专利名称：一种白桦叶片基因组dna提取方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及的是一种高质量白桦叶片基因组DNA提取方法。
背景技术：
高纯度基因组DNA是基因组测序、基因克隆、分子杂交、基因文库构建和分子标记等一系列分子生物学研究的前提。白桦叶片中酚类、多糖、萜类等次生物质含量较高，特别是生长在我国东北白桦，由于要适应东北地区较为严酷的地理及气候环境，体内各种次生物质种类更多、含量更高，会对DNA的提取造成更为严重的影响。因此，如何去除这些杂质以获得高质量的DNA是白桦叶片基因组DNA提取过程中面临的主要问题，也是对白桦进行分子生物学研究的前提条件。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种高质量白桦叶片基因组DNA提取方法。本发明的技术方案如下①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，加入300 U L改良STE溶液，300 y L改良CTAB溶液(改良STE溶液和改良CTAB溶液等体积)和20 y L P —巯基乙醇，混合后震荡3min ;改良 CTAB 溶液配方2. 5 % (ff/V)CTAB, 150mmol/LTris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/L NaCl ;改良SET溶液配方150mmol/L Tris-Cl(pH8. 0),20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl ；②常温5000g离心5min，弃上清；向沉淀中加入加600 y L改良CTAB溶液和20 u L ^ 一疏基乙醇70°C水浴15min后16060g离心5min ；③取上清加入等体积氯仿充分混勻，16060g离心5min,重复此步骤2次；④取上清加入等体积的无水乙醇异丙醇混合液(体积比为2:1)，上下颠倒混合均勻后常温下静置3min,6080g离心3min ；⑤倒掉上清液，用70%预冷的乙醇洗涤2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去离子水中；⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。本发明的提取方法方法能提取出高质量白桦叶片基因组DNA，其核心技术包括以下几个内容1、改良了 CTAB与STE溶液；2、采用常温下等体积的改良CTAB溶液和STE溶液洗涤经充分研磨的材料2次；3、水浴裂解温度由65°C提高至70°C ;4、在沉淀DNA时，采用无水乙醇异丙醇(体积比为2:1)混合沉淀剂，低速离心，以降低杂质的沉淀。这种方法能分离出高质量的白桦叶片基因组DNA。
图1为不同方法提取的白桦DNA电泳结果；1、2泳道为CTAB法提取的DNA ;3、4泳道为SDS法提取的DNA ;5、6泳道方法III提取的DNA电泳；7泳道方法IV (STE洗涤I次)提取的DNA ；8泳道方法V (CTAB洗涤I次)提取的DNA ；图2为方法IV提取的白桦DNA电泳结果；1.和2泳道为STE和CTAB洗涤混合液洗涤I次后提取的白桦基因组DNA ；3.和4泳道STE和CTAB洗涤混合液洗涤I次后提取的白桦基因组DNA ；5.和6泳道为STE和CTAB洗涤混合液洗涤2次后提取的白桦基因组DNA ；图3为方法IV提取的白桦DNA EcoR I与MseI酶切电泳结果；1.为白桦叶片基因组DNA;2.白桦叶片基因组DNA被EcoR I酶切后电泳结果；3.白桦叶片基因组DNA被MseI酶电泳切结果；4.标准DNA分子量；5 7泳道为重复；图4为白桦不同个体叶片基因组DNA的RAH)扩增结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。材料白桦叶片取自东北林业大学校园内已达开花结实的白桦，于8月未摘取的成熟叶片，叶片保存在_20°C冰箱。试剂CTAB 溶液(2 % (ff/V)CTAB, IOOmmoI/L Tris-Cl(pH8. 0), 20mmol/LEDTA(pH8. 0),1.4mmol/LNaCl)STE 溶液(IOOmmo 1/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0)，改良CTAB 溶液(2. 5 % (W/V)CTAB，150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl)；改良SET 溶液(150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl)；其他试剂40mmol/L疏基乙醇，lOOmmol/L Tris HCI (pH8. 