专利名称：与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记SIsv0372的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，具体地，涉及一种与谷子抗除草 剂基因紧密连锁的分子标记。本发明还涉及该分子标记的引物、该分子标记在谷子抗除草 剂基因定位或谷子遗传育种中的用途、一种谷子抗除草剂基因定位方法、以及一种谷子育 种方法。
背景技术：
谷子(Setaria italica L. Beauv.)是起源于我国的重要粮食作物，主要在我国的 北方种植，在国家粮食生产和粮食安全中占有较为重要的地位。谷子是二倍体自花授粉作 物，其基因组较小，约470Mb，这些特性使其很适合作为基因组研究的对象。利用除草剂除草己成为当今农田有效地控制杂草、提高农作物产量与质量的一项 重要措施。然而，由于谷田杂草种类多，数量大，目前生产上又缺乏抗除草剂的品种，谷田不 能施用广谱除草剂除草，这成为障碍谷子生产的一大难题。目前，遗传连锁图谱的构建已成为基因定位、图位克隆以及基因组结构与功能研 究的重要基础。而分子标记又是构建遗传连锁图谱的基础。因此，迫切需要发现与谷子抗 除草剂基因紧密连锁的分子标记。
发明内容
本发明人依据全基因组序列，经过大量的实验和不懈的努力，提供了一种与谷子 (Setaria italica L. Beauv.)抗除草剂基因紧密连锁的分子标记SIsv0372，并由此提供了 下述发明本发明的一个方面涉及一种与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记SIsv 0372，其核苷酸序列如seq id no :1所示。其中加边框部分为引物设计区段703bpIctcaatcataggagcctggt] cattgattacgagggtattatgaggcttcatatttacttagcag
tcgagttgtgacactaagtacttgattattaacaaatagccgcctacttaatttgtccttagaggcgttttcttcca ttgacttatttttagcacgtgtcatatcgaatgtttagatactaattaggagtattaaacgtagactatttagaaaa cccattacataagtggaggctaaatggcgagacgaatctattaagcctaattaagcctaattaatttatcattagca aatgtttactgtaaatagtctacatttaatactcctaattaatatctaaatattcgatgtgatgggtgctaaaaata agtcagtggaagaaaacggggtcgaatgttgagtgcacatattgctatagtcctgtttttttttaaaaaaaatatca gaagtggcgtggcagtggagactcggtgtctcatgtgtcagacatcggccatctaaaactttcaagagatcagggct gtaaaattataaaatatgtacatgtttacattatcatctcacatctatctctatttgtacagaggacccccagtact gacgctgacgtaaagattatgcatttatgcattgcaaaagatttgttcaagctttcctctaaaaaaaagagagagtt
gtt Ictagctctgccactgatgt^ (seq idno :i)在本发明中，术语“与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记”是指这样的分子标记，在遗传连锁图谱中，该分子标记与谷子抗除草剂基因的遗传连锁距离小于2cM或者小 于3cM ；或者在谷子的大于400个样本中，抗拿捕净型或部分抗拿捕净型的样本中含有该分 子标记。抗拿捕净型或部分抗拿捕净型的确定参见后文中的描述。在本发明中，具体地，所述除草剂为拿捕净。拿捕净是一种选择性强的内吸传导型 茎叶处理剂，能被禾本科杂草的茎叶迅速吸收，并传导到顶端和节间分生组织，使其细胞分 裂遭到破坏。拿捕净在禾本科与双子叶植物间选择性很高，对阔叶作物安全，广泛应用于 除去稗草、野燕麦、狗尾草、马唐、牛筋草、看麦娘、野黍、臂形草、黑麦草、稷属、旱雀麦、狗牙 根、芦苇、冰草、假高粱、白茅等禾本科杂草。本发明的还一方面涉及本发明的分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示SIsv0372F CTCAATCATAGGAGCCTGGT(SEQ ID NO 2)SIsv0372R CACATCAGTGGCAGAGCTAG(SEQ ID NO 3)。本发明的分子标记也可以为含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA片段；该 DNA片段的长度为适当长度，但并不特别限定，例如，小于10，OOObp、小于5，OOObp、小于 2，OOObp、小于 1，500bp、小于 1，200bp、小于 1，OOObp、或者小于 800bp。