连接、形成融合蛋白；Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。(2)两个蛋白融合的克隆通过基因工程技术进行克隆。①在Rv0057上游引物添加Nhe I酶切位点，在Rv0057下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I, Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nhe I和Xho I双酶切后，插入用Nhe I和Xho I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5a受体菌中。经过质粒提取，经T7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv0057/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。②在Rvl352上游引物添加Nhe I酶切位点和编码I个疏水性氨基酸的DNA序列，在Rvl352下游引物添加Spe I、Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nhe I和Xho I双酶切后，插入用Nhe I和Xho I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5 α受体菌中。经过质粒提取，经Τ7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rvl352/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。③用Spe I和Xho I双酶切Rv0057/pET30aSETB质粒作为载体；用Nhe I和XhoI双酶切Rvl352/pET30aSETB质粒，获得的Rvl352片段插入Rv0057/pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌BL21 (DE3)受体菌中。经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv0057-Rvl352/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列5所示,并使Rv0057蛋白抗原表位与Rvl352蛋白抗原表位之间通过连接臂相联接，表明已成功构建了具有多抗原表位的融合蛋白重组表达质粒。(3)多抗原表位融合蛋白的鉴定Rv0057-Rvl352大肠杆菌基因工程株经过诱导、表达、纯化，SDS-PAGE电泳、鉴定，及Westhern免疫印迹反应和ELISA分析，表明获得的纯化的融合蛋白与实际设计的大小相符，并具有很好的抗原性。本发明的新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白Rv0057-Rvl352可应用于制备结核抗体诊断试剂盒，对结核病具有较高的抗原检测灵敏度和特异性。本发明将Rv0057和Rvl352蛋白的抗原表位依次通过连接臂连接而构建了多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352。研究结果表明，与目前商品化的抗体检测试剂盒相比，本发明所制备的结核分枝杆菌特异性融合蛋白，在结核病血清学诊断方面均具有敏度高、特异性强、并与其它抗原具有互补性的优点，可用于检测血清、胸水等体液标本中特异的抗结核抗体。本发明的特点及技术效果本发明通过基因工程技术克隆、表达、纯化结核分枝杆菌Rv0057-Rvl352重组融 合蛋白，通过多种不同的联合作为结核病抗体检测的抗原，该种融合蛋白能用于检测结核病患者的抗体水平。本发明人研究证明应用结核分枝杆菌Rv0057_Rvl352重组融合蛋白抗原检测结核病人的灵敏度和特异性分别为66. 7%、91. 8%。本发明结核分枝杆菌重组Rv0057_Rvl352融合蛋白抗原可大规模生产，且成本相对较低。本发明的融合蛋白可作为新型结核抗体检测的联合抗原之一，用于检测血清、胸水等体液样品中特异的抗结核抗体，可用于结核病临床血清学诊断。
图I为基因合成的Rv0057DNA片段的琼脂糖电泳图。图2为基因合成的Rvl352DNA片段的琼脂糖电泳图。图3 为 Rv0057-Rvl352/pET30aSETB 大肠杆菌工程菌 IPTG 诱导前后 SDS-PAGE 结
果O
图4为Rv0057_Rvl352/pET30aSETB大肠杆菌工程菌的表达形式和纯化的SDS-PAGE 结果。
具体实施例方式本发明提出的结核分枝杆菌特异性多抗原表位融合蛋白及其制备方法和应用结合实施例及附图详细说明如下本发明提出的结核分枝杆菌特异性多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352，是选择结核分枝杆菌两种蛋白Rv0057和Rvl352关键的抗原表位，并将其依次连接，通过基因工程技术将其克隆、表达、纯化。上述的融合蛋白Rv0057-Rvl352的制备方法，包括