0), 20mmol/LEDTA,10%SDS, IOmo 1/L LiCI (高压灭菌)，氯仿 / 异戊醇(24 :1)，Tris 饱和酚，5mol/L KAC，TE 缓冲液。EcoRI和MseI酶购自纽英伦公司。其他均为常规国产试剂。主要仪器和设备凝胶成像系统(UVP)，MIKR0120微量台式高速离心机(Hettich) ,-20°C超低温冰箱(Harris),-40°C低温冰箱(海尔公司),超纯水仪(Milipore)；DYY-1I1-12B型三恒多用电泳仪(六一仪器厂)，可见紫外分光光度计(ABI);涡旋振荡器GL-88B (江苏海门麒麟医用仪器厂)。1. DNA提取方法方法1:常规的CTAB法参照王关林等的《植物基因工程》。方法I1:SDS法参照顾洪雅的方法。方法III①向1. 5 ii L的无菌离心管加600 U LCTAB裂解液和20 ii L @ -巯基乙醇，65°C浴热5min。②从-20°C取出材料后加液氮研磨至材料成灰白色，向步骤①中的每个离心管中加约0. 04g材料，剧烈震荡混匀，65°C浴热lOmin。③随后加入1/3体积5mol/L KAC(pH8. 0)，充分混匀。再加入200 u LTris饱和酚(pH9. 5)和300 u L氯仿。轻轻震荡IOmin。④常温16060g离心lOmin，取600ii L上清液加入等体积的酚(同上)氯仿(3 1)，轻轻震荡5min。⑤常温16060g离心lOmin，取600 ii L上清液加适量无水乙醇，再加入等体积氯仿后震汤5min。⑥常温16060g离心lOmin，取上清加入2/3体积异丙醇，轻轻混匀3min。⑦常温6080g离心5min，去上清液后加适量水溶解，加入1/10体积3mol/LNaAC和2. 5倍体积乙醇_20°C沉淀30min。
⑧常温6080g离心lOmin，去上清液后用70%酒精洗涤2 3次，室温或真空干燥后加55 u LTE溶解。电泳检测DNA的完整性，A2607280测定DNA浓度和纯度。方法IV:①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，向1. 5 ii L的无菌离心管加600 U LSTE和20 u 一巯基乙醇混合震荡3min。常温5000g离心5min,弃上清；向下层沉淀中加入600 u L CTAB后剧烈振荡混匀，65°C浴热IOmin;再加入400 u L Tris饱和酚(pH9. 5)和200 u L氯仿，轻轻振荡IOmin。②常温16060g离心lOmin，取600ii L上清液加入等体积的酚(同上)氯仿(3 1)，轻轻震荡5min。③常温16060g离心lOmin，取600 ii L上清液加适量无水乙醇，再加入等体积氯仿后震汤5min。④常温16060g离心lOmin，取上清加入2/3体积异丙醇，轻轻混匀3min。⑤常温6080g离心5min，去上清液后加适量水溶解，加入1/10体积3mol/LNaAC和2. 5倍体积乙醇_20°C沉淀30min。⑥常温6080g离心lOmin，去上清液后用70%酒精洗涤2 3次，室温或真空干燥后加55 u LTE溶解。电泳检测DNA的完整性，A2607280测定DNA浓度和纯度。方法V :①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，向1. 5 ii L的无菌离心管加600 U LCTAB溶液和20 IiLP—巯基乙醇混合震荡3min。常温5000g离心5min,弃上清；向下层沉淀中加入600 u L CTAB后剧烈振荡混匀，65°C浴热IOmin;再加入400 u L Tris饱和酚(pH9. 5)和200 u L氯仿，轻轻振荡IOmin。②常温16060g离心lOmin，取600ii L上清液加入等体积的酚(同上)氯仿(3
1)，轻轻震荡5min。③常温16060g离心IOmin,取600 u L上清液加等体积氯仿后震荡5min。④常温16060g离心lOmin，取上清加入2/3体积异丙醇，轻轻混匀3min。⑤常温6080g离心5min，去上清液后加适量水溶解，加入1/10体积3mol/LNaAC和