在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列 的DNA片段)为谷子基因组中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SEQ ID NO 1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因组中的序列，优选地，为谷 子基因组中SEQID NO :1的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解， 只要扩增或者检测谷子基因组DNA中的该分子标记，必然能够检测或扩增得到含有SEQ ID N0:1所示的序列。SEQ ID NO :1的5，端和/或3，端的上下游序列的长度为适当长度，并 不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10，OOObp、小于5，OOObp、小于2，OOObp、小于 1，500bp、小于 1，200bp、小于 1，OOObp、或者小于 800bp。在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列 的DNA片段)所包含的SEQ ID NO 1的5，端和/或3，端可操作地连接有人工序列和/或 控制序列，例如启动子、增强子、终止子、酶切位点、引物序列等等。其中，术语“可操作地” 在本发明中定义为一种如下构象，在该构象中，控制序列例如启动子被适当地置于SEQ ID NO 1的一个位置上，以致该控制序列指导SEQ ID NO 1编码的多肽的产生。本发明的另一方面涉及一种重组载体，其含有本发明的分子标记。所述重组载体 可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。本发明的还一方面涉及一种重 组细胞，其含有该重组载体。本发明的还一方面涉及本发明的分子标记的制备方法，包括下述步骤使用抗拿 捕净型的谷子的基因组DNA作为模板，以上述引物进行PCR扩增，得到的扩增产物即含有所 述分子标记；优选地，还包括将PCR扩增产物进行纯化的步骤。在本发明的一个实施方案 中，所述抗拿捕净型的谷子为张谷1号、张杂谷3号、或张杂谷3号自交产生的F2代中的抗 拿捕净型。对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的分 子标记。本发明的还一方面涉及所述分子标记的检测方法，包括下述步骤
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(1)根据本发明的分子标记的核苷酸序列设计引物；(2)以被检测谷子的基因组DNA作为模板进行扩增；(3)判断扩增产物中是否存在该分子标记。例如，可以以被检测谷子的基因组DNA为模板，以上述引物(SEQID NO :2和SEQ ID NO 3)进行PCR扩增，得到扩增产物。可以将得到的扩增产物进行测序或者凝胶电泳。本发明的还一方面涉及本发明的分子标记在谷子抗除草剂基因定位或检测中的 用途。本发明的还一方面涉及一种谷子抗除草剂基因定位的方法，包括使用本发明的分 子标记的步骤。本发明的还一方面涉及本发明的分子标记在谷子辅助育种中的用途。本发明的还一方面涉及一种谷子辅助育种方法，包括检测本发明的分子标记的步
马聚ο本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理 解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选谷子是否抗除草剂(例如，可以参考， DNA分子标记在小麦抗病育种中的用途，陇东学院学报(自然科学版)，2006年4月第16卷 第1期，P65-69)。检测出具有本发明的分子标记的为抗拿捕净型或部分抗拿捕净型，不具 有该分子标记的为不抗拿捕净型。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述 的本发明的分子标记引物。所述检测还可以通过测序方法进行。该谷子辅助育种方法具有 简便、快速、高通量的优点。在本发明中，具体地，所述谷子可以为张谷1号、谷子A2不育系、张杂谷3号、或张 杂谷3号自交产生的F2代。其中，张谷1号、或张杂谷3号自交产生的部分F2代(芽苗叶 片正常)为抗拿捕净型；张杂谷3号、或张杂谷3号自交产生的部分F2代(芽苗叶片褪色) 为部分抗拿捕净型；谷子A2不育系、张杂谷3号自交产生的部分F2代(芽苗叶片枯死)， 为不抗拿捕净型。上述抗拿捕净型、部分抗拿捕净型、不抗拿捕净型是通过下述方法确定的配置4L 15g/L的Agar powder (琼脂粉)培养基水溶液，灭菌锅灭菌溶化。