(I)两个蛋白抗原表位融合的设计分析结核分枝杆菌Rv0057、Rvl352的基因序列和蛋白质结构后，确定两个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序；依次将Rv0057和Rvl352蛋白抗原表位连接、形成融合蛋白；Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。由Rv0057和Rvl352两种蛋白抗原的关键表位依次连接构成，称为Rv0057-Rvl352 ；(2)两个蛋白融合的克隆通过基因工程技术进行克隆。①在Rv0057上游引物添加Nhe I酶切位点，在Rv0057下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I.Xho I酶切位点，将基因合成的Rv0057PCR产物片段用NheI和Xho I双酶切后，插入用Nhe I和Xho I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5ci受体菌中。经过质粒提取，经T7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv0057/pET30aSETB。②在Rvl352上游引物添加Nhe I酶切位点和编码I个疏水性氨基酸的DNA序列，在Rvl352下游引物添加Spe I、Xho I酶切位点，将基因合成的Rvl352PCR产物片段用NheI和Xho I双酶切后，插入用Nhe I和Xho I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5ci受体菌中。经过质粒提取，经T7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rvl352/pET30aSETB。③用Spe I和Xho I双酶切Rv0057/pET30aSETB质粒作为载体；用Nhe I和XhoI双酶切Rvl352/pET30aSETB质粒，获得的Rvl352片段插入Rv0057/pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌BL21 (DE3)受体菌中。经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv0057-Rvl352/pET30aSETB，并使Rv0057抗原与Rvl352抗原之间通过连接臂相联接，表明已成功构建了具有多抗原表位的融合蛋白重组表达质粒。实施例I一、通过基因工程技术克隆Rv0057抗原表位编码基因I、依据序列表中的序列I设计与合成扩增Rv0057抗原表位的一对引物上游引物(5’端含限制性内切酶Nhe I)5，一 CTAGCTAGCGTGGTGACCGCGGTCGG — 3，下游引物(5’端含限制性内切酶Xho I和Spe I)5，—
CCGCTCGAGTTATTATTAACTAGTACCGCCACCGGTCATCAACGACCGCCA — 3’扩增片段555bp2、Rv0057 基因合成根据上面的设计，通过基因合成Rv0057555bp的PCR产物，于I. 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定合成的基因片段。图I为基因合成的Rv0057DNA片段的琼脂糖电泳图，测序结果证明，图中箭头所指的DNA条带就是Rv0057基因合成PCR产物在I. 2%琼脂糖电泳胶上的位置；左侧第一个泳道为TaKaRa公司的DL2000分子量标准(从上到下的6个条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp)。3、回收目的基因片段琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要·回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，定量后，贮存于_20°C备用。4.重组质粒的构建用限制性内切酶Nhe I和Xho I双酶切纯化后的Rv0057基因合成PCR产物和表达载体pET30aSETB质粒DNA，于1%琼脂糖凝胶电泳，切取Rv0057基因片段和pET30aSETB质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，Rv0057基因片段与pET30aSETB质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，10 μ I反应体系如下
2x连接缓冲液5μ1
pET30aSETB 载休Ιμ
PCR产物2μ1 Τ4 DNA连接酶Ιμ 无菌水补至10 μ 混匀后置于16°C连接过夜，75°C灭活lOmin，冰浴后直接进行转化。5.连接产物的转化次日取目的基因片段与载体pET30aSETB连接产物5μ I加入含有100 μ I大肠杆菌DH5 α感受态细胞的离心管中，冰浴O. 5h ;放入42°C水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min ;加入LB培养液400 μ 1，37°C恒温摇床培养Ih ;加入X_Gal60 μ 1，IPTG4y 1，混匀，取出200 - 400 μ I涂布于含有50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37°C恒温培养箱培育14h。6.质粒的提取根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒，定量后，置-20°C储存备用。7.鉴定重组质粒(I)PCR扩增鉴定以挑选的菌落质粒DNA为模板，以上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在I %琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为Rv0057/pET30aSETB。(2)序列测定直接挑选一个克隆送公司进行T7通用引物正向测序验证测序。测序结果与设计的基因组序列一致，其核苷酸序列如下，在序列表中如序列3所示，其中，GCTAGC 为 Nhe I 酶切位点，GGTGGCGGT 作为连接臂，ACTAGT 为 Spe I, CTCGAG 为 Xho I。GGGGGCGGTAATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCGTGGTGACCGCGGTCGGCCGCCGCCGGGGTTTCGCCATGCCCTGGGTGTCCACCGCACGGTCCGGTGCGGTGATGCTGGCGAACTATTCGGCCGGCGTTTGCGGGCGGGTGTCTTCACCGGGCCTTAACGTCAGGAAAATGTGTCTGAAAGCCAACACGCCCGGCGCGGTAACCTGGCTCGACACGCCGAAGAGATTCTTGTCCACACAAACGGCGTCGCGTTGTATGGCCGTTAACAGCAGTGATGTCGTAACGGGCCGTATTGATCCACAGGTTCTCCACACCCCGCTCAACACAGACGTCGACGGATATGCACATGCGATGCACAGCTCCATAAACAGTGGCCCCTTGGAGTACTTGCCAGCAACGTTTAGCGTCTTCCCGGCGCTAGGCGATGTGGGTGACTTGGGCGGTGGTGTCGGTGCGGCG
ACTTACGCTCTGGATAGGTTGTCGAATATGCGTTCGGGTGCTTGTGTCGGAGGAGGTGAGAGCCCATGGCGGTCGTTGATGACCGGTGGCGGTACTAGTTAATAATAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCAC
CTCGACCCCAAAAACTTGATTAGGTGATGGTTCACGTAGTGGCATCGCCCTGATAGACGTTTTCGCCCTTTGACGTGGAGTCCACGTTCTTATAGTGGACTCTGTCAAACTGGAACAACACTCACCCTATCTCGTCTATTCTTTGATTTATAGCATTTGCGAATCGCTATGGTTAAATGACCTGATACAAACTACGGCGAATTAAAAAATTAACGCCCTTACAA二、通过基因工程技术克隆Rvl352抗原表位编码基因I、依据序列表中的序列2设计与合成扩增Rvl352抗原表位的一对引物上游引物(5’端含限制性内切酶Nhe I)5，一 CTAGCTAGCGGTGCACGCGCCGAAACC — 3’下游引物(5’端含限制性内切酶Xho I和Spe I)5，—CCGCTCGAGTTATTATTAACTAGTACCGCCACCAGAGATACGCATCCAAAGCT — 3’扩增片段333bp2、Rv1352 基因合成根据上面的设计，通过基因合成Rvl352333bp的PCR产物，于I. 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定合成的基因片段。图2为基因合成的Rvl352DNA片段的琼脂糖电泳图，测序结果证明，图中箭头所指的DNA条带就是Rvl352基因合成PCR产物在I. 2%琼脂糖电泳胶上的位置；左侧第一个泳道为TaKaRa公司的DL2000分子量标准(从上到下的6个条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp)。3、回收目的基因片段琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，定量后，贮存于_20°C备用。4.重组质粒的构建用限制性内切酶Nhe I和Xho I双酶切纯化后的Rvl352基因合成PCR产物和表达载体pET30aSETB质粒DNA，于1%琼脂糖凝胶电泳，切取Rvl352基因片段和pET30aSETB质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，Rvl352基因片段与pET30aSETB质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，10 μ I反应体系如下
2χ连接缓冲液5μ1
pET30aSETB 拔休!μ1
PCR产物2μ1
T4DNA连接酶Ιμ
无菌水补至10 μ 混匀后置于16°C连接过夜，75°C灭活lOmin，冰浴后直接进行转化。5.连接产物的转化次日取目的基因片段与载体pET30aSETB连接产物5μ I加入含有100 μ I大肠杆菌DH5 α感受态细胞的离心管中，冰浴O. 5h ;放入42°C水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min ;加入LB培养液400 μ 1，37°C恒温摇床培养Ih ;加入X_Gal60 μ 1，IPTG4y 1，混匀，取出200 - 400 μ I涂布于含有50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37°C恒温培养箱培育14h。6.质粒的提取根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒，定量后，置-20°C储存备用。7.鉴定重组质粒(I)PCR扩增鉴定以挑选的菌落质粒DNA为模板，以上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在I %琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为Rvl352/pET30aSETB。(2)序列测定直接挑选一个克隆送公司进行T7通用引物正向测序验证测序。测序结果与设计的基因组序列一致，其核苷酸序列如下，在序列表中如序列4所示，其中，GCTAGC 为 Nhe I 酶切位点，GGTGGCGGT 为连接臂，ACTAGT 为 Spe I,CTCGAG 为 Xho I。TTGGAGGGTAATTACCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCGGTGCACGCGCCGAAACCGGTGAGCAATTCCCCGGGGATGGGGTGTTTCTCGTGGGAACTGACATTGCGCCAGGCACCTACCGCACGGAGGGGCCGTCGAATCCCCTTATTTTGGTGTTCGGCAGGGTGTCCGAGCTCTCAACCTGCTCATGGTCGACACACAGC