2.5倍体积乙醇_20°C沉淀30min。⑥常温6080g离心lOmin，去上清液后用70%酒精洗涤2 3次，室温或真空干燥后加55 ii LTE溶解。电泳检测DNA的完整性，A26Q/■测定DNA浓度和纯度。VII方法V1:①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，分别用STE和CTAB溶液(等体积)与20 u L^-巯基乙醇混合震荡3min。常温5000g离心5min，弃上清。重复此步骤f 2次。②常温5000g离心5min，弃上清。向沉淀中加入加600 y L改良的CTAB溶液和20 u L ^ -疏基乙醇70°C水浴15min后16060g离心5min。③取上清加入等体积氯仿充分混勻，16060g离心5min,重复此步骤2次。④取上清加入等体积无水乙醇异丙醇(体积比为2:1)，上下颠倒混合均匀后常温静置3min,6080g离心3min。⑤倒掉上清液，用70%预冷的乙醇洗涤2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去离子水
中。 ⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。方法vn①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，加入300 U L改良STE溶液、300 y L改良CTAB溶液(改良STE溶液和改良CTAB溶液等体积)和20 y L P —巯基乙醇，混合震荡3min。②常温5000g离心5min，弃上清。向沉淀中加入加600 y L改良的CTAB溶液和20 u L ^ 一疏基乙醇70°C水浴15min后16060g离心5min。③取上清加入等体积氯仿充分混勻，16060g离心5min,重复此步骤2次。④取上清加入等体积无水乙醇异丙醇(体积比为2:1)，上下颠倒混合均匀后常温下静置3min,6080g离心3min。⑤倒掉上清液，用70%预冷的乙醇洗涤2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去离子水中。⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。方法VDI①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，分别用改良STE和CTAB溶液(等体积)与20 u 一巯基乙醇混合震荡3min。常温5000g离心5min,弃上清。重复此步骤I次。②常温5000g离心5min，弃上清。向沉淀中加入加600 y L改良的CTAB溶液和20 u L ^ 一疏基乙醇70°C水浴15min后16060g离心5min。③取上清加入等体积氯仿充分混勻，16060g离心5min,重复此步骤2次。④取上清加入等体积无水乙醇异丙醇(体积比为2:1)，上下颠倒混合均匀后常温下静置3min,6080g离心3min。⑤倒掉上清液，用70%预冷的乙醇洗涤2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去离子水中。⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。2. DNA质量检测2.1DNA完整性检测在0. 8%的琼脂糖凝胶中，于5V/cm电压下电泳，检测总DNA的完整性。2. 2DNA纯度检测通过紫外分光光度测定260nm/280nm比值判断总DNA的纯度。2. 3DNA酶切检测白桦叶片基因组DNA EcoRI单酶解，反应体积20ii L :DNA800ng，酶2U，EcoR IBuffer 2u L0 酶解条件37°C，反应 2h。
白桦叶片基因组DNA MseI单酶解，反应体积20 ii L :DNA800ng，酶2U，MseI Buffer2uL0酶解条件37°C，反应2h。白桦叶片基因组DNA 双酶切体系2. 9 ii L DNA(50ng/ u L), 5 u L 10XBuffer,
0.5u LlOO X BSA, 0. 8u L MseI (I OU/ u L), 0. 4 u L EcoRI (20U/ u L)，加离子水至 50 y L 去。酶解产物点样于1. 5%的琼脂糖凝胶上电泳、观察并拍照。2. 4白桦叶片基因组DNA PCR扩增检测
扩增体系(20ii L) :1. 2 ii LMg2+ (25mmol/L)，0. 4 ii LdNTPs (2. 5mmol/L)，0.4iiLRAPD$*(50pmol/iiL)，liiLTaq DNA 聚合酶(IU/y L)，I y 模板 DNA (40ng/U L), 2 u LlO XPCRbuffer0 扩增程序94°C 4min，然后进入下列循环94°C 45s, 56°C 45s,72°C 80s, 35个循环；72°C 7min。PCR仪为MJ-9600。扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上120V电泳2h，UVP凝胶成像系统拍照。3.结果与分析3.1CTAB法、SDS法、方法II1、方法IV和方法V提取的DNA电泳检测结果分别取2 U L DNA样品，在0. 