大豆疫霉根腐病防治生物种衣剂及其制备方法、使用方法与流程

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种大豆疫霉根腐病防治生物种衣剂及其制备方法、使用方法。

背景技术：

种子包衣技术的起始是20世纪30年代，英国Germain种子公司在作物上首次成功研发出种子包衣剂，80年代初期苏联研制出由高分子集合物黏着剂和植物生长调节剂复配而成的种衣剂，种衣剂技术飞跃发展。目前，世界上农业发达国家的种子包衣技术及程度都很高，包含了玉米、水稻、小麦、大豆、谷子、蔬菜、棉花、花生、蔬菜等。

我国种衣剂的研究和应用，自20世纪80年代开始飞快发展，到目前为止在农作物中已普遍使用，我国市场上现流行的主要种衣剂是化学种衣剂，其主要成分围绕苯醚、咯菌腈、嘧菌酯、噻虫嗪、甲霜灵、戊唑醇、吡虫啉、灭菌唑、硅噻菌胺等化学药品制备而成。在使用过程中存在一定的风险和危害。这些化学种衣剂产品一般成分单一、或功能片面、或有毒性高，在使用过程中存在一定的风险和危害。虽然目前市场上出现了少量的生物种衣剂，解决了种衣剂毒性残留问题，但在防病防虫方面作用效果并不显著。

技术实现要素：

为了克服背景技术存在的不足，本发明提供一种大豆疫霉根腐病防治生物种衣剂及其制备方法、使用方法，该种衣剂具有环保、高度抑制大豆疫霉根腐病的发生，提高作物抗逆能力、壮苗、提高产量和改善品质的综合作用。

该大豆疫霉根腐病防治生物种衣剂按质量百分比由下列组分组成：20％的多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4菌剂、10％的植物激活剂、5％的生物调节剂、10％的营养元素溶液、10％的助剂、余量为水；所述的植物激活剂是浓度为0.5mmol/L苯并噻二唑水溶液；所述的生物调节剂为浓度2mg/L的烯效唑水溶液。

所述的多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4菌剂保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No 11789；保藏地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2015年12月4日。多伦湖链霉菌M1-4菌剂对引起大豆疫霉根腐病的主要病原菌，包括大豆疫霉(P.sojae)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporun)具有较强抑制效果，另外对其他病原菌同样具有抑制作用，例如燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)、小麦赤霉菌(FusariumGraminearu)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)， 菌剂孢子浓度为≥10¹¹个/ml。

所述的植物激活剂是浓度为0.5mmol/L苯并噻二唑水溶液，将0.5mmol苯并噻二唑用10ml乙醇溶解后加蒸馏水定容至1L制成。在离体条件下苯并噻二唑并没有杀菌作用，对所述链霉菌没有抑制作用。该植物激活剂用于防护农业植物病害和园艺植物病害的防治，主要通过诱导作物产生抗病性物质激活植物对病虫害的抗性，防治对象包括卵菌纲的绵霉属、丝囊霉属、腐霉属、疫霉属、指梗霉属、单轴霉属、假霜霉属、霜霉属等二十余个属产生的病害。诱导产生的抗病性具有长效和广谱的特性，诱导产生的抗病效果存在滞后性，不易产生抗药性，对不具有致病性的菌类无影响，有利于维持生态平衡和进行环境保护。

所述的营养元素溶液按质量百分比由下列组分组成：0.5％的钼酸铵、1％的硼酸、1％的硫酸锌、1％的硫酸锰、1％的EDTA铁，余量为水。该营养元素溶液中的组分均为大豆敏感性元素，适量的添加对大豆的产量和品质均有良好效果。

所述的生物调节剂为浓度2mg/L的烯效唑水溶液，将2mg烯效唑溶于10ml乙醇，用蒸馏水定容至1L制成。烯效唑可以调节植物根冠比，调节植物中赤霉素、脱落酸和细胞分裂素等内源激素，提高植物对逆境的抵抗。

所述的助剂按质量百分比由下列组分组成：1％的羧甲基纤维素钠、10％的聚乙烯醇、0.4％的罗丹明B、3％的丙三醇、0.5％的平平加O-25、余量为水。该助剂具有缓释功能，能够延长种衣剂的作用期，其成膜性和包衣强度达到同类产品标准。所述助剂对真菌、放线菌和细菌无毒性或弱毒性，链霉菌M1-4可以在种衣剂中存活，可以在土壤中繁殖，增强抑制大豆疫霉菌作用。