GCACCCGAGGTGAGCAATGAGAACATTGTCGACACCAACACCTCATGGGCCCGATGTCAGTGGTGATCCCGCCGACCGTGGCAGCCTTCCAGACGCATAACTGCAAGCTTTGGATGCGTATCTCTGGTGGCGGTACTAGTTAATAATAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATTATCCGGATTGGC
GAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTA
CGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAAGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAATGAGCTGATTTAACAAAATTTAACGCGAATTTACAAATATTAACGCTTACAATTTAGTGGCACTTTTCCGGGAAATGGGCCGCGGAACCCCTATTTTGTTATTTTTTCTAAATACATTCCAAATATGTATCCGCCTCATGAATAATTCTTAGAAAACTCCATTCGAGGCATCGATGAAACTGCATTTATTTCTTATCCGGATTATTCATACCTATTTTTGAAAGGCGTTCCTGGATGAAGGAAACTCCCTAGCGAGCTTCTAGGATGGCGAGATTCCTGGGTAATCCGGATTTCGCGGATTCCGCAATCATGGTTA三、通过基因工程技术克隆Rv0057-Rvl352融合编码基因I.重组质粒的构建用限制性内切酶Spe I和Xho I双酶切Rv0057/pET30aSETB质粒DNA，用NheI和XhoI双酶切Rvl352/pET30aSETB质粒DNA，于1%琼脂糖凝胶电泳，切取Rv0057/pET30aSETB质粒片段和Rvl352基因片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，Rvl352基因片段与Rv0057/pET30aSETB质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，10 μ I反应体
系如下
2χ连接缓冲液5μ1
Rv0057/pET30aSETB 故休Ιμ
Rvl352基因片段2μ1
T4DNA连接酶Ιμ
无菌水补至10 μ 混匀后置于16°C连接过夜，75°C灭活lOmin，冰浴后直接进行转化。2.连接产物的转化次日取Rvl352基因片段与Rv0057/pET30aSETB DNA片段连接产物5 μ I加入含有100 μ I大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞的离心管中，冰浴O. 5h ;放入42°C水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min ;加入LB培养液400 μ 1，37°C恒温摇床培养Ih ;加入X_Gal60 μ 1，IPTG4 μ 1，混匀，取出200 - 400 μ I涂布于含有50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37°C恒温培养箱培育14h。3.质粒的提取根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒。4.鉴定重组质粒(I)PCR扩增鉴定以挑选的菌落质粒DNA为模板，分别以Rv0057和Rvl352上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为Rv0057-Rvl352/pET30aSETBo(2)序列测定直接挑选一个克隆送公司进行T7和T7t双向测序验证测序。测序结果与设计的基因组序列一致，其核苷酸序列如下，在序列表中如序列5所示，其中，GCTAGC为Nhe I酶切位点，GGTGGCGGT为连接臂，ACTAGC为Nhe I和Spe I产生的位点，编码Thr和 Ser，ACTAGT 为 Spe I。TAAGTTACGGTACAATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCGTGGTGACCGCGGTCGGCCGCCGCCGGGGTTTCGCCATGCCCTGGGTGTCCACCGCACGGTCCGGTGCGGTGATGCTGGCGAACTATTCGGCCGGCGTTTGCGGGCGGGTGTCTTCACCGGGCCTTAACGTCAGGAAAATGTGTCTGAAAGCCAACACGCCCGGCGCGGTAACCTGGCTCGACACGCCGAAGAGATTCTTGTCCACACAAACGGCGTCGCGTTGTATGGCCGTTAACAGCAGTGATGTCGTAACGGGCCGTATTGATCCACAGGTTCTCCACACCCCGCTCAACACAGACGTCGACGGATATGCACATGCGATGCACAGCTCCATAAACAGTGGCCCCTTGGAGTACTTGCCAGCAACGTTTAGCGTCTTCCCGGCGCTAGGCGATGTGGGTGACTTGGGCGGTGGTGTCGGTGCGGCGACTTACGCTCTGGATAGGTTGTCGAATTATGCGTTCGGGTGCTTGTGTCGGAGGAGGTGAGAGCCCATGGCGGTCGTTGATGACCGGTGGCGGTACTA