8%的琼脂糖凝胶上用高电场(5V/cm)电泳法检测其DNA的完整性。结果表明，常规CATB法(图1中1、2泳道)、SDS法(图1中3、4泳道)，方法III提取的DNA (图1中5、6泳道);方法IV (STE溶液洗涤I次)提取的DNA (图1中7泳道)，方法V (CTAB溶液洗涤I次)提取的DNA (图1中8泳道)提取白桦基因组DNA时多糖污染严重，样孔中EB吸收明显，而且有大量的降解RNA的存在。此外，此图为电泳l:30h后的图谱，可以看出，DNA没有离开样孔，说明DNA已与多糖等次生物质相结合，在电场中无法迁移。因此,常规的CTAB、SDS法，方法II1、方法IV和方法V和均不适应富含较高多糖和次生物质的白样叶片基因组DNA提取。3. 2方法V1、VII和VDI的白桦DNA完整性和纯度的检测图2中I和2泳道为方法VI提取的白桦叶片基因组DNA电泳结果，其DNA仍然在点样孔附近，说明DNA中仍含有多糖或其也次生代谢物质。图2中3和4泳道为方法VII提取的白桦叶片基因组DNA电泳结果，其电泳后DNA条带正齐，说明提以的DNA完整、无降解，而且将叶片中的RNA已完合去除，但点样孔仍然有发亮的现象，说明提取的DNA中仍含有少量的多糖或次生代谢物质。图2中5和6泳道为方法VDI提取的白桦叶片基因组DNA电泳结果，其电泳后DNA条带正齐，说明提以的DNA完整、无降解，而且将叶片中的RNA已完合去除，而且点样孔非常干净，说明提取的DNA中已完全去除了多糖或次生代谢物质。方法IV提取的白桦叶片基因组DNA电泳结果如图2中5飞泳道所示，点样孔较干净，说明方法IV中用SET多次洗涤对于去除多糖效果明显。同时，也可以明显看出，方法珊提取的DNA电泳条带亮度较弱，说明有SET多次洗涤时，也造成了 DNA的大量丢失。5飞泳道对应DNA的0D26Q/0D28Q分别为1. 82和1. 84，表明提取的DNA中没有蛋白质或其他物质的污染，符合分子生物学研究所要求的质量标准，说明改造后的方法较为适合提取富含多糖的白桦叶片基因组DNA。3. 3方法VDI的提取的DNA的酶切验证为了进一步验证图2中5、6泳道对应的方法提取的DNA的质量，进行了 EcoR和MseI单酶切和双酶切实验，酶切后电泳结果如图3所示。结果表明，不论是单酶切还是双酶切，酶切后的DNA均呈弥散状，酶切效果较好，说明DNA纯度较高，完全可以进行后续的分子生的学操作。3. 4方法VDI的提取的DNA的RAPD扩增验证以方法VI提取不同纤维长度的白桦个体叶片基因组DNA材料，用筛选出的多态性高的引物进行扩增分析，扩增产物电泳结果如图4，结果表明，不同纤维长度个体扩增结果均较好，说明提取的DNA分子完全可来进行分子标记等分子生物实验研究。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1. 一种白桦叶片基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，加入300μ L改良STE溶液，300 μ L改良CTAB 溶液和20 μ Li3 —巯基乙醇，混合后震荡3min ;改良CTAB溶液配方2. 5 % (W/V) CTAB， 150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol/L NaCl ;改良 SET 溶液配方150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol/L NaCl ；②常温5000g离心5min，弃上清；向沉淀中加入加600μ L改良CTAB溶液和20 μ L β — 巯基乙醇70°C水浴15min后16060g离心5min ；③取上清加入等体积氯仿充分混勻，16060g离心5min,重复此步骤1 2次；④取上清加入等体积的无水乙醇异丙醇混合液,无水乙醇异丙醇的体积比为2:1， 上下颠倒混合均匀后常温下静置3min，6080g离心3min ；⑤倒掉上清液，用70%预冷的乙醇洗涤2 3次，干燥后溶于50μ L TE或去离子水中；⑥电泳检测DNA的完整性，Α260/280测定DNA浓度和纯度。
全文摘要
本发明公开了一种白桦叶片基因组DNA提取方法，改良了CTAB与STE溶液；采用常温下等体积的改良CTAB溶液和STE溶液洗涤充分研磨的材料2次；水浴裂解温度由65℃提高至70℃；在沉淀DNA时，采用无水乙醇:异丙醇(体积比为2:1)混合沉淀剂，低速离心，以降低杂质的沉淀。这种方法能分离出高质量的白桦叶片基因组DNA。
文档编号C12N15/10GK103013985SQ20131001627
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者魏志刚, 杨传平, 张力杰, 曲赞霜, 候聪 申请人:东北林业大学