专利名称：与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记SIsv0690的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，特别是涉及一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在谷子叶片颜色基因定位或谷子遗传育种中的用途。
背景技术：
我国是谷子(Setaria italica L. Beauv.)的原产国，是世界上谷子的集中种植国，谷子在我国的国民经济和社会生产中占有重要的地位，对旱作生态农业建设有重要意义。因此，加速谷子的育种进程尤为重要。由于谷子只是区域重要性作物，因此当前有关谷子的研究手段和方法相对较落后，如何应用先进科学的研究手段搞好谷子育种是一个严峻的问题。随着分子生物学的发展，分子标记技术的出现，为谷子的遗传研究及育种开辟了新 的思路和手段。开发具有我国特色的重要性状基因的分子标记并进行辅助选择育种研究，将对提高我国谷子育种水平起到促进作用。植物叶色是叶绿体中各种色素的综合表现，正常叶片中叶绿素占优势，通常表现为绿色。叶色变异是高等植物中突变频率较高且易于鉴定的突变性状。迄今为止，在水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、棉花、烟草、玉米、向日葵、番茄、黄瓜、马铃薯、桑树等几乎所有高等植物中都发现了叶色突变体。其突变基因直接或间接影响光合色素，特别是叶绿素的合成和降解，导致各种色素的含量和比例改变，从而引起植物叶色变异。近年来，叶色突变体的利用价值越来越受到关注，现已成为研究植物光合作用机制、叶绿素生物合成途径、叶绿体的发育和遗传控制机理的特殊材料，同时叶色突变体在高光效育种和标记性状的利用上也具有重要的应用价值。一些叶色变异被作为标记性状用于良种繁育和杂交种生产。随着拟南芥、水稻等模式植物基因组测序的完成，叶色突变体在功能基因组学上的研究价值受到越来越多的关注，它们已成为研究光合系统结构、基因功能及其调控机制的理想材料。据不完全统计，目前报道的水稻叶色突变的相关基因已经超过80个，这些突变体大致可分为白化型、黄化型、条纹型、转绿型、斑马叶等5大类。但对于谷子叶色基因以及与之紧密连锁的分子标记的研究基本没有文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记。本发明的另一目的是提供一种可用于PCR扩增与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记的引物对，以及由该引物对扩增获得的分子标记。本发明的再一目的是提供上述分子标记在谷子叶片颜色基因定位、检测以及谷子辅助育种中的用途以及上述分子标记的检测方法。本发明的目的还包括提供一种包括上述分子标记的重组载体，以及含有该重组载体的重组细胞；提供一种包括使用上述分子标记的谷子叶片颜色基因的定位方法，和使用所述分子标记的谷子辅助育种方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记含有Seq ID No. I所示序列；优选的所述分子标记具有Seq ID No. I所示序列。本发明还公开了一种扩增与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记的引物对，所述引物对的引物I含有Seq ID No. 2所示序列，引物2含有Seq ID No. 3所示序列；优选的所述引物I具有Seq ID No. 2所不序列，引物2具有Seq ID No. 3所不序列；Seq ID No. 2 :5，-CAATTACACTCTAGTCTTGCC-3，；Seq ID No. 3 :5，-TGCACAAAGACCCTTACGTT-3，。本发明还公开了一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记是 由上述的引物对以叶片偏绿色的谷子基因组DNA为模板经PCR扩增得到的。优选的由上述引物对扩增得到的分子标记含有Seq ID No. I所示序列。在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)为谷子基因组中Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SeqID No. I的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因组中的序列，优选的，为谷子基因组中Seq ID No. I的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测叶片偏绿色的谷子基因组DNA中的该分子标记，必然能够检测或扩增得到含有Seq ID No. I所示的序列。Seq ID No. I的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10，00(^ 、小于5，00(^ 、小于2，OOObp、小于 I, 500bp、小于 I, 200bp、小于 I, OOObp、或者小于 800bp。在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的Seq ID No. I的5’端和/或3’端可操作地连接有人工序列和/或控制序列，例如启动子、增强子、终止子、酶切位点、引物序列等等。其中，术语“可操作地”在本发明中定义为一种如下构象，在该构象中，控制序列例如启动子被适当地置于Seq IDNo. I的一个位置上，以致该控制序列指导Seq ID No. I编码的多肽的产生。本发明还公开了一种重组载体，其含有本发明的分子标记。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以理解，根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还公开了一种含有所述重组载体的重组细胞。本发明还公开了本发明的分子标记的制备方法，包括下述步骤使用叶片颜色偏绿色的谷子的基因组DNA作为模板，以上述引物对进行PCR扩增，得到的632bp扩增产物即含有所述分子标记；优选地，还包括将PCR扩增产物进行纯化的步骤。对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的分子标记。本发明还公开了所述分子标记的检测方法，包括步骤根据上述分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测谷子基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记。优选的，所述引物为上述分别含有Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的引物对。例如，可以以被检测谷子的基因组DNA为模板，以上述引物(Seq ID No. 2和SeqID No. 3)进行PCR扩增，得到扩增产物。可以将得到的扩增产物进行测序或者凝胶电泳。本发明还公开了所述的分子标记在谷子叶片颜色基因定位或检测中的用途。