该大豆疫霉根腐病防治生物种衣剂的制备方法如下：按助剂中各组分的质量百分比将1％的羧甲基纤维素钠和10％的聚乙烯醇加入水中，加热到80℃、搅拌20分钟至成膜剂完全溶解，降到室温后加入0.4％的罗丹明B、3％的丙三醇、0.5％的平平加O-25制成助剂；再按种衣剂中各组分的质量百分比向助剂中加入20％的多伦湖链霉菌M1-4、5％的生物调节剂、10％的营养元素溶液，10％的植物激活剂及余量的水，制备成对大豆多种病菌和虫害具有抑制作用的种衣剂。

该将种衣剂和大豆种子按照质量比1：(20-30)的比例混合，阴凉环境下风干，得到大豆包衣种子。

本发明具有如下有益效果：该大豆疫霉根腐病防治生物种衣剂用于防治大豆苗期根部病害，尤其对大豆疫霉根腐病有良好的防治作用；提高大豆抗逆性，对环境胁迫和非环境胁迫的抗性均有增强；增加根冠比，起到壮苗的作用；补充大豆敏感元素，促进大豆产量形 成、提高大豆品质。该种衣剂为悬浮型生物种衣剂，储藏过程有分层，室温下摇晃可恢复原状。产品质量符合国家标准种衣剂规范要求：pH值为6.5-7.5，悬浮率≥98％，粘度≤0.06Pa·s(25℃)，脱落率≤5％，成膜性和低温、热储存稳定性合格。

附图说明

图1为大豆疫霉发病盆栽图。

图2为大豆生物种衣剂对大豆疫霉盆栽防效图。

具体实施方式

下面结合图1及图2对本发明做进一步说明：

该大豆疫霉根腐病防治生物种衣剂按质量百分比由下列组分组成：20％的多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4菌剂、10％的植物激活剂、5％的生物调节剂、10％的营养元素溶液、10％的助剂、余量为水；所述的多伦湖链霉菌M1-4菌剂的孢子浓度为≥10¹¹个/ml；所述的植物激活剂是浓度为0.5mmol/L苯并噻二唑水溶液；所述的生物调节剂为浓度2mg/L的烯效唑水溶液。

所述实施方式中的大豆疫霉根腐病防治生物种衣剂由下述方法制备：(一)制备助剂：按助剂中各组分的质量百分比将1％的羧甲基纤维素钠和10％的聚乙烯醇加入水中，加热到80℃、搅拌20分钟至成膜剂完全溶解，降到室温后加入0.4％的罗丹明B、3％的丙三醇、0.5％的平平加O-25制成助剂。(二)制备植物激活剂：将0.5mmol苯并噻二唑用10ml乙醇溶解后加蒸馏水定容至1L制成。(三)制备生物调节剂：将2mg烯效唑溶于10ml乙醇，用蒸馏水定容至1L制成。(四)制备营养元素溶液：按质量百分比将0.5％的钼酸铵、1％的硼酸、1％的硫酸锌、1％的硫酸锰、1％的EDTA铁溶于余量的水中制成。(五)制备种衣剂：按种衣剂中各组分的质量百分比向助剂中加入20％的多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4菌剂、5％的生物调节剂、10％的营养元素溶液，10％的植物激活剂及余量的水制成。

其中，平平加O-25、罗丹明B购置于天津市祥瑞染料有限公司；钼酸铵、硼酸、硫酸锌、硫酸锰、丙三醇购置于天津市大茂化学试剂厂；烯效唑、EDTA铁、羧甲基纤维素钠和聚乙烯醇购置天津市永大化学试剂有限公司；苯并噻二唑(BTH)购置于上海澄绍生物科技有限公司。

所述的多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4的筛选方法，包括如下步骤：

(1)从湖泊采集底泥样品，在阴暗通风处晒干，用研钵研磨成粉末；

(2)利用稀释法进行分离，将土样放入装有玻璃珠和无菌水的瓶中，震荡，静置后，稀释，制备质量浓度为10^-3、10^-4、10^-5稀释液，吸取稀释液滴加到加入放线菌酮(50μg/ml)和萘啶酮酸(40μg/ml)的高氏一号培养基平板上，涂布均匀，将培养皿放在温箱倒置培养，生长温度28℃，培养5-7天，分离纯化；