GCGGTGCACGCGCCGAAACCGGTGAGCAATTCCCCGGGGATGGGGTGTTTCTCGTGGGAACTGACATTGCGCCAGGCACCTACCGCACGGAGGGGCCGTCGAATCCCCTTATTTTGGTGTTCGGCAGGGTGTCCGAGCTCTCAACCTGCTCATGGTCGACACACAGCGCACCCGAGGTGAGCAATGAGAACATTGTCGACACCAACACCTCTATGGGCCCGATGTCAGTGGTGATCCCGCCGACCGTGGCAGCCTTCCAGACGCATAACTGCAAGCTTTGGATGCGTATCTCTGGTGGCGGTACTA GTTAATAATAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGAGCGAGTCAC四、Rv0057-Rvl352工程菌的诱导表达及鉴定将Rv0057-Rvl352大肠杆菌工程菌接种于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37°C恒温振荡器培养过夜，然后按1%转种到IOml含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37°C恒温振荡器培养至OD6tltl为O. 6 — O. 8时，加入IPTG，诱导3 — 4hr。将I X载样缓冲液150 μ I加入来自Iml菌液的沉淀样本，混悬后，置100°C沸水浴5min，于12000rpm离心lOmin，取上清液40 μ I进行SDS-PAGE，电泳条件为积层胶恒流IOmA,分离胶恒压15mA，待溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h ;用脱色液脱色至条带清晰。Rv0057-Rvl352/pET30aSETB菌体在相对分子质量30. 5kDa位置附近有浓重的表达条带出现，诱导3-4小时表达量最多，结果见图3。图3 为 Rv0057-Rvl352/pET30aSETB 大肠杆菌工程菌 IPTG 诱导前后 SDS-PAGE 结果，其中I :蛋白质分子量标准(北京天根生化科技有限公司预染蛋白Marker111:94，60，45，27，18kD)；2:基因工程菌诱导前；
3 :基因工程菌诱导后I小时；4 :基因工程菌诱导后2小时；5 :基因工程菌诱导后3小时；6 :基因工程菌诱导后4小时。七、Rv0057_Rvl352重组蛋白的纯化将诱导菌超声破碎后,采用Novagen公司生产的His. Bind蛋白纯化试剂盒按试剂盒说明书纯化Rv0057-Rvl352融合蛋白，SDS-PAGE电泳可见纯化的30. 5kDa蛋白呈一条带，结果见图4。图4为Rv0057_Rvl352/pET30aSETB大肠杆菌工程菌的表达形式和纯化的SDS-PAGE结果，其中I :蛋白质分子量标准(北京天根生化科技有限公司预染蛋白Marker111:94，60，45，27，18kD)；2:基因工程菌诱导前；3 :基因工程囷诱导后；4 :基因工程菌表达菌体超声破碎后高速离心分离出的上清(可溶性部分)样品；5 :基因工程菌表达菌体超声破碎后高速离心分离出的沉淀(不可溶性部分)样品;6:纯化后蛋白样品。以下结合具体的实施例详细说明本发明的应用，各实施例中的抗原原料均可通过上述制备方法获得，但不应构成对本发明实施范围的限定。实施例2将本发明实施例I所构建、纯化的Rv0057-Rvl352融合蛋白应用于结核病的血清学诊断。以其作为化学发光免疫实验的诊断抗原，应用于临床标本的试验，获得了较好的诊断效果，与目前商品化的三个结核抗体检测试剂盒比较，显著地提高了结核病诊断的灵敏度。ELISA检测程序如下所示I.实验标本共选择103例血清标本，分为两组(I)结核病组临床上经影像学、实验室检查及抗结核治疗而确诊的活动性结核病患者54例，其中男35例，女19例，平均年龄43. I±18. 8岁。包括肺结核、结核性胸膜炎、结核性心包炎、结核性脑膜炎、泌尿系结核等。(2)非结核对照组临床上经影像学、实验室检查及治疗效果而确诊的非结核呼吸疾病患者49例，其中男25例，女24例，平均年龄61. 3±20. 8岁。包括肺炎、慢性支气管肺炎、支气管哮喘、肺癌、支气管扩张合并感染、呼吸道感染等。2.实验仪器和试剂仪器化学发光分析仪KPS-KM为北京科美东雅科技发展有限公司公司产品。试剂Rv0057-Rvl352融合蛋白，3个商品化的结核抗体诊断试剂盒(包括韩国SD标准诊断公司、上海奥普生物医药有限公司、北京现代高达生物技术有限责任公司)，包被缓冲液(O. 05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pH9. 6)，封闭液(PBS_2%小牛血清)，洗涤液(PBST，PBS-0. 05%吐温，ρΗ7· 4)，样本稀释液(PBST-2%小牛血清，ρΗ7· 4)，酶标第二抗体(HPR标记的羊抗人IgG)，化学发光底物液(用前15分钟将A与B试剂按1:1配制)。 3.实验方法(I)抗原包被用包被缓冲液将重组蛋白抗原稀释至IOyg/ ml，每孔加100 μ I。每板留I个孔，只加包被缓冲液，作为空白对照。置4°C过夜。次日用PBST洗板3次，3分
钟/次。(2)封闭每孔加PBS-2%小牛血清200μ 1，置37°C孵育I小时。用PBST洗板3次，3分钟/次。(3)加待检样品用PBST-2%小牛血清稀释待检样品，充分混匀后，每孔加100 μ 1，做2个平行孔；同时做空白、阴性及阳性孔对照，置37°C孵育40分钟。用PBST洗板3次，3