待 其温度冷却至50°C左右加入6ml的拿捕净(购自阿拉丁试剂(中国)有限公司，货号 1113709)，倒平皿，培养基厚度约0. 8cm左右。培养基冷却后，撒F2代种子于培养基中，置 于光培室中培养3天，统计芽苗叶片情况是正常，褪色，还是枯死。其中，芽苗叶片正常的为 抗拿捕净型，褪色的为部分抗拿捕净型，枯死的为不抗拿捕净型。发明的有益效果本发明提供了与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记，并将谷子基因组DNA与 谷子抗除草剂基因联系起来，更有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立；所述分子标记 与抗除草剂基因的遗传紧密连锁距离为1.6cM。本发明的分子标记可以简便、快速、高通量 地应用于谷子辅助育种。
图1 分子标记引物(SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3)对F2代480个单株扩增的部
分结果。其中
泳道1-12为F2代中12株抗拿捕净型和部分抗拿捕净型的单株的PCR扩增产物； 泳道14-25为F2代中12株不抗拿捕净型的单株的PCR扩增产物。泳道13为ma rker, 其为 200bp DNA Ladder ；其分子量包括:4000bp、3000bp、2500bp、2000bp、1800bp、1600bp、 1400bp、1200bp、1000bp、800bp、600bp、400bp、W& 200bp。结果显示抗拿捕净型和部分抗 拿捕净型的植株中条带大小为703bp，不抗拿捕净型的植株中条带大小小于703bp。关于生物材料保藏的说明本发明涉及以下生物材料1.张谷1号种子，其于2010年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏编号为CCTCC NO :P201012，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心， 430072。2.谷子A2不育系种子，其于2010年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO :P201013，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保 藏中心，430072。3.张杂谷3号种子，其于2010年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO :P201010，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保 藏中心，430072。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。实施例1 谷子F2代分离群体的构建父本为张谷1号抗拿捕净型(株型高，株高为150cm左右)，旗叶长而窄，刚毛红 色，颖壳红色，可育，叶色偏绿。母本为A2不育系不抗拿捕净型(株型矮，株高为IOOcm左右)，旗叶短而宽，刚 毛绿色，颖壳绿色，部分不育，叶色偏黄。父本和母本杂交得到Fl (张杂谷3号，部分抗拿捕净型，株高为130cm左右)。Fl代自交产生F2代群体，共得到480个单株。对480个F2代个体按照前述确定 抗拿捕净类型的方法进行抗拿捕净性状分析，发现抗拿捕净型和部分抗拿捕净型共360株 (其中抗拿捕净型120株，部分抗拿捕净型240株)，不抗拿捕净型120株。实施例2 父母本以及Fl代、F2代个体基因组DNA的提取用CTAB法分别提取实施例1中的父母本、Fl代、以及480个F2代个体的基因组 DNA,具体方法如下(1)称取1. Og新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mll. 5XCTAB，研磨成 勻浆转入15ml的离心管中，然后往研钵中加入Iml 1. 5 X CTAB冲洗再转入离心管中。混勻 后于65°C水浴30分钟，期间不时缓慢摇勻。其中1. 5XCTAB 配方如下(IL)CTAB15g
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IMTris. Cl (pH 为 8. 0)75ml0. 5M EDTA30mlNaCl61. 4g加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0. 2% (2ml)的巯基乙醇。(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24 :1)，轻轻混勻，至下层液变为深 绿色。(3) 4200rpm离心10分钟，将上层水相移到新的15ml离心管，加2倍体积预冷的无 水乙醇，混合静止5分钟。于-20°C放置30分钟沉淀DNA。