(3)采用平板对峙法筛选对大豆疫霉菌有抑制作用的放线菌：将纯化的放线菌菌株，用高氏一号培养基培养，将放线菌转接到胡萝卜培养基中心位置，用Φ9cm培养皿培养3天；大豆疫霉菌在胡萝卜培养基上培养4-5天后，裁成Φ0.5cm菌丝块，接种到含胡萝卜培养基的培养皿四周十字交叉线位置，培养7-10天后观察测量抑菌圈直径，选择拮抗作用明显的放线菌，保存。该菌株经生理生化特征及分子鉴定后，推测该菌为链霉菌属新种，并将命名为多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4。

所述的多伦湖链霉菌(Streptomyces dorenlacusensis)M1-4菌剂的制备方法：

(1)菌种的扩大培养：取多伦湖链霉菌M1-4菌株的分生孢子，接种到液体种子培养基中，摇床培养得到放线菌液体种子；摇床培养温度28℃，转速180r/min培养48h。所述液体种子培养基的配方为：酵母提取物4g/L、葡萄糖4g/L、麦芽抽提物10g/L及CaCO₃ 2g/L，pH 7.3；

(2)菌剂的制备：将黄豆饼粉和麦麸按按质量比1:1混合均匀后调节含水率至55％、pH至8，每Kg基质中添加5g CaCO₃，混匀后，装入发酵瓶中121℃灭菌30min后，按质量比15％的比例接入步骤(1)制备的菌液，28-30℃、搅拌速度为60rpm/min，发酵培养7天，加入无菌水过滤，制得多伦湖链霉菌M1-4菌剂，多伦湖链霉菌M1-4菌剂的孢子浓度为≥10¹¹个/ml。

本大豆疫霉根腐病防治生物种衣剂对大豆疫霉根腐病防治效果的盆栽防效试验：

以大豆疫霉根腐病感病品种绥农28为材料，以发病及大豆生物量相关指标调查为依据。盆栽使用15cm花盆，每盆装入500g重茬土壤。种衣剂和大豆种子按照质量比1：30混合，阴凉环境下风干，得到大豆包衣种子。将种衣剂处理过的种子和未处理的种子分别播种于盆中，每盆播种10粒种子，保苗6株，重复4次。在盆中生长至35天取样统计发病程度，计算病情指数，测定地上部鲜重，根鲜重考察促生效果，见表1。大豆生物种衣剂处理，表现出较好的防治效果，其发病率防治效果70％以上；大豆生物种衣剂具有明显的促生作用，能促进大豆茎叶鲜重、根鲜重的增加，分别增加87％和125％。

表1温室盆栽实验各处理对大豆疫霉根腐病防治效果、大豆生长的影响

注：大豆疫霉根腐病发病程度分为6级，0级为根系未发病；1级为根系发病率≤30％，叶片正常；2级为30％<根系发病率≤60％，叶片正常；3级为60％<根系发病率≤80％；叶片变黄，4级为根系发病率80％以上，叶片枯萎，5级为整株死亡，叶片干枯。

病情指数和防治效果分别按照下列公式计算：

病情指数＝[(病级株数x代表值)/(总株数x最高病级代表值)]x100，

防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。

本大豆疫霉根腐病防治生物种衣剂对大豆疫霉根腐病防治效果的大田防效试验：

实验在黑龙江省大庆市林甸县黑龙江八一农垦大学实验基地和黑龙江省宝泉岭科研站重茬地进行。以东农42和绥农28为材料，种衣剂和大豆种子按照质量比1：30混合，阴凉环境下风干，得到大豆包衣种子。以不同地区不同品种发病及产量相关指标调查为依据，生物种衣剂对大豆疫霉病具有良好的防治作用。应用大豆疫霉根腐病防治生物种衣剂种使大豆根腐病发病率由24.25～37.66降低到7.55～12.31，死苗率由6.25～10.91降低到1.25～6.67，见表2。应用本生物种衣剂增加了大豆的保苗率、单株粒数、百粒重，产量增加24％以上。

表2种衣剂对大豆疫霉根腐病防治效果和大豆产量的影响

注：数应用SPSS软件分析，每列不同小写字母表示在0.05水平存在显著差异。