分钟/次。(4)加酶标二抗用PBST-2%小牛血清新鲜稀释酶标第二抗体，充分混匀后，每孔加100μ 1，置37°C孵育40分钟。用PBST洗板6次，8分钟/次。(5)加底物液每孔加100 μ I新鲜配制的化学发光底物液，立即放入化学发光分析检测仪，5分钟读取发光强度。4.结果实验结果见表1，Rv0057-Rvl352融合蛋白用作抗原检测结核抗体的特异性(为91. 8%)明显高于上海奥普生物医药有限公司(为66. 7%)和北京现代高达生物技术有限责任公司(为84. 8%)的结核抗体诊断试剂盒，略低于韩国SD标准诊断公司的结核抗体诊断试剂盒(为97. 0%)。Rv0057-Rvl352融合蛋白的灵敏度(为66. 7%)明显高于韩国SD标准诊断公司(为24. 1%)、北京现代高达生物技术有限责任公司(为33. 3%)的结核抗体诊断试剂盒和传统的涂片和培养(为20. 4%)，略低于上海奥普生物医药有限公司的结核抗体诊断试剂盒(为77.8%)。本发明的融合蛋白用作抗原检测结核抗体无论是菌阳还是菌阴的活动性结核病患者均具有较高的检出率。结果表明与现有商品化的结核抗体检测试剂盒和传统的涂片、培养相比，本发明所构建的结核分枝杆菌特异性融合蛋白，在对结核病诊断的灵敏度和特异性方面具有明显的优势。因此，本发明在结核病血清学快速诊断方面具有广泛的应用前景。表I应用化学发光酶免疫方法检测结核和非结核血清中抗结核抗体
权利要求
1.一种新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白，其由RV0057和RV1352两种蛋白的抗原表位依次连接构成，Rv0057蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列I所示；Rvl352蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
2.根据权利要求I所述的新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白，其特征在于所述的Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。
3.权利要求I或2所述的新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白的制备方法，包括如下步骤 (O分析结核分枝杆菌Rv0057、Rvl352的基因序列和蛋白质结构，确定两个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序；依次将Rv0057和Rvl352蛋白抗原表位连接，形成融合蛋白；Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端; (2)两个蛋白融合的克隆 ①在Rv0057上游弓I物添加NheI酶切位点，在Rv0057下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I、Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nhe I和Xho I双酶切后，插入用Nhe I和Xho I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌DH5a受体菌中；经过质粒提取，经T7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv0057/pET30aSETB ； ②在Rvl352上游引物添加NheI酶切位点和编码I个疏水性氨基酸的DNA序列，在Rvl352下游引物添加Spe I、Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nhe I和Xho I双酶切后，插入用Nhe I和Xho I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌DH5 α受体菌中；经过质粒提取，经Τ7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rvl352/pET30aSETB ； ③用SpeI和Xho I双酶切Rv0057/pET30aSETB质粒作为载体；用Nhe I和XhoI双酶切Rvl352/pET30aSETB质粒，获得的Rvl352片段插入Rv0057/pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌BL21 (DE3)受体菌中；经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv0057-Rvl352/pET30aSETB，并使Rv0057蛋白抗原表位与Rvl352蛋白抗原表位之间通过连接臂相联接。
4.权利要求I或2所述的新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白在制备结核抗体诊断试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其制备和应用，属结核病医学免疫学诊断技术领域。本发明的融合蛋白由Rv0057和Rv1352两种蛋白的抗原表位依次连接构成，Rv0057蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列1所示；Rv1352蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示。与目前商品化的抗体检测试剂盒相比，本发明所制备的结核分枝杆菌特异性融合蛋白，在结核病血清学诊断方面均具有敏度高、特异性强、并与其它抗原具有互补性的优点，可用于检测血清、胸水等体液标本中特异的抗结核抗体。
文档编号C12R1/32GK102702360SQ20121023210
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者冯金栋, 吴雪琼, 张俊仙, 梁艳, 赵卫国, 阳幼荣 申请人:中国人民解放军第三〇九医院