(4) 4200rpm离心10分钟，弃掉上清，加入Iml 75%乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心 管干燥DNA，加入200 μ 1 TE溶解DNA。(5)用0. 8%的琼脂糖凝胶检测基因组DNA。(6)将得到的父母本以及Fl代、F2代个体的基因组DNA存于_20°C备用。实施例3 分子标记的制备以实施例2中提取的父本、Fl代、或F2代中的抗拿捕净型或部分抗拿捕净型的基 因组DNA为模板，以分子标记引物(SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3)进行PCR扩增。PCR反应体系如下无菌水20. 2 μ 1IO^Buffer (含 Mg2+)2. 5 μ 1dNTPs (25mM)0. 15μ 1Taq 酶(5υ/μ1)0. 15 μ 1正向引物0·5μ1反向引物0·5μ1模板Ι.ΟμΙ总体积25 μ 1PCR反应程序如下94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸40秒，运行35个循 环；最后72°C延伸3分钟。P°C R扩增产物可以在4°C保存。将扩增产物纯化，得到分子标记。纯化后进行测序，结果如SEQ IDNO :1所示。对本领域技术人员而言，可以理解，也可以通过DNA化学合成的方法得到该分子 标记。实施例4 分子标记引物的初步筛选对父本进行de novo 测序(60X contig N50 :22K, scaffold N50 :320K ；Total size :400Mb)，母本重测序(10X)。根据父母本测序数据，利用SOAP软件(例如S0AP2. 20，可以从http ://soap. genomics, org. cn/下载，也可以使用其它的序列比对软件)比较父母本之间的序列差异， 然后基于差异的序列，在父本5’端和3’端外侧约50bp位置，随机选取20bp左右的长度， 用primerpremier软件随机设计引物，一共设计了 1105对引物，下面的表1中示出了其中 的部分引物的序列(SEQ ID N0:2-41)。表1 :1105对随机引物中的部分引物
权利要求
一种与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；或者其为含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA片段。
2.一种重组载体，其含有权利要求1所述的分子标记。
3.—种重组细胞，其含有权利要求2所述的重组载体。
4.权利要求1所述的分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO :2和SEQ ID NO 3 所示。
5.权利要求1所述的分子标记的制备方法，包括下述步骤使用抗拿捕净型或部分抗拿捕净型的谷子的基因组DNA作为模板，以权利要求4所述 的引物进行PCR扩增；优选地，还包括将PCR扩增的产物进行纯化的步骤；具体地，所述抗 拿捕净型的谷子为张谷1号或张杂谷3号自交产生的F2代中的抗拿捕净型；所述部分抗拿 捕净型的谷子为张杂谷3号或张杂谷3号自交产生的F2代中的部分抗拿捕净型。
6.权利要求1所述的分子标记的检测方法，包括下述步骤(1)根据权利要求1的分子标记的核苷酸序列设计引物；(2)以被检测谷子的基因组DNA作为模板进行扩增；(3)判断扩增产物中是否存在该分子标记。
7.权利要求1所述的分子标记在谷子抗除草剂基因定位或检测中的用途。
8.一种谷子抗除草剂基因定位的方法，包括使用权利要求1所述的分子标记的步骤。
9.权利要求1所述的分子标记在谷子辅助育种中的用途。
10.一种谷子辅助育种方法，包括检测权利要求1所述的分子标记的步骤。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，具体地，涉及一种与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记，其核苷酸序列如SEQID NO1所示，或者其为谷子基因组中含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA片段。本发明还涉及该分子标记的引物、该分子标记在谷子抗除草剂基因定位或谷子遗传育种中的用途、一种谷子抗除草剂基因定位方法、以及一种谷子育种方法。本发明发现了与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记SIsv 0372，将谷子基因组DNA序列与谷子抗除草剂基因联系起来，更有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立。
文档编号C12N15/63GK101974521SQ20101055337
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者倪雪梅, 全志武, 夏秋菊, 张耕耘 申请人:深圳华大基因科技有限公司