本发明还公开了一种谷子叶片颜色基因定位的方法，所述方法包括使用本发明的分子标记的步骤。本发明还公开了所述的分子标记在谷子辅助育种中的用途。本发明还公开了一种谷子辅助育种方法，所述方法包括检测本发明的分子标记或分子标记引物对的步骤。本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选谷子叶片是否含有控制叶片颜色为偏绿色的颜色基因(例如，可以参考，DNA分子标记在小麦抗病育种中的用途，陇东学院学报(自然科学版)，2006年4月第16卷第I期，P65-69)。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对。所述检测还可以通过测序方法进行。该谷子辅助育种方法具有简便、快速、高通量的优点。
在本发明中，具体地，所述谷子可以为张谷I号、谷子A2不育系、张杂谷3号、或张杂谷3号自交产生的F2代。其中，张谷I号、张杂谷3号或张杂谷3号自交产生的部分F2代叶片颜色偏绿色；谷子A2不育系、张杂谷3号自交产生的部分F2代叶片颜色偏黄色。由于采用以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于本发明提供了与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，该分子标记将基因组DNA序列与谷子叶片颜色基因联系起来，有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立；所述分子标记与谷子叶片颜色基因的遗传紧密连锁距离为0. 15cM。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于谷子育种实践和资源及品种鉴定。
图I :分子标记引物(Seq ID No. 2和Seq ID No. 3)对F2代480个单株扩增的部分结果。其中泳道1-12为F2代中12株谷子叶片颜色偏绿色的单株的PCR扩增产物；泳道13-24为F2代中12株叶片颜色偏黄色的单株的PCR扩增产物。泳道M为marker，其为IOObp DNA Ladder ;其分子量包括、1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 以及 IOObp0
具体实施例方式本发明公开了一种引物对以及与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记SIsv0690。利用本发明的引物对，以谷子基因组DNA为模板进行PCR，可以得到与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，该分子标记在本发明中命名为分子标记SIsv0690。需要指出的是，本领域技术人员可以理解，除了通过上述PCR扩增获得本发明的分子标记外，还可以通过化学合成获得本发明的分子标记。本发明的引物对分别含有序列表Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列，Seq ID No. 2 :5，-CAATTACACTCTAGTCTTGCC-3，；Seq ID No. 3 :5，-TGCACAAAGACCCTTACGTT-3’本领域技术人员熟知，在上述Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列中，可在其5 ’端或3’端分别增加I 10个碱基，所增加的碱基类型可根据谷子基因组DNA上与Seq IDNo. 2和Seq ID No. 3相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定，由此得到的引物对与SeqID No. 2和Seq ID No. 3的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的DNA序列相同)。因此，上述在Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的5’端或3’端分别增加I 10个碱基并能扩增得到基本相同DNA片段的 引物对，均包括在本发明的引物对中。在本发明具体的实施方式中，本发明的引物对优选为Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列。本发明将父本叶片偏绿色和母本叶片偏黄色的纯合子杂交，获得Fl代(张杂谷3号)，再以Fl代自交产生F2代群体，共480个单株。优选的采用SV分子标记开发方法，首先对父本进行de novo测序(60X contig N50 22K, scaffold N50 320K ;Total size :400Mb)，母本重测序(IOX)；然后根据父母本测序数据，利用华大自主开发的SOAP软件比较父母本之间的序列差异，分别在父本差异序列的5’端和3’端外侧约50bp位置，随机选取20bp左右的长度设计差异序列扩增的引物，根据不同的差异序列设计了 1105对引物。以父母本及Fl的DNA为模板进行扩增，从1105对引物中筛选出616对具有多态性和有效性的引物。采用开发出的616对引物，对F2群体的480个个体进行PCR检测，并进行数据统计分析，用Map Maker3. 0软件进行遗传图谱绘制，得到本发明所述的与叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，及其扩增引物。采用筛选出的引物对扩增得到的父本序列，即本发明中的分子标记SIsv0690。对F2个体进行性状分析，并根据基因性状数据和表型性状数据将谷子叶片颜色基因定位在遗传图谱上。下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例I :谷子F2代分离群体的构建父本抗拿捕净，株型高，旗叶长而窄，刚毛红色，颖壳红色，可育，叶色偏绿，花粉黄白色，抽穗期为晚期。父本为张谷I号种子。母本不抗拿捕净，株型矮，旗叶短而宽，刚毛绿色，颖壳绿色，部分不育，叶色偏黄，花粉棕色，抽穗期为早期。母本为谷子A2不育系种子。F2群体构建父本和母本杂交得到Fl代(Fl叶色为偏绿)，F1自交得到F2。其中Fl是张杂谷3号种子。共得F2代单株480株，上述张谷I号种子、谷子A2不育系种子及张杂谷3号种子可参见中国专利申请《与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记SIsv0372》，
发明者全志武, 夏秋菊, 张厚宝, 张耕耘 申请人:深圳华大基因科技有限公司